HTLV

Detektion och kvantifiering av
HTLV-1 och -2 med Droplet
Digital PCR
Lorraine Eriksson, Biomedicinsk analytiker, Doktorand
Laboratoriemedicinska Kliniken, Molekylärdiagnostik F&U
Universitetssjukhuset Örebro
Humant T–lymphotroft virus (HTLV)
• Humant retrovirus
• Lymfocyter
• RNA -> proviral DNA
• Smittar via infekterade celler
• Blodprodukter, orena kanyler, sexuell
kontakt och från mor till barn genom
amning.
• HTLV-1 och HTLV-2
• Asymtomatisk –bärare
• HTLV-1: adult T-cells leukemi/lymfom
(5 %), HTLV-1 associerad
myelopati/tropisk spastisk pares (2-3
%)
• HTLV-2
https://global.britannica.com/science/reverse-transcriptase
HTLV infektioner
• HTLV-1 Japan, Afrika, Karibien, Syd Amerika och Iran
• HTLV-2 ursprungsbefolkning i Syd och Nord Amerika och bland
injicerande missbrukare
http://cmr.asm.org/content/23/3/577.full.pdf
HTLV diagnostik
•
Nya Blod- & plasma givare screenas. Par som utreds för
assisterad befruktning. Klinisk misstanke om HTLV-infektion
•
Specifika antikroppar mot virus. Konfirmation med ytterligare
antikroppstest eller vid behov PCR.
•
Pro viral load (PVL) – % av lymfocyter innehåller DNA-kopior av
HTLV
•
Hög PVL – högre risk att utveckla sjukdom
HTLV diagnostik forts.
• Laboratoriemedicinska kliniken, USÖ är referenslab för HTLV
• Ingen PCR-metod för bedömning av pro-viral load har fram till nu
funnits i Sverige.
Proverna har skickats till London (Imperial College, St Mary’s
Hospital) för bedömning av pro-viral load.
Droplet digital PCR (ddPCR)
• Absolut kvantifiering av DNA- och RNA-molekyler utan att
behöva använda standardkurvor
Material
• Buffy coat – lymfocyter
• Cellräkning i helblod; Sysmex,
Klinisk kemi
Droplet generering
•
•
•
•
•
Mix: Supermix, Primer & probe, DNA
Olja
Tryck över prov och olje brunnarna
Provet samt oljan trycks genom rör i cartridge
Upp till 20 000 droppar skapas – täckta i olja
PCR-amplifiering
• HTLV-1 & RPP30
• HTLV-2 & RPP30
• PCR reaktion kommer ske i varje droppe som innehåller
minst en kopia av target
• Detektion vid end-point
Droplet reader
•
•
•
•
Individuell analys
fluorescense; FAM och VIC(HEX)
form & storlek på droppar
Positiva eller negativa droppar – fluorescence signal. Har skett en
PCR reaktion
Quantasoft
• analysera resultat
• Konc. som kopior/µl - positiva droppar & Poisson algorithm
• Minst 10000 droppar
Pro-viral load
• PVL beräknas; PVL=
koncentration HTLV
koncentration RPP30
∗ 100
2
och normaliseras sedan med andelen lymfocyter i provet
Variation och känslighet
Intra-assay variabilitet
HTLV-1: CV = 0,97-3,34 %
HTLV-2: CV = 1,71-8,2 %
Inter-assay variabilitet
HTLV-1: CV = 1,84-6,13 %
HTLV-2: CV = 1,18-12,89 %
PROBIT
HTLV-1
2780 c/mL 100 %
444 c/mL 40 %
HTLV-2
1360 c/ml 100 %
444 c/mL 20 %
Korrelation ddPCR - qPCR
Resultat
Inno-LIA
qPCR
Positiv
ddPCR
Negativ
Positiv
Negativ
Totalt antal
prover
HTLV-1 positiv
53
5
56
2
58
0
4
4
0
4
0
5
0
5
5
0
1
0
1
1
HTLV-2 positiv
Indeterminant
Negativ
Resultat
Falsk positivitet och svagt positiva prover
• ≤ 3 droppar kunde i vissa fall detekteras i NTC under
optimering och utvärdering av ddPCR-metoden.
• Samtliga kliniska prover sätts x 4 ospädda och x 1
spädda 1/10. Svagt positiva prover (1-3 droppar/brunn)
bedöms positiva om positiva droppar finns i alla brunnar.
Mutationer
Mutation CA alt. CT
Ingen mutation
Konklusioner
• ddPCR möjliggör pålitlig och känslig bestämning av
PVL för både HTLV-1 och HTLV-2.
• Korrelationen mellan PVL analyserade med qPCR
och PVL analyserade med ddPCR är mycket bra.
• Den låga intra- och inter-assay variabiliteten gör
ddPCR till en lämplig metod för HTLV-diagnostik och
för att följa patienter över tid.
• Sedan 1 juni 2015 kvantifieras och bestäms HTLV
PVL med ddPCR på Laboratoriemedicinska Kliniken,
Molekylärdiagnostik FoU. 62 prover på ddPCR.
TACK!