säkerställning av sällsynta dna-kontroller med

SÄKERSTÄLLNING AV
SÄLLSYNTA DNA-KONTROLLER
MED HELGENOMAMPLIFIERING I
KLINISKT SYFTE
AMINA HALILOVIC
Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp
Biomedicinska analytikerprogrammet
Mars – Maj 2015
Malmö högskola
Hälsa och samhälle
205 06 Malmö
SÄKERSTÄLLNING AV
SÄLLSYNTA DNA-KONTROLLER
MED HELGENOMAMPLIFIERING I
KLINISKT SYFTE
AMINA HALILOVIC
Halilovic, A. Säkerställning av sällsynta DNA-kontroller med
helgenomamplifiering i kliniskt syfte. Examensarbete i biomedicinsk
laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Fakulteten för hälsa och
samhälle, institutionen för biomedicinsk vetenskap, 2015.
Vid klinisk enbaspolymorfi (SNP) analys inkluderas DNA-kontroller med kända
genotyper i varje analysomgång för att säkerställa riktigheten vad gäller
analysresultatet. DNA-kontrollerna har en central roll för resultatens trovärdighet
vid genotypningen. Vissa kontrollprover som används är av sällsynt genotyp och
kan vara mycket svåra att få tag på. Detta arbete har utförts för att undersöka om
det går att erhålla DNA-material från sällsynta genotyper med hjälp av
helgenomamplifiering och på så sätt säkerställa en tillgång till dessa. I arbetet
testades helgenomamplifiering med hjälp av två olika kit. De
helgenomamplifierade produkternas kvantitet och kvalitet analyserades och
jämfördes med det ursprungliga DNA:t, med avsikt att redogöra för det mest
fördelaktiga kitet för SNP-analys i kliniskt syfte. Båda helgenomamplifieringskiten påvisade god förmåga att amplifiera genomiskt DNA med hög kvalité.
Helgenomamplifierat DNA från det bästa kitet sekvenserades och här var
skillnader mellan ursprungligt och helgenomamplifierat DNA marginella. Vid
sekvensanalys av ett 464 baspar långt fragment av faktor II genen och 585 baspar
långt fragment av ApoE genen på fem helgenomamplifierade DNA-prover
påvisades endast en eventuell diskrepans.
Nyckelord: DNA-kontroll, enbaspolymorfi, genotypning, helgenomamplifiering,
multiple displacement amplification.
1
SECURING RARE DNACONTROLS WITH WHOLE
GENOME AMPLIFICATION IN
CLINICAL PURPOSE
AMINA HALILOVIC
Halilovic, A. Securing rare DNA-controls with whole genome amplification in
clinical purpose. Degree project in Biomedical Laboratory Science, 15 credit
points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of
Biomedical Science, 2015.
Clinical single nucleotide polymorphisms (SNP) analysis includes DNA controls
with known genotypes in each run to ensure the accuracy of the analysis results.
DNA controls have a central role for the credibility of the results in the
genotyping process. Some of the used control samples are rare and can be very
difficult to obtain. This work was carried out to investigate whether it is possible
to obtain DNA from samples with a rare genotype using whole genome
amplification and as a result ensure access to these samples. In this work the
whole genome amplification method was tested by two different kits. The quantity
and quality of the whole genome amplification products were analyzed and
compared with the original DNA, with the intention to describe the most
advantageous kit for clinical SNP analysis. Both tested kits demonstrated a good
ability to amplify genomic DNA with high quality. Whole genome amplified
DNA from the best kit was sequenced and the difference between the original
DNA and whole genome amplified DNA was negligible. Sequence analysis of
464 base pairs of the factor II gene and 585 base pairs of the ApoE gene in five
whole genome amplified DNA samples indicated only one possible discrepancy.
Keywords: DNA controls, single nucleotide polymorphism, genotyping, whole
genome amplification, multiple displacement amplification.
2
FÖRORD
Jag skulle vilja först och främst tacka min handledare legitimerad biomedicinsk
analytiker och PhD Ewa Lavant på DNA-laboratoriet vid avdelningen klinisk
kemi i Malmö för professionell handledning och stöd till examensarbete. Jag vill
dessutom rikta ett stort tack till Labmedicin Skåne på Universitetssjukhuset SUS i
Malmö och enhetschefen Margareta Svensson för att jag fick tillstånd att använda
lokaler och material till mitt projekt. Ett stort tack riktas på samma sätt till all
personal som arbetar på DNA-laboratoriet i Malmö för deras stöd och
uppmuntran. Sist men inte minst riktas ett tack till alla som har läst och bidragit
med åsikter längs skrivresans gång.
3
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
FÖRORD
3
BAKGRUND
Helgenomamplifiering (WGA)
Multiple displacement amplification (MDA)
Syfte
5
5
6
7
METOD
DNA amplifiering med WGA
Koncentrationsbestämning med PicoGreen
Agarosgelelektrofores
SNP-analys
Sangersekvensering
Etisk bedömning
7
8
8
9
9
10
11
RESULTAT
Kvantitativ analys av WGA DNA-prov
Analys av WGA DNA-provernas fragmentstorlekar
Kvalitativ analys av WGA DNA-prov
11
11
12
13
DISKUSSION
Metoddiskussion
Resultatdiskussion
14
14
16
KONKLUSION
18
REFERENSER
19
4
BAKGRUND
För att kunna utföra en DNA-analys krävs det en tillräcklig mängd av DNA. Ett
problem som ofta uppstår när DNA-analyser utförs är att utgångsmaterialet är
begränsat. Begränsad tillgång till DNA skapar hinder för bland annat forskning,
forensisk medicin och klinisk diagnostik, eftersom molekylärbiologiska analyser
blir allt vanligare. Många genomanalyser och detektionsanalyser kräver
genomiskt DNA (gDNA) i mikrogram (µg) [1]. Dessutom kan otillräckligt med
DNA-templat leda till att flertal önskade analyser inte går att genomföras på ett
prov, vilket innebär att det blir kostnadsineffektivt. För att kunna lösa detta
problem används vanligtvis DNA amplifiering, varvid DNA:t kopieras och det
skapas en tillräcklig stor mängd DNA för analys. Det största problemet är inte att
skapa den kvantitativa mängden DNA, utan att få mängden DNA rent och av hög
kvalité. Därför har helgenomamplifiering (WGA) utvecklats [1-2].
Idag finns det flera analyser tillgängliga med hög kapacitet för detektion av
enbaspolymorfim (SNP) [3]. Med hjälp av SNP-analyser kan små variationer i
genomet på en bas upptäckas. Dessa variationer kan vara gemensamt för vissa
syndrom eller sjukdomar som på så sätt kan identifieras [3-4]. SNP-analyser
utförs vid DNA-laboratoriet, klinisk kemi i Malmö och kontroll-DNA med känd
genotyp inkluderas i varje analysomgång för att säkerställa riktigheten vad gäller
analysresultatet. SNP-analyser i rutinarbete för medicinsk diagnostik på
patientprover utförs endast en gång, om kontrollen håller sig inom
referensområdet. Därför spelar kontrollen en central roll för resultatens
trovärdighet. Vissa kontrollprover som används är av sällsynt genotyp som till
exempel faktor II c.20210 A/A med en frekvens på 0,02 % i Europa och
Apolipoprotein E (ApoE) E2/E2 med en frekvens på 1 % i Sverige, och kan vara
mycket svåra att få tag på [5-6]. Det är därför önskvärt att kunna amplifiera upp
gDNA från dessa genotyper så att tillgången på kontrollmaterial säkerställs. Detta
kan göras med hjälp av WGA.
Helgenomamplifiering (WGA)
Intresset har ökat under de senaste 20 åren och många studier har utförts med
målet att kunna säkerställa tillgången av gDNA [1,7-13]. Flera olika sorters
WGA-metoder har utvecklats i form av kit från olika tillverkare varav alla medför
fördelar och begränsningar. För många företag är det en utmaning att skapa det
mest omfattande WGA-kitet på marknaden, eftersom det kräver tillförlitlig
amplifiering av tre billioner baser utan nedbrytning, förändring eller förlust av
locus eller alleler [7]. Till skillnad från polymerase chain reaction (PCR) som
riktar sig mot amplifiering av specifika sekvenser, är syftet med WGA att
amplifiera hela genomet med minimal amplifieringsförlust. WGA skapar
möjligheten att amplifiera 1-80 µg gDNA in vitro från endast 1-10 celler [3,7-8].
Det kvantitativa utbytet samt längden på den amplifierade DNA-produkten skiljer
mellan de olika WGA-metoderna (Tabell 1) [8].
De första WGA-metoderna var ursprungligen baserade på PCR med Taqpolymeras. Två exempel på PCR-baserade WGA-metoder är degenerate
oligonucleotide-primed PCR (DOP-PCR) och primer extension preamplification
PCR (PEP-PCR). PEP-PCR och DOP-PCR använder degenererade och
slumpmässiga oligonukleotidprimers för att amplifiera gDNA innan körning av
PCR. Fördelen med dessa metoder är att de ska kunna amplifiera
5
mikrogramkvantiteter av DNA från enstaka celler [3,7-8]. En nackdel med PCRbaserade WGA-metoder är att det amplifierade DNA:t består av en hög nivå av
diskrepanser, i genomsnitt med en felfrekvens på 3 x 10-5 (Tabell 1). Sannolikt
beror den höga nivån av diskrepanser på att Taq-polymeraset saknar 3'-5'
korrekturläsningsaktivitet [8]. På grund av den låga aktiviteten och specificiteten
hos Taq-polymeras är även amplifieringen hos dessa metoder väldigt
oregelbunden. Vissa regioner av genomet kan som följd av detta bli
överrepresenterade och andra är underrepresenterade. PCR-baserade WGAmetoder kan därför ge ofullständig täckning av locus och vara olämpliga för SNPanalys i kliniskt syfte [3]. En annan nackdel är att PCR-baserade WGA-metoders
amplifierade DNA endast fungerar på genotypning från PCR-reaktioner av korta
regioner [7-8]. På senare tid har isotermiska amplifieringsmetoder utvecklats, som
till exempel multiple displacement amplification (MDA), och i hög grad ersatt de
PCR-baserade WGA-metoderna [9].
Tabell 1. Jämförelse av tre olika helgenomamplifierade metoders karaktäristiska egenskaper [8].
Metod
MDA
PEP
DOP
DNA utbyte/100 µl reaktion
80 µg
40 ng
1-6 µg
Valbar skala av reaktionsvolym
Ja
Nej
Nej
DNA produktlängd (baspar)
2000-≥100 000
100-1000
100-1000
DNA polymeras felfrekvens
<3 x 10-6
3 x 10-4 – 1 x 10-5 3 x 10-4
Multiple displacement amplification (MDA)
MDA är inte baserad på PCR och är den första verkliga WGA-metoden med bäst
genomisk täckning och minimal förlust av alleler [3,8]. MDA kan amplifiera det
mänskliga genomet direkt från biologiska prover inklusive ifrån spermie [14],
helblod och enskilda celler [9,12]. Amplifiering kan ske utan krav på DNA-rening
[12]. MDA-tekniken använder sig av DNA-polymeraset från Φ29-bakteriofagen
som amplifierar DNA vid en konstant temperatur på 30°C. Bakteriofagen Φ29
innehåller ett genom på 19 285 baspar (bp) och härstammar från bakterien
Bacillus subtilis. Hos Φ29 bakteriofagen kodar gen 2 för DNA-polymeraset som
skapar multienzymatiska aktiviteter och som används vid genomreplikationen
[1,7]. MDA-amplifieringen sker genom att annealing utförs av slumpmässiga
hexamer primers som riktas mot hela genomet. Därefter syntetiseras nytt DNA
utefter primerna av Φ29 DNA-polymeraset och tidigare förlängda produkter
förskjuts. Förskjutna DNA-strängar fungerar sedan som mallar för nya primers,
vilket leder till primerförlängning i den motsatta riktningen. Till följd av att
MDA-reaktionen fortsätter, förskjuts nya DNA-strängar och nya mallar bildas,
som i sin tur bildar en hyperförgrenad struktur. Denna mekanism kallas
”hyperförgrenings mekanism” och resulterar i ett stort antal kopior av det
ursprungliga DNA:t (Figur 1) [7-8].
Figur 1. Illustration av principen för multiple displacement amplification (MDA). MDA grundar
sig på Φ29 DNA-polymeraset strängförskjutningsaktivitet som hålls igång av en
”hyperförgrenings mekanism” varvid exponentiell amplifiering av önskat DNA-templat uppnås.
Resultatet av denna reaktion blir ett högt utbyte av DNA [1,3,7–8].
6
MDA har många fördelar jämfört med PCR-baserade WGA-metoder, bland annat
på grund av den extremt höga processiviteten hos polymeraset, polymerasets
starka strängförskjutningsaktivitet och 3'-5' korrekturläsningsaktivitet [1,3,7].
Φ29-polymeraset har en 3'-5' korrekturläsningsaktivitet som i genomsnitt tillför
70000 nukleotider varje gång polymeraset binder till en primer [3]. DNApolymerasets mycket höga processivitet leder till dess förmåga att skapa långa
WGA-produkter med hjälp av MDA. Enligt tidigare studie ligger längden på
WGA-DNA med hjälp av MDA mellan 2000 – 100000 bp jämfört med PCRbaserade WGA-metoder vars produkter ligger mellan 100 – 1000 bp, men är i
genomsnitt kortare fragment (<400 bp), se tabell 1 [8]. I många tillämpningar är
det en fördel med långa DNA-produkter, inklusive vid DNA-sekvensering i
kliniskt ändamål. En annan fördel som MDA har framför PCR-baserade WGAmetoder är att processiviteten även är bättre inom guanin-cytosin (GC)-rika
regioner. 3'-5 'korrekturläsningsaktiviteten möjliggör även för enzymet att kopiera
över samma mall flera gånger, men parallellt också utvidga för nya primers, vilket
leder till stark strängförskjutningsaktivitet [1,3,7]. Denna egenskap medför mindre
amplifieringsförlust och högre pålitlighet än med metoder där Taq-polymeras
används, vilket resulterar i en lägre nivå av diskrepanser med <3 x 10-6
felfrekvens (Tabell 1) [8]. I tidigare studier beskrivs även att 1 SNP
genotypingsfel per 1000 analyser har indikerats, då högkvalitativt DNA använts
som mall för WGA [1,3,15]. För genotypning är noggrannheten mycket viktig
eftersom det bekräftar en tillförlitlig representation av alleler. Tidigare studier
visar att korrelationen i SNP-analyser mellan oamplifierat stam-DNA och WGADNA med MDA är högre än 98 % [15-18]. Flera studier antyder att i jämförelser
med PCR-baserade WGA-metoder är MDA den mest tillförlitliga metoden för
genotypning, inklusive för SNP-analys [1,3,7-8,12,15-23]. De två mest
användbara MDA-kiten enligt tidigare studier är GenomiPhi (GE Healthcare Life
Sciences) och Repli-g (Qiagen) [1,3,10-11,15,21-22]. I detta arbete verifierades
om det går att säkerställa DNA-kontrollprover ifrån sällsynta genotyper genom in
vitro amplifiering med hjälp av MDA-baserad WGA. Hypotetiskt bör MDAtekniken vara lämplig för att säkerställa sällsynta DNA-kontroller för SNP-analys.
Om antagandet visar sig vara korrekt ställs frågeställningen: vilket kit, Replig-g
från Qiagen eller GenomiPhi från GE Healthcare Life Sciences, erbjuder den mest
optimala MDA-baserade WGA för att garantera tillförlitligt referensprov vid
SNP-analys i kliniskt syfte?
Syfte
Syftet var att undersöka två MDA-baserade WGA-kit och försöka implementera
det mest fördelaktiga kitet för att säkerställa sällsynta DNA-kontroller i SNPanalys i det kliniska arbetet på DNA-laboratoriet i Malmö.
METOD
Fem avidentifierade DNA-prov som tidigare använts med framgång till SNPanalys valdes ut till WGA-försöken. DNA hade tidigare extraherats från EDTAblod med Agencourt Genfind v2 (Beckman Coulter, USA) med hjälp av en
Biomek FXP pipetteringsrobot (Beckman Coulter, USA) enligt tillverkarens
instruktioner. Initialt testades två olika kit för MDA-baserad
helgenomamplifiering: Repli-g från Qiagen och GenomiPhi från GE Healthcare
Lifescience. Kvantiteten på erhållet WGA-amplifierat material mättes med
7
PicoGreen och koncentration av amplifierat DNA utvärderades. För att få en
visuell bild av WGA DNA-fragmentens längd genomfördes agarosgelelektrofores.
Dessutom kontrollerades kvalitén på helgenomamplifierade DNA-prover med
SNP- och sekvenseringsanalys.
DNA amplifiering med WGA
Helgenomamplifieringen utfördes med hjälp av kiten Repli-g ® minikit (Qiagen,
Tyskland) och Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kits (GE Healthcare
Life Sciences, Storbritannien) enligt tillverkarenas instruktioner med 10 ng DNA
som startmaterial för WGA-reaktionen. Sedan upprepades
helgenomamplifieringen med 1 ng input för att testa kitens förmåga att amplifiera
DNA från en liten mängd start-DNA och 100 ng DNA input med Replig-g kitet
respektive stam-DNA input med GenomiPhi kitet för att kontrollera funktionen
vid en stor mängd DNA input. Då endast 1 µl DNA tillsätts vid WGAamplifiering med GenomiPhi kunde inte mängder på 100 ng erhållas utan stamDNA användes istället som maximal mängd. Prov 5 amplifierades med
GenomiPhi 1 ng input på samma sätt under två olika tillfällen för att testa om
metoden är robust. Den andra amplifieringen av prov 5 fick namnet ”prov 5
extra”. Före amplifiering mättes även koncentrationen på samtliga provspädningar
vid 1 ng DNA input med en nanodrop 2000c spektrofotometer (Thermo Scientific,
USA).
Repli-g minikit
I Repli-g kitet utnyttjades kemisk denaturering av DNA med tillsats av
denaturerings-buffert som fick verka i 3 minuter i rumstemperatur. Vid tillsats av
neutraliseringsbuffert stoppades denatureringen. Färdigblandad mastermix från
Repli-g kitet innehållande reaktionsbuffert och Φ29 DNA-polymeras tillfördes till
DNA-proverna som inkuberades vid 30°C över natt (ca 16 timmar).
Amplifieringsreaktionen stoppades därefter genom inaktivering av Φ29 DNApolymeraset vid 65°C i 3 minuter.
GenomiPhi
Provbuffert blandades med DNA-proverna. I GenomiPhi kitet utnyttjades
temperaturdenaturering genom att DNA-proverna värmdes upp till 95°C i 3
minuter. Proven kyldes sedan ned till 4°C. Färdigblandad mastermix från
GenomiPhi kitet innehållande reaktionsbuffert och enzymmix med Φ29 DNApolymeras tillfördes till DNA-proverna som amplifierades i 1,5 timme vid 30°C.
Amplifieringsreaktionen stoppades genom inaktivering av Φ29 DNA-polymeraset
vid 65°C i 10 minuter.
Koncentrationsbestämning med PicoGreen
Samtliga WGA DNA-prov koncentrationbestämdes med hjälp av PicoGreen
dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes, USA) enligt tillverkarens
instruktioner. Kortfattat blandades WGA DNA-prover med 1 x triss-EDTA (TE)
buffert och PicoGreen som binder till dubbelsträngat DNA och framkallar
fluorescens. Fluorescensen mättes med DTX 880 (Beckman Coulter Inc, USA)
vid 520 nm. Med hjälp av linjär regressionsanalys från en standardkurva
beräknades koncentrationen av amplifierat gDNA.
8
Agarosgelelektrofores
Ursprungliga oamplifierade DNA-prover och WGA DNA-prover från Repli-g 10
ng input, GenomiPhi 10 ng input, GenomiPhi 1 ng input samt storleksmarkörerna
GeneRuler™ 100 bp Plus DNA ladder (Thermo Scientific, USA) och
O’RangeRuler 200 bp DNA ladder (Thermo Scientific, USA) separerades på
1 %-ig agarosgel (SeaKem® LE Agarose, USA). Gelen färgades med GelRedTM
(Biotium, USA) och separation av DNA-fragmenten utfördes vid 90 V under 60
min. Efter avslutad elektrofores visualiserades DNA-fragmenten med hjälp av
UV-ljus och gelen fotograferades med gelkamera (GenoSmart, VWR, USA).
SNP-analys
Samtliga WGA DNA-prov och oamplifierade stam-DNA-prov späddes till 1 ng/µl
i DNase fritt vatten. Tre olika SNP-analyser utfördes på proverna med hjälp av
TaqMan kemin: FII c.20210 G>A (rs1799963), ApoE C112R (rs429358) och
ApoE R158C (rs7412) enligt tillverkarens instruktioner. För varje SNP-analys
inkluderades fyra kontroller: en homozygot vildtyp, en heterozygot, en
homozygot muterad och en non-template kontroll.
Faktor II
Genotypning av FII c.20210 G>A utfördes genom att en reaktionsblandning
bestående av TaqMan MasterMix (Applied Biosytems, USA) innehållande
buffert, dNTP, Ampli Taq Gold® DNA-polymeras Ultra Pure samt ROX™
blandades med FII Assay Mix 40X (Applied Biosytems, USA). FII Assay Mix
innehöll Forward primer 5’- TGT GTT TCT AAA ACT ATG GTT CCC AAT-3’,
Reverse primer 5’- GAG AGC TGC CCA TGA ATA GCA -3’, Reporter 1 5’VIC-TCA GCG AGC CTC AA-MGB-3’och Reporter 2 5’- 6-FAM-CTC AGC
AAG CCT C-MGB-3’. I en MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied
Biosytems, USA) tillsattes 10 µl reaktionsblandning och 10 µl av respektive spätt
DNA-prov.
ApoE
Genotypning av ApoE C112R och ApoE R158C utfördes på samma sätt som
faktor II c.20210 G>A med undantaget att Assay Mixen (C___3084793_20
respektive C____904973_10, Applied Biosystems, USA) är fördesignad av
företaget och primer och reportersekvenserna okända.
PCR amplifiering
Med PCR-teknik amplifierades delar av de specifika generna som analyserades
från gDNA. PCR-reaktionen utfördes med PCR-apparaten ABI Gene Amp 9700
(Applied Biosystems, USA) med följande PCR program: Taq aktivering vid 95C
i 10 minuter, efterföljt av 40 cykler med denaturering 95C i 15 sekunder och
annealing och därtill även extension vid 60C i 1 minut. Under PCR-reaktionen
hybridiserar fluorescensmärkta allelspecifika prober med sina specifika produkter
och allelspecifik fluorescens utvecklas.
Genotypning
Fluorescensen i PCR-produkterna mättes i instrumentet AB 7900HT Sequence
Detection System (Applied Biosystems, USA). Resultat presenterades i form av
ett scatterdiagram, där varje punkt motsvarar ett prov med ett visst X- och Yvärde. Genom detta påvisades genotyp för de olika proverna med 95 % säkerhet.
Prover med samma genotyp hade närliggande X/Y kvoter och bildade cluster.
9
Sangersekvensering
Sangersekvensering utfördes med sekvenseringskiten BigDye®Direct Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) på ursprungligt, oamplifierat DNAprov och WGA DNA-prov med GenomiPhi kit med 1 ng DNA input. Dessutom
utfördes sangersekvensering på prov 5 extra och ytterligare en gång på WGA prov
5. Ett 464 bp långt fragment av FII 3´UTR respektive 585 bp långt fragment av
delar av ApoE exon 4 sekvenserades.
Primär PCR
Primär PCR-reaktion genomfördes enligt ordinarie protokoll från tillverkaren
(BigDye®Direct Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) med undantag
att inget sterilt vatten tillfördes till reaktionsmixen och 3,5 µl 1 ng/µl DNA
tillsattes till reaktionsmixen. Reaktionsmixen bestod av färdigblandad BigDye®
Direct PCR Master Mix och M13-tailede PCR-primermix enligt Tabell 2 (DNA
technology, Danmark). Primär PCR reaktion utfördes med PCR-apparaten ABI
Gene Amp 9700 från Applied Biosystems med följande PCR program för
amplifiering av FII: 96C i 5 minuter, följt av 35 cykler med 94C i 30 sekunder,
62C i 45 sekunder, 68C i 45 sekunder och 72C i 2 minuter. ApoE
amplifierades på samma sätt med undantaget att denatureringstemperaturen
ändrades till 96C istället för 94C på grund av det höga innehållet av guanin och
cytosin i området. Under primär PCR amplifierades delar av den specifika genen
ifrån genomiskt DNA med genspecifika M13-tailade primers.
Tabell 2. Primers som använts för sekvensering.
Primermix Primernamn Sekvens 5´-3´
FII
ApoE
FII_F
tgtaaaacgacggccagtGCATCGTCTCATGGGGTGAA
FII_R
caggaaacagctatgaccTGGCCCTGCTCTGAAGATAG
APOE_F
tgtaaaacgacggccagtCTCTTGGGTCTCTCTGGCTCAT
APOE_R
caggaaacagctatgaccCTGCCCATCTCCTCCATCCG
M13-forward tail: tgtaaaacgacggccagt, M13-reverse tail: caggaaacagctatgacc
Sekvens PCR
Sekvenserings PCR utfördes med sekvenseringskitet Big Dye® Direct Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) enligt tillverkarens instruktioner med
undantaget att hälften så mycket BigDye® Direct Sequencing Master Mix (1 µl
per prov istället för 2 µl) blandades med 1 µl DNase fritt vatten per prov istället.
Till denna mix tillsattes BigDye® Direct M13 Forward Primer respektive Reverse
Primer. Sekvenseringsmixen tillsattes till primär PCR produkterna och sekvens
PCR utfördes på PCR-apparaten ABI Gene Amp 9700 (Applied Biosystems,
USA) med följande PCR program: 37C i 15 minuter, 80C i 2 minuter, 96C i 1
minut, följt av 25 cykler med 96C i 10 sekunder, 50C i 5 sekunder och 60C i 4
minuter.
Rening av sekvens PCR produkter
Sekvens PCR produkterna späddes 1:2 med DNase fritt vatten och renades med
Big Dye® XTerminatorTM Purification Kit (Applied Biosystems, USA) enligt
tillverkarens instruktioner för att bli av med eventuella saltjoner och oönskade
orenheter. Spädda sekvens PCR produkter blandades med SAM solution och
BigDye XTerminator solution i en MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate
(Applied Biosystems, USA). PCR plattan vortexades kraftigt i 10 min på
10
en plattskak och sekvensprodukterna centrifugerades därefter ned innan vidare
analys.
Kapillärelektrofores
Producerade sekvens PCR produkter analyserades med kapillärelektrofores i ABI
3500xL (Applied Biosystems, USA). Genom elektrokinetisk injektion tillfördes
enkelsträngade DNA-fragment på kapillären. Injektionen på kolonnen utfördes
vid 1,6 kV under 5 sekunder. Separationen skedde vid 19,5 kV under 1400
sekunder i en POP7- polymer.
Analys av DNA sekvens
Sekvensdata analyserades med programvaran SeqScape v2.5 (Applied
Biosystems, USA). WGA DNA-provernas sekvens jämfördes med DNAsekvenser ifrån ursprungsproven och mot referenssekvenser från NCBI-databasen
för ApoE (NG_007084.2) och faktor II (NG_008953.1).
Etisk bedömning
Ingen etisk prövning ansöktes eftersom analyserna utfördes på avidentifierat
DNA. Inga personuppgifter hanterades och proverna kan därför heller inte på
något sätt kopplas till specifika personer.
RESULTAT
Med anknytning till de metoder som användes presenteras erhållna resultat.
Kvantitativ analys av WGA DNA-prov
Vid amplifiering enligt tillverkarens rekommendationer med 10 ng DNA input
lyckades båda kiten producera en adekvat amplifieringsmängd. Jämfört med
GenomiPhi erhölls genomsnittligt en lägre koncentration gDNA med Replig-g
men den totala mängden amplifierat DNA var högre då en större volym WGAmaterial erhölls (Tabell 3). Med GenomiPhi gick det att amplifiera DNA från alla
tre utvalda DNA-mängderna medan Repli-g kitet fungerade bäst med tillverkarens
rekommendation på 10 ng DNA input. Vid 100 ng DNA input fungerade
amplifieringen med stor variation och vid 1 ng fungerade amplifieringen dåligt
eftersom WGA-amplifieringen uteblev för flera prov. Vad gäller
amplifieringsökning gav GenomiPhi kitet med 1 ng input upphov till bäst resultat
då 1 ng input i genomsnitt genererade 4800 ng DNA output. För att kontrollera att
proverna spätts rätt mättes koncentrationerna på samtliga provspädningar vid 1 ng
DNA input före amplifiering. Resultatet ifrån mätningen bekräftade att
provspädningarna var korrekta. Dessutom gav replikationsförsöket med
GenomiPhi 1 ng DNA input på ”prov 5 extra” en koncentration på 350 ng/µl.
11
Tabell 3. Amplifierad mängd DNA (ng/µl) i fem prover från två olika kit som utgår ifrån tre olika
DNA-inputmängder.
DNA (ng/µl)
GenomiPhi
Prov
Ursprungs-DNA
1
2
3
4
5
41,0
31,4
27,9
21,1
26,4
Medelvärde
Standardavvikelse
Utbyte
(ng/µl)
Medelvärde av
amplifieringsökning (x)
Repli-g
1 ng
10 ng
215
240
240
248
257
240
16
156
221
272
237
228
223
43
StamDNA
217
259
266
420
402
313
93
4800
400
200
1 ng
10 ng
37
0
0
0
3
8
16
147
158
158
105
127
139
23
100
ng
191
176
184
174
61
157
54
400
700
80
Analys av WGA DNA-provernas fragmentstorlekar
Samtliga fragment på agarosgelen hade en storlek över 3000 bp (Figur 2).
Figur 2. Erhållna resultat vid agarosgelelektrofores av helgenomamplifierade DNA-prov och
oamplifierade stam-DNA-prov. I ordning från vänster till höger: brunn 1,23 = Storleksmarkör
GeneRuler, 2 = Storleksmarkör O’RangeRuler, brunn 3,5,7,9,11 = stam-DNA för prov 1-5, brunn
4,6,8,10,12 = Repli-g 10 ng för prov 1-5, brunn 13,15,17,19,21 = GenomiPhi 10 ng för prov 1-5,
brunn 14,16,18,20,22 = GenomiPhi 1ng för prov 1-5, brunn 24 = GenomiPhi 1 ng för ”prov 5
extra”. bp motsvarar ordet ”baspar”.
12
Kvalitativ analys av WGA DNA-prov
Resultaten vid SNP-analys av ApoE C112R, ApoE R158C och faktor II c.20210
G>A gav samstämmigt resultat för alla prov och WGA-amplifieringar med
undantag för prov 2, 3 och 4 (visas som kryss i Figur 3) där 1 ng DNA använts till
WGA-reaktionen med Repli-g där inget resultat erhölls alls (Tabell 4). Alla
genotyper kunde framkallas automatiskt med mjukvaran med 95 % säkerhet med
undantag för ApoE C112R analysen där genotyperna fick framkallas manuellt.
Med undantag för två prov (prov 2 och 5 där 1 ng DNA använts, visas med grå
nyans i Figur 3) kunde GenomiPhi proverna framkallas automatiskt då de
analyserades separat för samma SNP, emellertid kunde inte samma sak upprepas
för Repli-g proverna. Scatterdiagram för ApoE C112R finns presenterat i Figur 3.
Tabell 4. Enbaspolymorfi resultat vid analys med TaqMan allelic discrimination på ABI 7900HT.
Prov
1
2
3
4
5
FII 20210 GA
both
A/A*
G/G*
G/G*
G/G
ApoE C112R
ApoE 112 C
ApoE 112 C*
both*
both*
both
ApoE R158C
APOE 158 R
both*
APOE 158 R*
both*
APOE 158 R
*resultat saknas för Replig-g WGA med 1 ng DNA.
Figur 3. Resultat vid analys av ApoE C112R där Replig-g prover är markerade i mörk grön och
mörk blå nyans, GenomiPhi prover är markerade med ljus blå och ljus grön nyans och de
ursprungliga, oamplifierade proverna är utmärkta med provnummer. I SNP-analysen inkluderades
fyra kontroller: en homozygot vildtyp (C/C), en heterozygot (C/R), en homozygot muterad (R/R)
och en non-template kontroll (svart kvadrat).
13
Vid sekvensering av ett 464 bp långt fragment av 3´UTR av FII och ett 585 bp
långt fragment av delar av exon 4 av ApoE identifierades inga ytterligare
polymorfier förutom de redan analyserade SNP:arna. Sekvensdata från FII gav
överensstämmande resultat mellan WGA-proven GenomiPhi 1 ng DNA input och
ursprungsproven. Sekvensdata från ApoE uppvisade däremot ett diskrepant
resultat mellan ursprungs-DNA prov 5 och WGA-amplifierat prov 5 vid position
c.388, vilket motsvarar den analyserade ApoE C112R SNP:en. Figur 4 visar att
DNA-sekvensen ifrån ursprungsprovet uppvisar ett heterozygot (T/C) resultat i
position c.388, medan det WGA-amplifierade provet gav ett homozygot (C/C)
resultat i samma position. Detta resultat är även diskrepant mot TaqMan SNPanalysen där ett heterozygot resultat erhölls för samma WGA-prov. Däremot
noterades i scatterplotten (Figur 3) att resultatet drar något mot ett homozygot
(C/C) resultat. Vid upprepad sekvensering av WGA-prov 5 blev resultatet återigen
homozygot (C/C) i samma position medan ”prov 5 extra” uppvisade ett
heterozygot (T/C) resultat i denna position.
Figur 4. Diskrepant resultat mellan ordinarie prov 5 och helgenomamplifierat prov 5 i position
c.388 vid sekvensering av ett 584 baspar långt fragment av ApoE genen.
DISKUSSION
I detta arbete verifierades om det går att säkerställa DNA-kontrollprover ifrån
sällsynta genotyper genom in vitro amplifiering med hjälp av MDA-baserad
WGA. Det övergripande syftet var undersöka två MDA-baserade WGA-kit och
försöka implementera det mest fördelaktiga kitet för att säkerställa sällsynta
DNA-kontroller i SNP-analys i det kliniska arbetet på DNA-laboratoriet i Malmö.
Metoddiskussion
I en tidigare studie jämfördes amplifieringsutbytet mellan PCR-baserade (iPEP
och DOP) och MDA-baserade WGA-metoder (GenomiPhi och Repli-g) som
visade att MDA-metoder producerar avsevärt mer DNA [22]. En annan studie har
visat att cirka 80 µg amplifierat DNA kan erhållas från en 100 µl reaktionsvolym
med hjälp av MDA [8]. MDA amplifierade DNA-prover har även visat sig kunna
bildas i nanoliter reaktionsvolym [24-25]. Eftersom MDA dessutom inte kräver
temperaturcykling utan utförs vid en konstant temperatur på 30°C kan metoden
enkelt utföras i ett värmebad eller på en värmeplatta. Sammanfattningsvis kan
14
MDA enkelt användas som en preparativ metod och skalas upp eller ned till
önskad volym efter önskad mängd amplifierat DNA [7-8].
MDA-reaktionens utbyte är mindre beroende av mängden DNA-input. Reaktionen
är istället självbegränsande och utbytet beror på reaktionsförhållandena,
reagensmängd och reaktionsvolym [7]. Under sådana förhållanden kommer de
varierande DNA-koncentrationer i de ursprungliga proven att nå ett konstant läge
under MDA-reaktionen. Detta är ytterligare en fördel för MDA om det tillämpas i
storskalig genotypning exempelvis i genomstudier. En genomstudie där 2320
SNP:ar utfördes på MDA-amplifierat DNA och ursprungligt gDNA visade ingen
signifikant skillnad mellan ursprungligt gDNA och MDA-amplifierat DNA och
överensstämmande genotyper erhölls [8].
Kapaciteten hos MDA är emellertid beroende av kvalitén på input-DNA.
Degraderade DNA-prover har färre bindningsställen för primers per DNAmolekyl, vilket försämrar sannolikheten för initiering av replikation. Följden av
detta blir att degraderat DNA-templat genomgår färre hyperförgreningsreaktioner.
Med avseende på detta utnyttjas polymerasets höga processivitet inte optimalt hos
MDA-reaktionen. I konsekvens av det sänks även det kvantitativa utbytet av DNA
mängden. Detta begränsar inte MDA-teknikens möjlighet för tillämpning inom
kliniska ändamål på grund av att DNA-proverna oftast är av god kvalité och inte
degraderade [7].
Även om GenomiPhi och Repli-g bygger på MDA och använder sig av samma
Φ29-polymeras finns det skillnader mellan kiten [3]. Förutom eventuella
skillnader i buffersammansättning är den huvudsakliga kända skillnaden att kiten
utnyttjar olika sorters DNA denaturering före amplifiering. Repli-g använder
kemisk denaturering medan GenomiPhi använder temperaturdenaturering. En
tidigare studie visar att kvaliteten på sangersekvensdata från MDA-baserade
WGA-prover förbättrades efter kemisk denaturering och förlusten av alleler ökade
efter temperaturdenaturering i ett GC-rikt genom [22]. För att skapa WGA DNA
enligt tillverkarens instruktioner var GenomiPhi kitet mer gynnsamt eftersom 1 µl
av DNA-templat behövdes för att få önskad mängd och koncentration medan
Repli-g krävde 5 µl DNA-templat. Genom att använda en så liten DNA-volym
som möjligt går det att framställa WGA-prov flera gånger om. Även en
observation gällande hur problematisk provupparbetningen var under användning
av kiten utfördes. Resultatet blev att Repli-g hade varit att föredra eftersom det var
enklare att arbeta med än GenomiPhi på grund av färre olika temperaturinkuberingar och därmed blir det en mindre omfattande provupparbetning.
Emellertid var processen mer tidskrävande för Repli-g (cirka 16 timmar varav
cirka 40 minuters praktiskt handarbete) än GenomiPhi (cirka 2 timmar varav cirka
20 minuter handarbete). GenomiPhi (1600 kr per kit) var även mer ekonomiskt
fördelaktigt än Repli-g (2000 kr per kit).
För att kontrollera WGA-provernas kvantitet och kvalitet utfördes laborativa
moment såsom koncentrationsmätning med PicoGreen, SNP-analys,
sangersekvensering och agarosgelelektrofores. DNA kvantifiering kan utföras
med flera olika metoder, där den mest vanligt förekomande är spektrofotometrisk
mätning vid 260 nm. I detta arbete användes PicoGreen för kvantifiering av WGA
DNA-prover. PicoGreen är en känsligare metod för koncentrationsbestämning av
DNA än absorbans och ger ett tillförlitligare resultat då endast dubbelsträngat
DNA mäts medan icke-inbundna primers som använts i WGA-reaktionen inte
15
registreras. Emellertid är PicoGreen en dyrare metod som kräver mer
provupparbetning [26].
Flera tidigare studier har undersökt WGA-produkter med SNP-analys [18-19].
Med hjälp av SNP-analys kan endast enstaka basparsförändringar upptäckas och
eftersom SNP-analys endast granskar en bråkdel av ett givet genom, finns det risk
att missa eventuella amplifieringsförluster [22]. På grund av detta användes även
sangersekvensering för att kunna undersöka en större del av det
helgenomampliferade DNA:t. Vid både SNP-analys och sangersekvensering
jämfördes WGA DNA-prover med stam-DNA ifrån ursprungsproven för
kvalitetsäkring. Idealt bör WGA-proven och stam-DNA ifrån ursprungsproven
vara identiska för optimal kvalité på MDA-kiten. Agarosgelelektrofores utfördes
för att få en visuell överblick om WGA-proven består av långa eller korta DNAfragment. Långa fragment är en indikation på bättre kvalité på
helgenomamplifieringen och dessutom kan långa fragment tillämpas i flertal
önskade analyser exempelvis sekvensering [16]. Även om MDA-baserade WGAmetoder tillämpats framgångsrikt i många studier [1,3,7-8,12,15-23], finns det en
potentiell felkälla i metoden. Felaktig DNA amplifiering kan ske med primerriktad DNA-syntes, vilket kan påverka analysresultaten för genotypning och ge
upphov till diskrepanser [3].
Resultatdiskussion
Enligt kitens tillverkare förväntas amplifierade DNA mängder på 10 μg i en 50 μl
reaktion (ca 200 ng/µl) för Repli-g från Qiagen och 4–7 μg i en 20 µl reaktion (ca
200-350 ng/µl) för GenomiPhi från GE Healthcare, när amplifieringsreaktionen
sker enligt tillverkarens rekommendation med 10 ng DNA input. Resultaten i
dessa försök visar att det i genomsnitt bildades 139 ng/µl amplifierat DNA med
Repli-g kitet, vilket är sämre än förväntat medan det med GenomiPhi kitet erhölls
förväntade amplifieringsmängder och en medelkoncentration på 223 ng/µl. Det är
viktigt att poängtera att båda kitens tillverkare rekommenderar 10 ng DNA input
men enligt detta arbetets resultat fungerade GenomiPhi minst lika bra vid 1 ng
DNA input och stam-DNA input medan Repli-g fungerade dåligt vid 1 ng DNA
input och med stor variation med 100 ng DNA input. Även om resultaten visar att
GenomiPhi med stam-DNA input ger högst kvantitativ mängd DNA i ng/µl,
bidrar 1 ng DNA input till ett högre utbyte med en ökning på 4800 gånger jämfört
med en genomsnittlig ökning på 200 gånger då stam-DNA användes. För att
säkerställa att GenomiPhi kitets kvantitativa förmåga är bäst vid 1 ng DNA input,
trots tillverkarens rekommendation, upprepades WGA med GenomiPhi på prov 5
vid ett annat tillfälle, som visade att GenomiPhi kitets kraftfulla amplifiering även
var robust. Det är mer fördelaktigt i undersökningens syfte om det går att använda
små mängder DNA input eftersom DNA-prover med sällsynta genotyper räcker
under en längre tidsperiod. I tidigare studie beskrivs att mängden på DNA input
inte ska spela en avgörande roll för amplifiering med MDA-reaktion men detta
arbete ville även testa kitens effektiva amplifieringsförmåga för mindre och större
DNA mängder [7]. De sammanlagda undersökningsresultaten av kvantitativ
analys i detta arbete visar att GenomiPhi kitet har en bättre amplifieringsförmåga
än Repli-g kitet. GenomiPhi kitet hade dessutom högst kvantitativt utbyte på
amplifierade DNA-produkter och lyckades framgångsrikt amplifiera genomiskt
DNA vid alla tre testade DNA input-mängderna.
Enligt tidigare studie ska MDA-baserad WGA kunna replikera 2000 – 100 000 bp
långa DNA-fragment [8]. Resultaten från agarosgelelektrofores visar att samtliga
16
fragment på agarosgelen hade en storlek över 3000 bp (Figur 2), vilket stämmer
överens med förväntade resultat. Detta medför möjligheten att använda de
helgenomamplifierade DNA-fragmenten för SNP-analys på DNA-laboratoriet i
Malmö som kräver >100 bp. Längden på DNA-fragmenten från WGA-proverna
ger även en möjlighet att utföra sangersekvensering som kräver fragment >400 bp,
ifall det skulle varit en lämplig analys på DNA-laboratoriet förutom att analysera
endast SNP:ar.
För att kontrollera kvalitén på de helgenomampliferade DNA-proverna utfördes
SNP-analys och sangersekvensering. Alla tre SNP-analyserna gav samstämmigt
resultat för alla prov och WGA-amplifieringar med undantag för prov 2, 3 och 4
där 1 ng DNA använts till WGA-reaktionen med Repli-g där inget resultat erhölls
alls. GenomiPhi kitets prover kunde framkallas automatiskt med 95 % säkerhet
och undantag för två prov (prov 2 och 5 där 1 ng DNA använts vid analys av
ApoE C112R), vilket inte kunde upprepas för Repli-g proverna. Dessa resultat
styrker och tillför ytterligare fördelar med GenomiPhi kitet vars indikationer tyder
på att kvalitén på det amplifierade DNA:t är bättre än med Repli-g kitet.
Eftersom GenomiPhi kitet visade sig vara det mest fördelaktiga kitet enligt
resultaten vid kvantitativa analysen och SNP:arna i detta arbete, utfördes endast
sangersekvensanalys på kitets WGA-prover vid 1 ng DNA input. Urvalet av
WGA-prover med 1 ng DNA input motiverades med att små mängder DNA input
är mest fördelaktigt i arbetes syfte att säkerställa sällsynta genotyper ifrån DNAprover. Sekvensdata från ett 464 bp långt fragment av FII 3´UTR visade att det
inte fanns några sekvensskillnader mellan det WGA-amplifierade DNA:t jämfört
med det ursprungliga DNA:t, vilket tyder på att MDA-baserad WGA amplifiering
har fungerat med GenomiPhi kitet. Sekvensdata från ett 585 bp långt fragment av
delar av ApoE exon 4 stämde också överens med DNA-sekvenser ifrån
ursprungsproven, med undantag för en eventuell diskrepans vid position c.388 för
prov 5 (Figur 4). Sangersekvensdata för WGA-amplifierat prov 5 uppvisar ett
homozygot (C/C) resultat i denna positionen istället för ett heterozygot (T/C)
genotypresultat . Denna position motsvarar ApoE C112R SNP:en där WGAamplifierat prov 5 erhöll ett heterozygot resultat (T/C). Däremot noterades det
scatterplotten i Figur 3 att resultatet drar något mot ett homozygot (C/C) resultat,
vilket pekar på en något ojämn amplifiering av de två allelerna i detta prov. Till
följd av resultaten från sekvensanalysen utfördes därför ännu ett
sekvenseringsförsök på ApoE-genen för prov 5 men även på ”prov 5 extra”. Det
nya resultatet visade återigen homozygot genotyp (C/C) i position c.388 för prov
5 medan ”prov 5 extra” erhöll en heterozygot (T/C) genotyp i samma position.
Alltså verkar denna diskrepans vara en kombination av en ojämn amplifiering av
alleler som beror på slumpen och sangersekvenseringens låga analyskänslighet
[7,27]. ApoE-genen ligger på kromosom 19, inom en mycket GC-rik region [28].
Det är viktigt att poängtera att båda kiten utmanades av ApoE:s höga GC-innehåll
redan vid SNP-analysen. Tidigare studie upplyser om att MDA-metoder fungerar
bättre i GC-rika områden än PCR-baserade WGA-metoder, men det är fortfarande
en utmaning för amplifieringsmetoder att vara lika effektiva i GC-rika regioner
[7]. För MDA fungerar strängförskjutningsaktiviteten svårare i regioner med ökad
halt GC, vilket kan skapa svårigheter i amplifieringen [22].
Det viktigaste resultatet för att kunna dra slutsats om framtida tillämpningar av
MDA-kit i kliniskt syfte bygger på att amplifierade DNA-produkter ska kunna
presentera en adekvat representation av alleler som leder till tillförlitlig
17
genotypningsresultat. Tidigare studie visar att genom MDA-amplifiering kan
bortfall av alleler hos WGA-produkter ske vilket kan leda till att en heterozygot
genotyp tolkas som homozygot [7]. Eftersom allt WGA-material innan
användning som kontrollmaterial vid SNP-analys kommer att kontrolleras
gällande genotyp för aktuell sällsynt SNP förhindras att felaktiga WGA-produkter
används.
Resultaten från alla tre SNP-analyserna påvisades emellertid vara tillräckligt goda
för att uppfylla arbetets syfte att kunna implementera sällsynta DNA-kontroller
för SNP-analys. Vid sekvensanalys av ett 464 bp långt fragment för faktor II
genen och 585 bp långt fragment för ApoE genen på fem WGA DNA-prover
påvisades endast en diskrepans som dessutom delvis beror på
sangersekvenseringens låga analyskänslighet [27]. Dessa sammanställda data
pekar på en adekvat representation av alleler och möjligheten att implementera
GenomiPhi kitet för användning i det kliniska arbetet på DNA-laboratoriet i
Malmö. Däremot skulle olika platser i genomet kunna ge upphov till olika typer
av resultat, detta arbete har undersökt delar av ApoE och faktor II generna, men
inte tagit hänsyn till hela genomet. Det är en utelämnad fråga som den här
undersökningen inte har fokuserat på.
KONKLUSION
DNA-prover med sällsynta genotyper behövs för upprepad användning som
kontrollprover vid SNP-analys. MDA-baserad WGA möjliggör replikation av ett
mänskligt genom med en enkel in vitro metod som tidigare näst intill var omöjlig.
Detta arbete visar att det mest fördelaktiga kitet av de två som testades var
GenomiPhi från GE Healthcare Lifescience, som erbjuder hög kvalité och god
kvantitet på sina WGA-produkter och kan användas i syftet att säkerställa
sällsynta DNA-kontroller för klinisk SNP-analys. Mest effektiv amplifiering
erhölls med 1 ng DNA input men den låga DNA mängden i MDA-reaktionen kan
eventuellt också innebära en högre risk för allel-bortfall.
18
REFERENSER
1. Lasken R S, (2009) Genomic DNA amplification by the multiple
displacement amplification (MDA) method. Biochemical Society
Transactions, 37, 450–453.
2. Hawkins T L, Detter J C, Richardson P M, (2002) Whole genome
amplification – applications and advances. Current Opinion in
Biotechnology, 13, 65-67.
3. Han T, Chang C W, Kwekel J C, Chen Y, Ge Y, Martinez-Murillo F,
Roscoe D, Težak Ž, Philip R, Bijwaard K, Fuscoe J C, (2012)
Characterization of whole genome amplified (WGA) DNA for use in
genotyping assay development. BMC Genomics, 13, 1-15.
4. Primrose S B, Twyman R M, (2003) Genomics: Applications in Human
Biology. United Kingdom, Padstow: TJ International Ltd.
5. dbSNP databas, (2015) FII c.20210 A/A >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/<
(2015-03-12)
6. Labmedicin Skåne, (2009) Apolipoprotein E (ApoE) genotypning
>https://www.skane.se/sv/Webbplatser/Labmedicin_Skane/Verksamhetso
mraden/Klinisk-kemi/Klinisk-kemistartsida/FragestallningDiagnostik/DNA/DNA/ApoE< (2015-03-12)
7. Lovmar L, Syvänen A C, (2006) Multiple Displacement Amplification To
Create a Long-Lasting Source of DNA for Genetic Studies. Human
Mutation, 27(7), 603-614.
8. Lasken R S, Egholm M, (2003) Whole genome amplification: abundant
supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in
Biotechnology, 21(12), 531–535.
9. De Bourcy F A C, De Vlaminck I, Kanbar J N, Wang J, Gawad C, Quake
S R, (2014) A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome
Amplification Methods. PLoS One, 9(8), 1-9.
10. Maciejewska A, Jakubowska J, Pawaowski R, (2014) Different WholeGenome Amplification Methods as a Preamplification Tool in YChromosome Loci Analysis. Am J Forensic Med Pathol, 35(2), 140-144.
11. Maciejewska A, Jakubowska J, Pawaowski R, (2013) Whole genome
amplification of degraded and nondegraded DNA for forensic purposes.
Int J Legal Med, 127, 309–319.
12. Dean F B, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi A F, Bray-Ward P, Sun Z,
Zong Q, Du Y, Du J, Driscoll M, Song W, Kingsmore S F, Egholm M,
Lasken R S, (2002) Comprehensive human genome amplification using
multiple displacement amplification. PNAS, 99(8), 5261–5266.
19
13. Lu Y, Gioia-Patricola L, Gomez J V, Plummer M, Franceschi S, Kato I,
Canzian F, (2005) Use of whole genome amplification to rescue DNA
from plasma samples. BioTechniques, 39(4), 511-515.
14. Jiang Z1, Zhang X, Deka R, Jin L, (2005) Genome amplification of single
sperm using multiple displacement amplification. Nucleic Acids Research,
33(10), 1-9.
15. Barker D L, Hansen M S, Faruqi A F, Giannola D, Irsula O R, Lasken R S,
Latterich M, Makarov V, Oliphant A, Pinter J H, Shen R, Sleptsova I,
Ziehler W, Lai E, (2004) Two methods of whole-genome amplification
enable accurate genotyping across a 2320-SNP linkage panel. Genome
Research, 14(5), 901–907.
16. Aaltonen KE1, Ebbesson A, Wigerup C, Hedenfalk I, (2011) Laser capture
microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) of DNA
from normal breast tissue --- optimization for genome wide array analyses.
BMC Research Notes, 4(69), 1-7.
17. Paez J G, Lin M, Beroukhim R, Lee J C, Zhao X, Richter D J, Gabriel S,
Herman P, Sasaki H, Altshuler D, Li C, Meyerson M, Sellers W R, (2004)
Genome coverage and sequence fidelity of phi29 polymerase-based
multiple strand displacement whole genome amplification. Nucleic Acids
Research, 32(9), 1-11.
18. Xing J, Watkins WS, Zhang Y, Witherspoon D J, Jorde L B, (2008) High
fidelity of whole-genome amplified DNA on high-density single
nucleotide polymorphism arrays. Genomics, 92(6), 452–456.
19. Ling J, Zhuang G, Tazon-Vega B, Zhang C, Cao B, Rosenwaks Z, Xu K,
(2009) Evaluation of genome coverage and fidelity of multiple
displacement amplification from single cells by SNP array. Molecular
Human Reproduction, 15(11), 739–747.
20. Anjum G M, Du W, Klein R, Amara U, Huber-Lang M, Schneider E M,
Wiegand P, (2010) Pyrosequencing-based strategy for a successful SNP
detection in two hypervariable regions: HV-I/HV-II of the human
mitochondrial displacement loop. Electrophoresis, 31(2), 309–314.
21. Croft D T, Jordan R M, Patney H L, Shriver C D, Vernalis M N, Orchard
T J, Ellsworth D L, (2008) Performance of whole-genome amplified DNA
isolated from serum and plasma on high-density single nucleotide
polymorphism arrays. Journal of Molecular Diagnostics, 10(3), 249–257.
22. Pinard R, De Winter A, Sarkis G J, Gerstein M B, Tartaro K R, Plant R N,
Egholm M, Rothberg J M, Leamon J H, (2006) Assessment of whole
genome amplification-induced bias through high-throughput, massively
parallel whole genome sequencing. BMC Genomics, 7, 1-21.
23. Ballantyne K N, van Oorschot R A H, Mitchell R J, (2007) Comparison of
two whole genome amplification methods for STR genotyping of LCN
and degraded DNA samples. Forensic Science International, 166, 35–41.
20
24. Marcy Y, Ishoey T, Lasken R S, Stockwell T B, Walenz B P, Halpern A
L, Beeson K Y, Goldberg S M, Quake S R, (2007) Nanoliter reactors
improve multiple displacement amplification of genomes from single
cells. PLoS Genetics, 3(9), 1702–1708.
25. Tamminen M V, Virta M P J, (2015) Single gene-based distinction of
individual microbial genomes from a mixed population of microbial cells.
Frontiers in Microbiology, 6, 1-10.
26. Sedlackova T, Repiska G, Celec P, Szemes T, Minarik G, (2013)
Fragmentation of DNA affects the accuracy of the DNA quantitation by
the commonly used methods. Biological Procedures Online, 15(1), 1-8.
27. Altimari A1, de Biase D, De Maglio G, Gruppioni E, Capizzi E,
Degiovanni A, D'Errico A, Pession A, Pizzolitto S, Fiorentino M, Tallini
G, (2013) 454 next generation-sequencing outperforms allele-specific
PCR, Sanger sequencing, and pyrosequencing for routine KRAS mutation
analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded samples. OncoTargets and
Therapy, 6, 1057-1064.
28. Mousavian Z, Sadeghi H M, Sabzghabaee A M, Moazen F, (2014)
Polymerase chain reaction amplification of a GC rich region by adding 1,2
propanediol. Advanced Biomedical Research, 3, 1-4.
21