UNIVERSITETET I LINKÖPING
Proteinkemi
Kemiavdelningen
2011-02-04
Expression, produktion och rening av Fatty acid
binding protein (FABP) från ökenmyran
Cataglyphis fortis
Produktion av FABP i E. coli bakterier
1. Introduktion
I detta laborationsmoment skall ett protein, fatty acid binding protein, FABP, från ökenmyran
Cataglyphis fortis eller lägesspecifikt muterad FABP produceras med hjälp av E. coli
bakterier. Dessa bakterier innehåller en plasmid, där genen för FABP är insatt. Denna plasmid
är också en expressionsvektor, vilket gör att man kan slå på transkriptionen av FABP genen
med en inducer. En repressormolekyl är till en början bunden till operatorregionen vid lacpromotorn. Då en inducer (IPTG; isopropyl--D-tiogalaktopyranosid) tillsätts binder den till
repressorn, som därmed lossnar från operatorgenen, vilket leder till att RNA-polymeraset kan
påbörja transkriptionen av T7 RNA-polymeras. T7 RNA-polymeras binder hårt till T7
promotorn, vilket leder till effektiv transkription av FABP. Plasmiden innehåller också en
gen, som kodar för antibiotikaresistens. Detta leder till att man kan skilja på bakterier, som
har denna plasmid från dem som saknar denna, genom att tillsätta antibiotika till
odlingsmediet. På detta sätt kommer endast de bakterier som innehåller plasmiden att växa.
Kanamycin är det antibiotikum som plasmiden ger upphov till resistens mot, varför
Kanamycin hela tiden bör finnas med i odlingsmediet.
Det producerade FABP hamnar i E. coli bakteriernas cytoplasma. Detta innebär att man måste
förstöra bakteriernas cellväggar, för att komma åt FABP. Detta görs med hjälp av sonikering
dvs bryta sönder cellmembranet med hjälp av ultraljud.
När cellväggen är sprängd separeras den från cytoplasman genom centrifugering, så att man
får en lösning endast innehållande cytoplasman. I cytoplasman finns nu FABP tillsammans
med c:a 2000 andra proteiner. Genom att använda en His-Tag specifik reningsmetod kan man
separera FABP från alla de andra proteinerna i ett enda reningssteg (His-Tag kromatografi).
Uttryck av det klonade och muterade proteinet kan kontrolleras med SDSPAGE. Tag därför ut prover under olika skeden i produktions- och
reningsprocessen för analys vid SDS-PAGE-laborationen. Spara härför 50µl
lösning i eppendorfrör i frys till analysen. Ni får själva välja hur många prov
och efter vilka moment som lösning skall sparas.
Diskutera gärna dessa prover med laborationshandledaren.
Utförande
Provberedning
Gör iordning följande lösningar:
LB-Medium
20g/l Trypticase (Peptone)
20 g/l NaCl
10 g/l Yeast Extract
Kanamycinstam (30 mg/ml) 10 ml
Tag 300 mg Kanamycin och lös i 10 ml dest-H2O. Sterilfiltrera lösningen genom att trycka
lösningen genom ett sterilfilter ned i sterila Eppendorfrör ~1.5 ml i varje rör. Stammen
förvaras i frys och tinas inför användning i rumstemperatur.
IPTG stam (0.5 M ) 10 ml
Väg in 1.19 g IPTG och lös i 10 ml Dest H2O. Sterilfiltrera lösningen genom att trycka
lösningen genom ett sterilfilter ned i sterila Eppendorfrör ~1.5 ml i varje rör. Stammen
förvaras i frys och tinas inför användning i rumstemperatur.
Autoklavering
Autoklavera följande material:
1,5 l LB i 5 l E-kolv
2 x 250 ml i flaska
Ö/N odlingskolvar med 15 ml
LB-mediet ska autoklaveras och autoklaveringstiden räknas ut med hjälp av tabellen som
finns i Autoklaveringsrummet.
Ympning av bakterier till liten odling:
Efter autoklaveringen när lösningen har svalnat tillsätts 30 g/ml kanamycin (1000ggr
spädning) till övernattsodlingskolven (200ml kolv) innehållande 15 ml LB-medium.
Tina bakterier från stammarna i på is . Tillsätt lämplig mängd bakteriestam är c:a 50-200 l.
Vänd bakteriestammen upp och ned innan för att blanda bakterierna med den glycerol som de
förvaras i.
Ställ sedan odlingen på tillväxt vid 37 C över natt.
Ympning av bakterier till stor odling:
Tillsätts 30 g/ml Kanamycin (1000ggr spädning) till stora odlingskolven (5 l kolv)
innehållande 1,5 l LB-medium.
Överför allt från Ö/N odling (15 ml) till den stora 1,5-liters LB-lösningen
Ställ sedan den stora odlingen på ett skakbord för tillväxt i 37 C.
Gemensam fortsättning:
Följ sedan tillväxten genom att mäta absorbansen vid 660 nm som speglar celltätheten. Detta
görs genom att suga upp LB-medium med en steril pipett (3-5 ml). Mät i plastkuvetter,
använd dest-H2O som referens.
När absorbansen är c:a 0,8 tillsätts 1.5 ml av inducern, isopropyl--D-tiogalaktopyranosid
för att inducera produktionen av Fatty acid binding protein (FABP) i E. coli bakterierna. Efter
denna tillsatts får odlingen pågå i rumstemperatur under natten.
Odlingen avbryts. Bakterielösningen centrifugeras vid 3200 rpm i 20 min (4 C) i stora
centrifugflaskor. På så vis kan man separera bakteriecellerna från odlingsmediet.
Supernatanten hälls försiktigt tillbaka i kolven och autoklaveras därefter innan det kastas.
Pelleten bestående av bakterier slammas upp i en liten volym (max. 30 ml)
resuspensionbuffert (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5mM Imidazole, pH 8) till Ni-NTA
kromatografi (His-Tag rening) för söndertagning av bakteriecellerna med hjälp av sonikering.
Sonikering (ultaljudbehandling):
Sonikering används ofta för att bryta sönder cellmembraner, varvid ultraljud (typiskt 20-50
kHz) genereras elektroniskt och den mekaniska energin överförs till provet via en metallprob
som oscillerar med hög frekvens och som ger upphov till begränsade områden med högt
tryck. Detta leder till kavitering och sammanpressning i lösningen, vilket till sist gör att celler
bryts upp och proteininnehållet kommer ut i lösningen.
Sonikering sker 6x10 sek med 10 sek mellanrum på ett prov på max 30 ml. Provet förvaras på
is under behandlingen.
Förvara sedan proteinlösningen kyld tills kromatografin sker.
Qiagen Ni-NTA Kromatografi
Lösningar:
Resuspensionbuffert (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5mM Imidazole, pH 8)
Tvättbuffert (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 8)
Elueringsbuffert A (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH 8)
Elueringsbuffert B (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 8)
Ekvilibrera kolonnen med 10 ml resuspension buffert
Applicera provet (1-35 ml). Flödet bör vara 1 ml/min. Samla upp genomflödet i en bägare.
Tvätta med 4 ml tvättbuffert (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 8).
Samla upp genomflödet i en bägare.
Eluera med 3 ml elueringsbuffert A (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH
8)
Applicera 3 ml elueringsbuffert B (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH
8). Samla upp i fraktioner (Eppendorfför 1 ml i varje fraction)
Poola ihop fraktionerna och dialysera
Efter användning: Tvätta gelen med 30 ml 0.5 m NaOH. Förvara i 30 % etanol.
SDS-Polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)
1. Introduktion
Efter att FABP renats fram med affinitetskromatografi, skall renheten studeras med hjälp av
SDS-PAGE. Dessutom ska renhet och uttryck av FABP studeras på prover som tagits undan
efter olika moment under produktionsprocessen. Det är den vanligast förekommande metoden
för att följa en upprening av ett protein och avgöra hur rent proteinet är. Denna metod
separerar proteiner beroende på deras storlek. Genom att SDS (sodium dodecylsulfate), som
är negativt laddat, sätts till provet får proteinerna en negativ laddning, som är direkt
proportionell mot proteinets storlek. Detta sker genom att SDS binder till proteinet.
Polyakrylamidgelen består av ett nätverk som proteinerna måste vandra igenom. Nätverkets
storlek beror på proportionerna av akrylamid och bis-akrylamid. Dessa proportioner väljs så
att de proteiner man vill studera separerar från varandra på gelen. Man inkluderar också ett
antal referensproteiner med känd molekylvikt i sin analys. Dessa körs separat på samma gel,
så att man utifrån dessa kan uppskatta sitt eget provs molekylvikt. Genom att avsätta
logaritmen för molekylvikten hos referensproteinerna mot vandringslängden erhålls en rät
linje. Det är sen enkelt att uppskatta molekylvikten hos provet genom att använda
referensgrafen.
UTFÖRANDE
OBS! För detta moment används Färdigpolymeriserade gelplattor som erhålls av
labhandledaren.
Provberedning:
Prov: Lämplig provmängd att applicera är c:a 10 g protein, maximal volym i en provbrunn
är c:a 35 l. Räkna först ut vilken volym prov ni skall ta. Provet blandas sen med 10 l
provcocktail, och 1 l -merkaptoetanol. Tillsätt 5 l bromfenolblått (BFB). Blandningen
upphettas i kokande vatten i 2-3 min. Sedan appliceras provet i provbrunnarna.
Referens: 5 l färdigblandad referenslösning, 10 l provcocktail, 5 l BFB och 1 l merkaptoetanol blandas. Detta behandlas sedan som ovan.
Elektrofores:
Koppla ihop ihop gelkassetterna med elektroforesvannan. Späd elektrod-bufferten 5 ggr med
dest-H2O till en slutvolym på 850 ml och häll den i elektroforesvannan (i det ”inre” och
”yttre” utrymmet).
Kör vid 50 V genom koncentrationsgelen och öka sedan till 200 V. Avbryt körningen när det
blåa bandet har vandrat till slutet på gelen.
Fixering-färgning och avfärgning:
1. Ta ut gelen från glasplattorna
2. Placera gelen i vatten så att den är väl täckt
3. Värme i mikrovågsugnen så att den nästan kokar. Den får inte koka vilket riskerar att
förstöra gelen. Ta ungefär så mycket att det tar 40 s att värma vattnet.
4. Häll av vattnet utan att hälla ut gelen.
5. Repetera steg 2-4 ytterligare tre gånger
6. Häll Safestain över gelen så att den täcks. Värm i mikrovågsugnen tills den nsätan
kokar.
7. Färga in i 30 min
8. Avfärga i vatten
Fotografering av gelen:
Gelen tvättas i dest-H2O och förvaras därefter i 20 % (v/v) etanol inför fotograferingen.
