UNIVERSITETET I LINKÖPING
Proteinkemi
Kemiavdelningen
2012-11-04
Rening av Fatty acid binding protein (FABP) från
ökenmyran Cataglyphis fortis
Det protein som ska renas är, fatty acid binding protein, FABP. FABP finns tillsammans med
tusentals andra proteiner i en cytoplasmalösning.
Vad FABP har varit med om innan du får det av lab.assistenten.
FABP, från ökenmyran Cataglyphis fortis eller lägesspecifikt muterad FABP produceras med
hjälp av E. coli bakterier. Dessa bakterier innehåller en plasmid, där genen för FABP är insatt.
Denna plasmid är också en expressionsvektor, vilket gör att man kan slå på transkriptionen av
FABP genen med en inducer. En repressormolekyl är till en början bunden till
operatorregionen vid lac-promotorn. Då en inducer (IPTG; isopropyl--Dtiogalaktopyranosid) tillsätts binder den till repressorn, som därmed lossnar från
operatorgenen, vilket leder till att RNA-polymeraset kan påbörja transkriptionen av T7 RNApolymeras. T7 RNA-polymeras binder hårt till T7 promotorn, vilket leder till effektiv
transkription av FABP. Plasmiden innehåller också en gen, som kodar för antibiotikaresistens.
Detta leder till att man kan skilja på bakterier, som har denna plasmid från dem som saknar
denna, genom att tillsätta antibiotika till odlingsmediet. På detta sätt kommer endast de
bakterier som innehåller plasmiden att växa. Kanamycin är det antibiotikum som plasmiden
ger upphov till resistens mot, varför Kanamycin hela tiden bör finnas med i odlingsmediet.
Det producerade FABP hamnar i E. coli bakteriernas cytoplasma. Detta innebär att man måste
förstöra bakteriernas cellväggar, för att komma åt FABP. Detta görs med hjälp av sonikering
dvs sönderbrytning av cellmembranet med hjälp av ultraljud.
När cellväggen är sprängd separeras den från cytoplasman genom centrifugering, så att man
får en lösning endast innehållande cytoplasman. I cytoplasman finns nu FABP tillsammans
med c:a 2000 andra proteiner.
Här fortsätter labhandledningenGenom att använda en His-Tag specifik reningsmetod kan man separera FABP från alla de
andra proteinerna i ett enda reningssteg (His-Tag kromatografi).
Uttryck av det klonade och muterade proteinet kan kontrolleras med SDS-PAGE. Tag därför
ut prover under olika skeden i reningsprocessen för analys vid SDS-PAGE-laborationen.
Spara härför 50µl lösning i eppendorfrör i frys till analysen. Ni får själva välja hur många
prov och efter vilka moment som lösning skall sparas.
Diskutera gärna när dessa prover ska tas ut med laborationshandledaren.
Affinitetskromatografi - Qiagen Ni-NTA Kromatografi
Lösningar:
Resuspensionbuffert
20 mM Tris-HCl pH 8
150 mM NaCl
5 mM Imidazole
Tvättbuffert
20 mM Tris-HCl pH 8
150 mM NaCl
20 mM Imidazole
Elueringsbuffert A
20 mM Tris-HCl pH 8
150 mM NaCl
250 mM Imidazole
Elueringsbuffert B
20 mM Tris-HCl pH 8
150 mM NaCl
500 mM Imidazole
Dialysbuffert
20 mM Tris-HCl pH 8
250 mM NaCl
5% glycerol
Utförande
Ekvilibrera kolonnen med 10 ml dest-H2O och sedan 10 ml resuspensionsbuffert
Applicera provet (1-35 ml). Flödet bör vara 1 ml/min. Samla upp genomflödet i en
bägare.
Tvätta med 4 ml tvättbuffert. Samla upp genomflödet i en bägare.
Eluera med 3 ml elueringsbuffert A. Samla upp i fraktioner (Eppendorfrör, 1 ml i varje
fraktion)
Applicera 3 ml elueringsbuffert B. Samla upp i fraktioner
Poola ihop fraktionerna med FABP och dialysera mot 3 * 5 l dialysbuffert. Låt varje
dialyssteg stå i minst 6 timmar.
Bestäm koncentrationen av FABP och snabbfrys proteiner i lämpliga alikvoter.
Koncentrera proteinlösningen vid behov. Lämplig slutkonc ca 1 mg/ml.
Efter användning av kolonnen: Tvätta kolonnen med 30 ml 0.5 m NaOH och därefter
15 ml dest-H2O. Förvara i 30 % etanol.
SDS-Polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)
Efter att FABP renats fram med affinitetskromatografi, skall renheten studeras med hjälp av
SDS-PAGE. Dessutom ska renhet och uttryck av FABP studeras på prover som tagits undan
efter olika moment under produktionsprocessen. Det är den vanligast förekommande metoden
för att följa en upprening av ett protein och avgöra hur rent proteinet är. Denna metod
separerar proteiner beroende på deras storlek. Genom att SDS (sodium dodecylsulfate), som
är negativt laddat, sätts till provet får proteinerna en negativ laddning, som är direkt
proportionell mot proteinets storlek. Detta sker genom att SDS binder till proteinet.
Polyakrylamidgelen består av ett nätverk som proteinerna måste vandra igenom. Nätverkets
storlek beror på proportionerna av akrylamid och bis-akrylamid. Dessa proportioner väljs så
att de proteiner man vill studera separerar från varandra på gelen. Man inkluderar också ett
antal referensproteiner med känd molekylvikt i sin analys. Dessa körs separat på samma gel,
så att man utifrån dessa kan uppskatta sitt eget provs molekylvikt. Genom att avsätta
logaritmen för molekylvikten hos referensproteinerna mot vandringslängden erhålls en rät
linje. Det är sen enkelt att uppskatta molekylvikten hos provet genom att använda
referensgrafen.
UTFÖRANDE
OBS! För detta moment används färdigpolymeriserade gelplattor som erhålls av
labhandledaren.
Lösningar:
Elektrodbuffert
25 mM Tris
0,2 M Glycin
0,1 % SDS
Laddningsbuffert
84 mM Tris-HCl
35 % Glycerol
2,8 % SDS
20 µM bromfenolblått
Provberedning:
Prov: Lämplig provmängd att applicera är c:a 10 g protein, maximal volym i en provbrunn
är c:a 35 l. Räkna först ut vilken volym prov som skall användas. Provet blandas sen med
1/5 laddningsbuffert. Blandningen upphettas i kokande vatten i 2-3 min. Sedan appliceras
provet i provbrunnarna.
Referens: 5 l färdigblandad referenslösning. Behandlas som ovan.
Elektrofores:
Koppla ihop ihop gelkassetterna med elektroforesvannan. Använd 850 ml elektrodbuffert och
häll den i elektroforesvannan (i det ”inre” och ”yttre” utrymmet).
Kör gelen vid 200 V. Avbryt körningen när det blåa bandet har vandrat till slutet på gelen.
Fixering, färgning och avfärgning:
1. Ta försiktigt ut gelen från glasplattorna.
2. Placera gelen i vatten så att den är väl täckt.
3. Värm i mikrovågsugnen så att vattnet nästan kokar. Gelen riskerar att förstöras om den
får koka. Ta ungefär så mycket vatten att det tar ungefär 40 s att värma det.
4. Häll av vattnet utan att hälla ut gelen.
5. Repetera steg 2-4 ytterligare tre gånger
6. Häll Safestain över gelen så att den precis täcks. Värm i mikrovågsugnen tills det
nästan kokar.
7. Färga in i 30 min
8. Avfärga i vatten. För snabbare avfärgning ha även med en pappersservett.
Fotografering av gelen:
Fotografera gelen vid lämpligt tillfälle. Riskerar det att dra ut på tiden förvara gelen i 20 %
(v/v) etanol.
