Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Självlysande DNA avslöjar cellerna
Anna Dahlén
I alla celler i en organism finns i sin helhet dennes genetiska arv som utgörs av DNA organiserat i
kromosomer. DNA består av två strängar med komplementära bassekvenser som är hoptvinnade i en
så kallad dubbelhelix vars form kan liknas vid en spiraltrappa.
Med en metod som kallas fluorescent in situ hybridisering (FISH) kan olika avvikelser i cellens DNA
detekteras. Syftet med arbetet har varit att studera celler som fått en extra kopia av kromosom 7 (kallas
trisomi 7) under celldelningen. För att kunna göra detta utvecklades metoden för att användas direkt på
vävnadssnitt. I ett vävnadssnitt ligger cellerna oftast överlappande och dessutom omges de av olika
typer av bindväv. Mycket arbete måste därför läggas på att bryta ner bindväven och frilägga cellerna.
FISH används ofta på rena utstryk av celler och då har man inte detta problem. Med FISH kan man
detektera olika avvikelser i cellens DNA. FISH grundas på att man använder prober (d.v.s. en relativt
kort sekvens DNA med hög affinitet för en känd sekvens i cellkärnans DNA) inmärkta med en
molekyl, exempelvis ett protein. DNA denatureras vid hög temperatur (90oC) vilket ger enkelsträngat
DNA. Detta kan jämföras med ett blixtlås som öppnas. Denaturerad prob läggs på cellerna och kan då
komma in i cellkärnorna. När temperaturen sedan sänks så sammanfogas komplementära sekvenser
och en ny dubbelhelixstruktur bildas – blixtlåset stängs. På detta sätt “kopplas” proben till cellens
DNA. För att i nästa steg hitta proberna används antikroppar som är proteiner med mycket hög
specificitet för en viss struktur. Antikropparna agerar likt målsökande missiler vars mål är strukturen
på den molekyl som proben märkts in med. Antikropparna är försedda med ett självlysande ämne som
sedan kan ses i ett fluorescensmikroskop. På detta sätt ger antikropparna åskådaren information om
probens placering och antal inne i cellkärnan. FISH kan användas på cellutstryk samt på snitt av
formalinfixerad vävnad. Fördelen med vävnadssnitt är att man kan åskådliggöra histologin och få en
verklighetsbild över hur det ser ut i vävnaden. När man tittar i fluorescensmikroskopet förbluffas man
av den otroliga färgkomposition som FISH ger upphov till och den struktur som finns i en vävnad.
Cellkärnor i blått med signaler från proberna som distinkta röda eller gröna prickar, bindväven runt
cellerna i klargröna fält, blodkärl med tallrikslika röda blodkroppar i klar orange.
Trisomi 7 är en avvikelse som observerats i cancerös, inflammerad och i normal vävnad. Det är okänt
om trisomi 7 är en orsak till, eller en följd av, ett sjukdomstillstånd. Den vävnad som använts i denna
studie kommer från en tumörtyp som uppstår i ledhinnorna. Genom att räkna signalerna från proberna
i cellerna var det möjligt att få en frekvens över celler med trisomi 7 i vävnadssnitten. Trisomi 7 har
observerats vid analys av odlade celler från den tumörtyp som studerats. Förekommer förändringen
också in vivo, d.v.s. i vävnaden, och hur är cellerna fördelade? Resultaten visar att trisomi 7 förekom
och att cellerna var utspridda en och en i vävnaden. Ett problem med snitt är att cellerna klipps av likt
russin i ett bröd. Följaktligen går en del av DNA:t förlorat eftersom det hamnar i ett annat snitt.
Resultaten var därför lite missvisande och en högre frekvens av celler med trisomi 7 hade förväntats
om snitten varit tjockare. Den metod som utvecklats i detta arbete var dock fullt användbar då starka,
tydliga signaler från proberna framträdde. När försöken upprepades fick man liknande resultat vilket
visar att metoden är pålitlig och kan rekommenderas för liknande försök på samma typ av vävnad.
Swedish official title: Frekvens och lokalisering, in vivo, av celler med trisomi 7 i pigmenterad
villonodulär synovit
Swedish credits: 20p
E-mail address of first author: [email protected]
Supervisor: Torbjörn Säll and Fredrik Mertens, Dept of Genetics and dept of Clinical Genetics
Submission date/time: 10/18/2000
Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Evaluation of the in vivo frequency and localization of cells with
trisomy 7 in pigmented villonodular synovitis
Anna Dahlén
Biology, Genetics
Autumn 1999
Abstract in English
Pigmented villonodular synovitis (PVNS) is a benign soft-tissue tumor of unknown etiology
affecting the synovium. Cytogenetic findings of short-term cultured cells from PVNS have
revealed the presence of clonal chromosomal aberrations such as an extra copy of
chromosome 7 (trisomy 7). The present work has consisted in the characterization of the
localization and the frequency of cells with trisomy 7 in vivo. This has been possible by the
development of a method for doing fluorescence in situ hybridization (FISH) on formalinfixed, paraffin-embedded sections of synovia biopsies from patients with PVNS. Sections
from biopsies from normal synovia and other types of synovitis as well as cell from a fine
needle aspiration biopsy were also used. The results indicate that the trisomic cells are
scattered within the tissue sections, without any signs of clustering to particular areas. Most
analyzed cells were disomic, followed by monosomic and trisomic cells. The unexpectedly
high frequency of monosomic cells suggests a high number of false negatives. The truncation
of the cells during the preparation of the histopathological sections turned out to be a larger
problem than obtaining satisfying hybridization results.
