Zahra El-schish
Vad är hemligheten bakom C4b-bindande proteins
uttryck hos eukaryota celler?
När man forskar om ett specifikt protein är meningen att lära sig vad det gör, hur det
regleras samt förstå dess struktur och vad olika delar gör. Det är därför viktigt att man har
lämpliga och bra metoder att testa uttrycket av proteinet. Projektets största del bestod av
att utveckla och hitta de bästa antikropparna för att kunna detektera proteinet på bästa
möjliga sätt.
C4b-bindande protein (C4BP) är ett plasmaprotein som deltar i regleringen av
komplementsystemet, en del av det medfödda immunförsvaret. Detta är kroppens första
försvarslinje och bekämpar en infektion direkt. Det medfödda immunsystemet C4BP i
plasman består huvudsakligen av sju α-kedjor och en β-kedja. Försök att uttrycka
komplett C4BP eller enbart β-kedjan har hittills misslyckats. Rekombinant C4BP
innehållande enbart α-kedjor uttrycks med stor framgång i eukaryot system. En eukaryot
organism har flera celler i komplex där arvsmassan återfinns i cellkärna som är avgränsad
av ett cellmembran. Syftet med detta projekt är att utvärdera om β-kedjans två ändar, den
C-terminala och N-terminala delen, har betydelse för proteinuttrycket. I plasman
cirkulerar C4BP tillsammans med det s.k. protein S som förhindrar att blodet koagulerar
och som är bundet till β-kedjan. Ett annat delmål i projektet är att kontrollera huruvida
närvaro av protein S kan påverka uttrycket av C4BP β-kedja.
ELISA är en immunologisk metod som används för att kvantifiera och detektera
antikropp eller antigen. ELISA var utvecklat för både α− och β-kedjan, där 24 olika
antikroppar testades för att utveckla dessa ELISor. Trunkerade former av C4BPβ-kedjor
var skapad genom mutationer. Uttrycket var testat med olika immunologiska metoder.
Kan man detektera proteinet så kan man göra flera olika tester som hjälper oss att förstå
hur proteinet beter sig i kroppen och vad det gör.
Trunkerade former av C4BPβ som saknade C-terminala delen uttrycktes i humana
embryoniska njurceller. Normalt C4BPβ-protein uttrycktes också från cellerna vilket var
oväntat, men det kan bero på att njurcellerna normalt uttrycker en låg mängd av protein
S, som vi trodde påverkar uttrycket av β-kedjan.
Projektet slutar inte här utan proteinerna ska testas i andra cellinjer som inte uttrycker
protein S, för att undersöka om det är orsaken bakom uttrycket av det normala C4BPβproteinet.
Handledare: Björn Dahlbäck
Examensarbete 20 p i Molekylärbiologi. Vt. 2007
Institutionen för cell- och organismbiologi
Institutionen för laboratoriemedicin, Malmö, Medicinska fakulteten, Lunds universitet
ABSTRACT
C4b-bindnig protein (C4BP) is a major regulatory molecule of the complement system.
C4BP establishes a non-covalent complex with anticoagulant vitamin K dependent
protein S, that plays an important role in blood coagulation. Most C4BP in human plasma
is composed of seven α-chains (70 kDa) and one β-chain (45 kDa), which in turn consist
of eight and three complement control protein (CCP) domains, respectively. The binding
site for protein S is localized on the C4BPβ-chain. To this date, it has been impossible to
express C4BPβ-chain in eukaryotic systems, whereas α-chains expresses well.
Expression of the β-chain has only been successful in prokaryotic systems. One reason
could be the presence of the C-terminal part, which normally join α-chains and β-chain
together by disulfide bonds. Another explanation could be that the C4BPβ-chain also
needs presence of protein S in order to be expressed and secreted.
The aim with this project was to analyze if truncated forms of β-chain, lacking the Cterminus, could be expressed in eukaryotic cells, and to see whether this part of the
protein is responsible for the difficulties in obtaining recombinant β-chain. Another aim
with this project was to investigate whether presence of protein S can affect expression of
C4BP β-chain.
Sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA was developed for both αchains and β-chain. 24 antibodies were tested to develop thus ELISAs. Truncated forms
of C4BPβ-chain were created by site directed mutagenesis and expression was analyzed
with ELISA, western blot and gel filtration.
We found that the truncated forms of C4BPβ, lacking the C-terminal were expressed in
HEK293 cells. To our surprise also wild type C4BPβ WT was detectable in growth
medium from the cell cultures from transfected cells. The results suggests that it is
plausible that protein S presence affects the expression of C4BP beta-chain, since the
expression levels of both truncated and full length β-chain were considerably higher in a
system of co-expression of protein S and β-chain.
Our results provide new information about expression of C4BPβ-chain in eukaryotic cells
but additional experiments are required before a full understanding of C4BPβ-chain
expression can be obtained.
