UNIVERSITETET I LINKÖPING
Proteinkemi
Kemiavdelningen
2011-02-04
Expression, produktion och rening av Fatty acid
binding protein (FABP) från ökenmyran
Cataglyphis fortis
Produktion av FABP i E. coli bakterier
1. Introduktion
I detta laborationsmoment skall ett protein, fatty acid binding protein, FABP, från ökenmyran
Cataglyphis fortis eller lägesspecifikt muterad FABP produceras med hjälp av E. coli
bakterier. Dessa bakterier innehåller en plasmid, där genen för FABP är insatt. Denna plasmid
är också en expressionsvektor, vilket gör att man kan slå på transkriptionen av FABP genen
med en inducer. En repressormolekyl är till en början bunden till operatorregionen vid lacpromotorn. Då en inducer (IPTG; isopropyl--D-tiogalaktopyranosid) tillsätts binder den till
repressorn, som därmed lossnar från operatorgenen, vilket leder till att RNA-polymeraset kan
påbörja transkriptionen av T7 RNA-polymeras. T7 RNA-polymeras binder hårt till T7
promotorn, vilket leder till effektiv transkription av FABP. Plasmiden innehåller också en
gen, som kodar för antibiotikaresistens. Detta leder till att man kan skilja på bakterier, som
har denna plasmid från dem som saknar denna, genom att tillsätta antibiotika till
odlingsmediet. På detta sätt kommer endast de bakterier som innehåller plasmiden att växa.
Kanamycin är det antibiotikum som plasmiden ger upphov till resistens mot, varför
Kanamycin hela tiden bör finnas med i odlingsmediet.
Det producerade FABP hamnar i E. coli bakteriernas cytoplasma. Detta innebär att man måste
förstöra bakteriernas cellväggar, för att komma åt FABP. Detta görs med hjälp av sonikering
dvs bryta sönder cellmembranet med hjälp av ultraljud.
När cellväggen är sprängd separeras den från cytoplasman genom centrifugering, så att man
får en lösning endast innehållande cytoplasman. I cytoplasman finns nu FABP tillsammans
med c:a 2000 andra proteiner. Genom att använda en His-Tag specifik reningsmetod kan man
separera FABP från alla de andra proteinerna i ett enda reningssteg (His-Tag kromatografi).
Uttryck av det klonade och muterade proteinet kan kontrolleras med SDS-PAGE. Tag därför
ut prover under olika skeden i produktions- och reningsprocessen för analys vid SDS-PAGElaborationen. Spara härför 50µl lösning i eppendorfrör i frys till analysen. Ni får själva välja
hur många prov och efter vilka moment som lösning skall sparas.
Diskutera gärna dessa prover med laborationshandledaren.
Utförande
Provberedning
Lösningar:
LB-Medium
20g/l Trypticase (Peptone)
20 g/l NaCl
10 g/l Yeast Extract
Kanamycinstam (30 mg/ml) 10 ml
Tag 300 mg Kanamycin och lös i 10 ml dest-H2O. Sterilfiltrera lösningen genom att trycka
lösningen genom ett sterilfilter ned i sterila Eppendorfrör ~1.5 ml i varje rör. Stammen
förvaras i frys och tinas inför användning i rumstemperatur.
IPTGstam (0.5 M ) 10 ml
Väg in 1.19 g IPTG och lös i 10 ml Dest H2O. Sterilfiltrera lösningen genom att trycka
lösningen genom ett sterilfilter ned i sterila Eppendorfrör ~1.5 ml i varje rör. Stammen
förvaras i frys och tinas inför användning i rumstemperatur.
Autoklavering
Autoklavera följande material:
1,95 l LB i 5 l E-kolv med magnetloppa
50 ml i 250 ml E-kolv med magnetloppa
Pipettspetsar
LB-mediet ska autoklaveras och autoklaveringstiden räknas ut med hjälp av tabellen som
finns i Autoklaveringsrummet.
Ympning av bakterier till övernattsodling:
Efter autoklaveringen när lösningen har svalnat till 37C tillsätts 30 g/ml kanamycin
(1000ggr spädning) till övernattsodlingskolven (250 ml kolv) innehållande 50 ml LBmedium.
Plocka ungefär 5 kolonier från plattan och tillsätt till LB-mediumet.
Ställ sedan odlingen på tillväxt under omrörning vid 37 C över natt.
Tillväxt av bakterier i stor odling:
Tillsätts 30 g/ml Kanamycin (1000ggr spädning) till stora odlingskolven (5 l kolv)
innehållande 1,95 l LB-medium.
Överför allt från Ö/N odling (50 ml) till den stora 1,95-liters LB-lösningen
Ställ sedan den stora odlingen på omrörning för tillväxt i 37 C.
Följ sedan tillväxten genom att mäta absorbansen vid 600 nm som speglar celltätheten. Detta
görs genom att suga upp LB-medium (~1ml) med en steril pipett. Mät i plastkuvetter, använd
dest-H2O som referens.
Induktion av protein produktion
När absorbansen är c:a 0,8 tillsätts 2 ml av inducern, IPTG, för att inducera produktionen av
Fatty acid binding protein (FABP) i E. coli bakterierna. Efter denna tillsatts får odlingen pågå
i rumstemperatur under natten.
Skördning
Odlingen avbryts efter 12-16 timmar. Bakterielösningen centrifugeras vid 3000 rpm i 40 min
(4 C) i stora centrifugflaskor. På så vis kan man separera bakteriecellerna från odlingsmediet.
Supernatanten hälls försiktigt tillbaka i kolven och autoklaveras därefter innan det kastas.
Pelleten bestående av bakterier slammas upp i en liten volym (max. 30 ml)
resuspensionbuffert (se nedan).
Sonikering (ultaljudbehandling):
Sonikering används ofta för att bryta sönder cellmembraner, varvid ultraljud (typiskt 20-50
kHz) genereras elektroniskt och den mekaniska energin överförs till provet via en metallprob
som oscillerar med hög frekvens och som ger upphov till begränsade områden med högt
tryck. Detta leder till kavitering och sammanpressning i lösningen, vilket till sist gör att celler
bryts upp och proteininnehållet kommer ut i lösningen.
Sonikering sker vid 40 % amplitud i 6*10 sek med 10 sek mellanrum på ett prov på max 30
ml. Provet förvaras på is under behandlingen och resten av reningen.
Separera cellresterna från proteinlösningen genom att centrifugera vid 10 000*g i 40 min vid
4 C. Spara supernatanten.
Ta undan hälften av supernatanten och fortsätt med resten.
Affinitetskromatografi - Qiagen Ni-NTA Kromatografi
Elueringsbuffert B
Lösningar:
Resuspensionbuffert
20 mM Tris-HCl pH 8
20 mM Tris-HCl pH 8
150 mM NaCl
150 mM NaCl
500 mM Imidazole
5 mM Imidazole
Dialysbuffert
Tvättbuffert
20 mM Tris-HCl pH 8
20 mM Tris-HCl pH 8
250 mM NaCl
150 mM NaCl
5% glycerol
20 mM Imidazole
Elueringsbuffert A
20 mM Tris-HCl pH 8
150 mM NaCl
250 mM Imidazole
Utförande
Ekvilibrera kolonnen med 10 ml dest-H2O och sedan 10 ml resuspensionsbuffert
Applicera provet (1-35 ml). Flödet bör vara 1 ml/min. Samla upp genomflödet i en
bägare.
Tvätta med 4 ml tvättbuffert. Samla upp genomflödet i en bägare.
Eluera med 3 ml elueringsbuffert A. Samla upp i fraktioner (Eppendorfrör, 1 ml i varje
fraktion)
Applicera 3 ml elueringsbuffert B. Samla upp i fraktioner
Poola ihop fraktionerna med FABP och dialysera mot 3 * 5 l dialysbuffert. Låt varje
dialyssteg stå i minst 6 timmar.
Bestäm koncentrationen av FABP och snabbfrys proteinet (flytande kväve) i lämpliga
alikvoter.
Efter användning av kolonnen: Tvätta kolonnen med 30 ml 0,5 M NaOH och därefter
15 ml dest-H2O. Förvara i 30 % etanol.
SDS-Polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)
Efter att FABP renats fram med affinitetskromatografi, skall renheten studeras med hjälp av
SDS-PAGE. Dessutom ska renhet och uttryck av FABP studeras på prover som tagits undan
efter olika moment under produktionsprocessen. Det är den vanligast förekommande metoden
för att följa en upprening av ett protein och avgöra hur rent proteinet är. Denna metod
separerar proteiner beroende på deras storlek. Genom att SDS (sodium dodecylsulfate), som
är negativt laddat, sätts till provet får proteinerna en negativ laddning, som är direkt
proportionell mot proteinets storlek. Detta sker genom att SDS binder till proteinet.
Polyakrylamidgelen består av ett nätverk som proteinerna måste vandra igenom. Nätverkets
storlek beror på proportionerna av akrylamid och bis-akrylamid. Dessa proportioner väljs så
att de proteiner man vill studera separerar från varandra på gelen. Man inkluderar också ett
antal referensproteiner med känd molekylvikt i sin analys. Dessa körs separat på samma gel,
så att man utifrån dessa kan uppskatta sitt eget provs molekylvikt. Genom att avsätta
logaritmen för molekylvikten hos referensproteinerna mot vandringslängden erhålls en rät
linje. Det är sen enkelt att uppskatta molekylvikten hos provet genom att använda
referensgrafen.
UTFÖRANDE
OBS! För detta moment används färdigpolymeriserade gelplattor som erhålls av
labhandledaren.
Lösningar:
Elektrodbuffert
25 mM Tris
0,2 M Glycin
0,1 % SDS
Laddningsbuffert
84 mM Tris-HCl
35 % Glycerol
2,8 % SDS
20 µM bromfenolblått
Provberedning:
Prov: Lämplig provmängd att applicera är c:a 10 g protein, maximal volym i en provbrunn
är c:a 35 l. Räkna först ut vilken volym prov som skall användas. Provet blandas sen med
1/5 laddningsbuffert. Blandningen upphettas i kokande vatten i 2-3 min. Sedan appliceras
provet i provbrunnarna.
Referens: 5 l färdigblandad referenslösning. Behandlas som ovan.
Elektrofores:
Koppla ihop ihop gelkassetterna med elektroforesvannan. Använd 850 ml elektrodbuffert och
häll den i elektroforesvannan (i det ”inre” och ”yttre” utrymmet).
Kör gelen vid 200 V. Avbryt körningen när det blåa bandet har vandrat till slutet på gelen.
Fixering, färgning och avfärgning:
1. Ta försiktigt ut gelen från glasplattorna.
2. Placera gelen i vatten så att den är väl täckt.
3. Värm i mikrovågsugnen så att vattnet nästan kokar. Gelen riskerar att förstöras om den
får koka. Ta ungefär så mycket vatten att det tar ungefär 40 s att värma det.
4. Häll av vattnet utan att hälla ut gelen.
5. Repetera steg 2-4 ytterligare tre gånger
6. Häll Safestain över gelen så att den precis täcks. Värm i mikrovågsugnen tills det
nästan kokar.
7. Färga in i 30 min
8. Avfärga i vatten. För snabbare avfärgning ha även med en pappersservett.
Fotografering av gelen:
Fotografera gelen vid lämpligt tillfälle. Riskerar det att dra ut på tiden förvara gelen i 20 %
(v/v) etanol.
