Konstruktion och verifiering av två plasmider med “Platelet derived growth factor A (PDGF A) Hanna Sjödin Proteinet PDGF är som det engelska namnet antyder ett protein som stimulerar tillväxt av celler och då framförallt bindvävsceller. Detta innebär att PDGF är mycket viktigt vid läkning av sår. PDGF har dock många andra funktioner, som bildande och underhåll av celler i det centrala nervsystemet. Det har också en viktig roll vid bildandet av bla njurar, lungor, hud och blodkärl i det utvecklande embryot. Förhöjda nivåer av PDGF har emellertid kopplats samman med vissa sjukdommar som tumörer, åderförkalkning och vävnadssvulster i organ som lungor, njurar och lever. Fyra olika former av PDGF proteinet är idag kända, vilka har givits namnen PDGF-A, -B, -C och –D. PDGF-A existerar dessutom i två splice varianter som ger upphov till proteiner av olika längd, ett kort och ett långt. Mitt projekt gick ut på att tillverka och verifiera två genkonstrukt med PDGF Alång respective PDGF Akort. Ett genkonstrukt består av cirkulärt DNA, en så kallad plasmid, en promotor och motsvarande cDNA av det protein som ska studeras (se figuren). En promotor är en DNA sekvens som är nödvändig för att genen i fråga ska “läsas av” och motsvarande mRNA följt av protein ska produceras. En annan egenskap hos promotorer är att de är aktiva i för dem specifika celltyper. Promotorn som användes till konstrukten i mitt projekt kallas på engelska “Glial fibrillary acidic protein promoter (GFAPp)” och är aktiv i vissa celler i hjärnan, så kallade astrocyter (stödjeceller). Denna promotor användes då vi vill studera effekten av förhöjda nivåer av PDGF A proteinet i hjärnan, framförallt beträffande uppkomsten av tumörer från astrocyter, så kallade glioblastom. Förenklad bild av ett genkonstrukt bestående av plasmiden IRESGEO, promotorn GFAP och cDNA för PDGF Alång eller PDGF Akort. IRESGEO innehåller en reportergen (LacZ). Proteinet som genen kodar kan relativt lätt detekteras in vivo, dvs i djurmodeller, och kan därför användas för att testa var i djuret genkonstruktet är aktivt Jag verifierade att DNA konstrukten var korrekt konstruerade genom bla DNA sekvensering. Jag utförde också experiment för att undersöka att PDGF A proteinet verkligen producerades från konstrukteten och att det producerades i en fungerande form, dvs hade förmågan att tex påverka tillväxt av celler. Resultaten från dessa experiment visade att proteinet PDGF Akort tillverkades från konstruktet och att det även producerades som ett fungerande protein. Det var dock svårare att påvisa närvaro av PDGF Alång proteinet. Vi tror dock att proteinet i fråga producerades som det skulle men att metoderna behöver förfinas för att kunna bevisa detta. De två konstrukten användes sedan av doktoranden Inga Nazarenko till att skapa möss med ett förhöjt uttryck av PDGF A i hjärnan. Mössen skapades genom att ett DNA fragment innehållandes GFAPp-PDGF A och reportergenen injicerades i musägg. Då dessa möss växer upp kommer en del av dem att uttrycka en högre mängd PDGF A protein i hjärnan än normalt. Syftet med detta är att studera, hur frekvent, om och var i musens hjärna tumörer (glioblastom) utvecklas.