Konstruktion och verifiering av två plasmider med “Platelet derived

Konstruktion och verifiering av två plasmider med “Platelet derived growth factor A
(PDGF A)
Hanna Sjödin
Proteinet PDGF är som det engelska namnet antyder ett protein som stimulerar tillväxt av
celler och då framförallt bindvävsceller. Detta innebär att PDGF är mycket viktigt vid läkning
av sår. PDGF har dock många andra funktioner, som bildande och underhåll av celler i det
centrala nervsystemet. Det har också en viktig roll vid bildandet av bla njurar, lungor, hud och
blodkärl i det utvecklande embryot. Förhöjda nivåer av PDGF har emellertid kopplats
samman med vissa sjukdommar som tumörer, åderförkalkning och vävnadssvulster i organ
som lungor, njurar och lever.
Fyra olika former av PDGF proteinet är idag kända, vilka har givits namnen PDGF-A, -B, -C
och –D. PDGF-A existerar dessutom i två splice varianter som ger upphov till proteiner av
olika längd, ett kort och ett långt. Mitt projekt gick ut på att tillverka och verifiera två
genkonstrukt med PDGF Alång respective PDGF Akort. Ett genkonstrukt består av cirkulärt
DNA, en så kallad plasmid, en promotor och motsvarande cDNA av det protein som ska
studeras (se figuren). En promotor är en DNA sekvens som är nödvändig för att genen i fråga
ska “läsas av” och motsvarande mRNA följt av protein ska produceras. En annan egenskap
hos promotorer är att de är aktiva i för dem specifika celltyper. Promotorn som användes till
konstrukten i mitt projekt kallas på engelska “Glial fibrillary acidic protein promoter
(GFAPp)” och är aktiv i vissa celler i hjärnan, så kallade astrocyter
(stödjeceller). Denna promotor användes då vi vill studera effekten
av förhöjda nivåer av PDGF A proteinet i hjärnan, framförallt
beträffande uppkomsten av tumörer från astrocyter, så kallade
glioblastom.
Förenklad bild av ett genkonstrukt bestående av plasmiden IRESGEO,
promotorn GFAP och cDNA för PDGF Alång eller PDGF Akort. IRESGEO innehåller en reportergen (LacZ).
Proteinet som genen kodar kan relativt lätt detekteras in vivo, dvs i djurmodeller, och kan därför användas för att
testa var i djuret genkonstruktet är aktivt
Jag verifierade att DNA konstrukten var korrekt konstruerade genom bla DNA sekvensering.
Jag utförde också experiment för att undersöka att PDGF A proteinet verkligen producerades
från konstrukteten och att det producerades i en fungerande form, dvs hade förmågan att tex
påverka tillväxt av celler. Resultaten från dessa experiment visade att proteinet PDGF Akort
tillverkades från konstruktet och att det även producerades som ett fungerande protein. Det
var dock svårare att påvisa närvaro av PDGF Alång proteinet. Vi tror dock att proteinet i fråga
producerades som det skulle men att metoderna behöver förfinas för att kunna bevisa detta.
De två konstrukten användes sedan av doktoranden Inga Nazarenko till att skapa möss med
ett förhöjt uttryck av PDGF A i hjärnan. Mössen skapades genom att ett DNA fragment
innehållandes GFAPp-PDGF A och reportergenen injicerades i musägg. Då dessa möss växer
upp kommer en del av dem att uttrycka en högre mängd PDGF A protein i hjärnan än
normalt. Syftet med detta är att studera, hur frekvent, om och var i musens hjärna tumörer
(glioblastom) utvecklas.