kompendium HT10.version till pdfx

Avdelningen för kemi och biomedicin
Karlstads universitet
2010
Laborationskompendium
Biomedicinsk laboratorievetenskap
Mikrobiologisk metodik med genteknik 7,5 hp.
Innehåll;
Schema
Kursplan (delar)
Skyddsföreskrifter
Allmän bakgrund bland annat om:
Odlingsmedier och odling av bakterier, utstryksteknik, PCR, leginella pneumophilia
*Lab. V.40 Metoder för kvantifiering av bakterier
*Lab. V.41 Detektion av Legionella pneumophilia
med nestad PCR
*Lab. V.42 Identifiering av okänd bakterie
(skriftlig labrapport)
(skriftlig labrapport)
(muntlig individuell examination)
*Lab. V.43 Svalg & Urin
(muntlig labgrupp examination)
*Seminarium v.44 Genteknik/genetik
(muntlig helklass redovisning)
*Studiehandledning
*Bilagor till v.41 se pdf filer på kurshemsidan;
Fil ”DNAframrenings-handbok”innehåller mycket värdeful linfo. bland annat hur man renar fram DNA
Fil ”PCR-handbok” innehåller mycket värdeful linfo. bland annat hur man ”sätter upp” en PCR
*Bilagor till v.42 och v.43 se pdf fil på kurshemsidan
Fil ”bilagor okänd bakterie urin&svalg” innehåller följande:
Gramfärgning
Resistensbestämning m diskdiffusion (även separat fil)
Insamling av morgon urin
Signifikans tabell för urinvägspatogener. Mängdbestämning av bakterier
Step A (synns på vissa ställen dåligt se original version på lab)
Fil ”streptex”innehåller beskrvning hur man typar olika streptokock gr A-G
Fil ”jäsningsschema”innehåller Jäsningsschema plus lite annan värdefull information
Schema BLGAM0 (anm. Kod: KAU-14421) HT-10 Biomedicinsk laboratorievetenskap
Mikrobiologisk metodik med genteknik 7,5 hp.
Må
Ti
On
To
Fr
v.
40
4/108/10
41
11/1015/10
42
18/1022/10
43
25/1029/10
44
1/115/11
10.15-12.00
Sal:5F323
Allmän genomgång.
Kursupplägg.
Bakgrundsteori
Seminarieuppg.
9.00-17.00
Lab grupp 1
PH
Kvant
9.00-15.00
Lab grupp 1
PH
Kvant
9.00-17.00
Lab grupp 2
PH
Kvant
9.00-15.00
Lab grupp 2
PH
Kvant
9E311/312
9E311/312
9E311/312
9E311/312
9.00-16.00
Lab grupp 2
AE
Legionella PCR
9.00-17.00
Lab grupp 2
AE
Legionella PCR
9.00-16.00
Lab grupp 1
AE
Legionella PCR
9.00-17.00
Lab grupp 1
AE
Legionella PCR
9D204
9D204
9D204
9D204
10.30-16.00
Okänd bakt
9.00-15.00
Okänd bakt
AA/IL
(OBS! 1-2h
förberedelse för lab
ansvarig
Märkning av plattor
etc)
AA/IL
9.00-14.00
Okänd bakt
***
AA/IL
9.00-13.00
Labgenomgång
Nr.2 Legionella PCR
AE
9D303/313
9D303/313
9.00-14.00
Okänd bakt
(reserv dag)
***
AE
9D303/313
12.00Organisera er på Lab
9D204
9.00-15.00
Lab grupp 1+2
PH
Kvantifiering av
bakterier (Kvant)
9E311/312
9D303/313
10.30-13.00
Urin&Svalg
***
AA/IL
(OBS! 1-2h
förberedelse för lab
ansvarig
Spikning av prov etc)
9D204
9.00-15.00
Urin&Svalg
***
AA/IL
9.00-14.00
Urin&Svalg
***
9.00-12.00
Urin&Svalg
(reserv dag)
***
AA/IL
AE
9D303/313
9D303/313
9D303/313
10.15-15.00
10.15-15.00
10.15-12.00
Redovisning av
Seminarieuppg.
GENTEKNIK
AE
Sal: 5F323
Redovisning av
seminarieuppg.
GENTEKNIK
AE
Sal:5F323
Redovisning av
seminarieuppg.
GENTEKNIK
AE
Sal: 5F323
9D303/313
PH= Patrik Holm, KAU;AA= Anna-Sara Ahlquist, IL=Ingegärd lindgren; AE=Ann Erlandsson, KAU.
*** Tillfälle då möjlighet finns att examinera ”lab Okänd bakterie” alt urin & svalg”muntligt
Kursansvarig och Examinator:
Kurssekreterare:
Ann Erlandsson (AE) 9D 408
Alice Svedung 5C 348
ann.erlandsson @kau.se
[email protected]
054-7002471,0734047221
054-7001735
2
Kursplan
Kursens mål (om kursen uppdelas i delar kan även delmål anges)
Kursens syfte är att studenten efter genomgången kurs ska ha inhämtat grundläggande kunskaper i
mikrobiologisk metodik samt genteknik
Efter genomgången kurs ska studenterna kunna:
• Med hjälp av laborativt arbete med biokemiska, immunologiska samt molekylärbiologiska test
identifiera ett antal medicinskt viktiga bakterier
• Med hjälp av laborativt arbete kunna avgöra om en bakterie är resistent, intermediärt känslig eller
känslig för ett visst antibiotika
• Med hjälp av laborativt arbete kvantifiera bakterier i en suspension samt ange för- och nackdelar med
olika kvantifieringsmetoder
• Beräkna generationstiden för en bakterie samt sätta upp en relevant spädningsserie, pipettera med en
automatpipett på ett tillförlitligt sätt och beräkna variations koefficient i pipetteringsförsök
• Beskriva vilket ämne alternativt vilken reaktion som ger en diagnostisk eller selektiv information i ett
antal vanligt förekommande mikrobiologiska tester
• Beskriva principer för framrening, koncentration, renhets- och storleksbestämning av nukleinsyra
(DNA)
• Förklara hur PCR reaktionen fungerar
• Ange några vanliga infektions sjukdomar som vanligen diagnostiseras med PCR
• Presentera ett ämne inom genteknik muntligt samt diskutera detta ämne allmänt och utifrån etiska
aspekter med kursdeltagare och kursledare
• Beskriva ett kloningsförfarande
Kursens huvudsakliga innehåll (undervisningsformer, kursens indelning i olika kursmoment/block)
Kursen innehåller:
En inledande föreläsning repeterar delar av den medicinska mikrobiologin samt knyter an till mikrobiologisk
metodik och genteknik.
Ett antal föreläsningar inleder respektive avslutar de olika laborationsmomenten
Följande laborativa moment:
• Odling av humanpatogena bakterier för diagnostik och artbestämning av dessa med hjälp av
Gramfärgning, biokemiska test och immunologisk metodik.
• Resistensbestämning av bakterier
• Framrening av kromosomalt DNA från bakterier
• Detektion av bakterier med PCR-teknik och analys på agarosgelelektrofores
• Metoder för kvantifiering av bakterier med hjälp av "viable count", Bürker räknekammare och
turbidimetri
• Pipetteringsteknik
Följande moment redovisas i seminarieform:
• Genteknik och etiska aspekter kring genteknik.
Examination (även antal provtillfällen om antalet tentamensförsök har begränsats, dock minst fem ordinarie kurser
respektive två inom VFU)
Muntlig individuell examination, labrapporter, praktisk examination av pippeteringsteknik samt redovisning i
seminarieform.
3
Skyddsföreskrifter
Allmänna skyddsföreskrifter vid kurs laborationer med levande mikroorganismer vid
institutionen för biomedicinsk laboratorievetenskap, Hälsohögskolan i Värmland
1. Laboratorierockar ska skydda privata kläder från kontakt med infekterat material och
ska därför vara helt knäppt och helt skydda ärmarna. Ta av er ringar och klockor när ni
arbetar med levande mikroorganismer.
2. Tänk på att smitta kan överföras; vid avbränning av platinaplatinöser, via
aerosolbildning när man t ex öppnar odlingsflaskor, tar av gummiproppar, samt vid
oaktsamhet när man kastar plattor, och packar sopsäckar. Var försiktiga.
3. Tänk på att smitta kan överföras vid slamning av kulturer t.ex. vid resistensbestämning
och objektglas agglutinationer. Var försiktiga.
4. Använda objektglas och pasteurpipetter ska kastas i speciella plastbyttor. Plattor,
platinöser och andra engångsutensilier som kommit i kontakt med infektiöst material
kastas i riskavfall.
5. Vid spill av infekterat material, häll först på desinfektionsmedel, låt stå angiven tid,
och torka sedan av.
6. Torka av arbetsytan med desinfektionsmedel efter varje avslutat arbetspass.
7. Händer bör ej komma i kontakt med infekterat material.
8. Tvätta händerna noga (tvål och vatten) varje gång ni lämnar lokalen samt om ni
kommit i kontakt med infektiöst ämne.
9. Det är naturligtvis förbjudet att äta och dricka på laboratoriet
4
Allmänt
Odlingsmedier för bakterier
Olika bakterier har olika krav på näringslösningar samt olika förmåga att tillväxa vid
tillsatts av olika kemikalier alternativt under extrema koncentrationer av t.ex. [H+] eller
jonstyrka (se Jawetz et al Medical Microbiology). En del bakterier kräver dessutom en
speciell miljö omkring sig; aerob miljö (syrerik), CO2 rik miljö, anaerob miljö (helt utan
syre), de har dessutom olika tolerans när det gäller uttorkning (se under utstryksteknik).
Allmänna medier är näringsrika medier där de allra flesta bakteriearter växer. De används
när man misstänker en bakteriellt orsakad infektion t.ex. en sepsis och man vill få den
aktuella bakterien att växa fram oavsett vad det är för art. De är dock inte så allmänna att
samtliga bakteriearter växer, så vid vissa frågeställningar måste man använda speciella
medier.
Selektiva medier innehåller ämnen som är toxiska (ex gentianaviolett) alternativt
koncentrationer av vanliga ämnen som är toxiska för de flesta arter (ex 10 % NaCllösning) men inte för andra. Selektiva medier kan även vara näringsfattiga och på så sätt
selektera bakterier som inte är så näringskrävande. De gynnar sålunda vissa bakteriearter
men missgynnar andra. Medierna används när man vill selektera fram och få en viss
bakterieart att växa.
Diagnostiska eller differentierande medier innehåller ämnen som vissa bakterier kan
använda i sin ämnesomsättning medan andra är oförmögna till det. Vid ett eventuellt
nyttjande av ämnet (ex laktos) så bildas vid ämnesomsättningen nya produkter (ex
mjölksyra) vilka kan påvisas. Om t.ex. produkterna är sura eller basiska ger de ett
färgomslag i mediet om detta även innehåller en pH-indikator.
Många medier har en dubbel funktion. Ett exempel är gentianaviolett plattan som
selekterar växt av streptokocker och innehåller blod vilket gör att man kan se vilken typ
av hemolysin streptokockerna producerar eftersom vissa ger en ofullständig nedbrytning
(grön nedbrytningsprodukt) och andra en fullständig (uppklarning ”gul”).
Medier kan vara fasta (med agar) och finns både som plattor och i rör. Fasta medier gör
att man kan urskilja enstaka kolonier och lättare avgöra om man har en ren kultur eller
inte. Flytande medier finns i rör och här har man inte möjlighet att avgöra om man har en
ren kultur eller inte. Ett sätt till kontroll är dock att efter man doppat öglan i buljongen
odla ut på en platta och på så sätt kunna se om man har renkultur.
Utstryksteknik
Sterilteknik är en teknik som används inom många discipliner. Begreppet steril avser
total avsaknad av levande organismer. Vid substratberedning till bakteriologisk odling är
steriltekniken helt avgörande. Ett annat exempel är vid odling av eukaryota celler (oftast
cellinjer eller s.k. transformerade celler), då dessa celler förökar betydligt långsammare än
5
de prokaryota är de snart överväxta av bakterier och/eller mögel om dessa skulle komma
in i provet. För detta finns speciella sterilboxar.
När man arbetar med bakteriologiska prov är det viktigt att jobba så rent som möjligt.
Man får inte från egen normalflora eller förorenade utensilier tillföra någon bakterie som
sedan tillskrivs provet. Det är också viktigt för att skydda sig själv. Vid arbete med vissa
bakterier bör man p.g.a. smittrisken arbeta i dragskåp. Dessa bakterier kommer ej att ingå
i kommande laborationer. Vi arbetar på våra ordinarie labbänkar (om inte annat anges i
manualen). Man kan använda sig av en platinaögla (platinös) som kan brännas av eller av
engångsöglor av plast. Det som används mest på medicinskt mikrobiologiska laboratorier
är plastöglor. Oavsett om ni använder platinaöglor eller plastöglor kan följande
metodbeskrivning användas. Då plastöglor används utgår givetvis alla moment där
avbränning och flambering sker men man försöker ändå arbeta så rent som möjligt.
Plastöglan tas ur förpackningen först när den ska användas, man lägger aldrig tillbaka en
plastögla man tagit ur förpackningen och man lägger inte en använd ögla på en arbetsyta
utan den slängs direkt i därför avsedda avfallskärl.
Renkulturer av bakterier
För att kunna typa bakterier måste ha "rena" bakteriekulturer så kallade renkulturer som
härstammar från en enda bakterietyp. Man vill alltså att en enda bakterieart (stam) skall
växa på plattan och inte flera olika, för att vara säker på att man arbetar med en renkultur
måste alltid bakterier tas från enstaka kolonier på en platta. Om man dagen efter ska ha
möjlighet att se om man lyckats med att få en renkultur får man inte ta för mycket
material eftersom man då får en konfluerande växt och kan inte med ögat urskilja enstaka
kolonier. Av små kolonier (t.ex. streptokocker) kan man ta hela kolonien medan en större
koloni (t.ex. koli) doppar man bara platinösen i kolonien.
Utstrykstekniken går därför ut på att, oavsett om man använder platinaögla eller
plastögla, få fram enstaka kolonier. En enstaka koloni bildas från en enda bakterie som
sedan delar sig exponentiellt och ger upphov till flera miljoner bakterier och man får,
efter inkubation, en synlig koloni av bakterier.
Utstryksteknik på agarplatta
1. Plattan som ska användas läggs på bordet med locket nedåt. Märk plattorna i botten
med respektive nummer. Håll platinaöglan med höger hand och glödga den i
gaslågan. Vänta i 10-15 sek. för att öglan ska hinna svalna. Alternativ ta plastöglan
direkt ifrån förpackningen utan mellanlandning på bänken eller någon annanstans.
2. Plattan med bakteriekulturen, som också ligger på locket, fattas på sidorna med
vänstra handens fingrar, lyfts av och vänds med agarytan uppåt. Tag med öglan upp
litet bakteriemassa och lägg tillbaka plattan i locket.
6
3. Den oanvända upp- och nedvända plattan fattas med vänstra handens fingrar. Stryk
med öglan enligt mönstret nedan. De sista strykningarna bör ge kolonier uppkomna
från enstaka celler. Har man ett patientprov (bomullspinne) odlas primärstryket med
bomullspinnen och sekundär och tertiärstryk med plastögla.
Eventuell bacitracin optochin lapp
Sekundärstryk;
plastögla (samma)
Primärstryk;
• bomullspinne vid prov från t ex svalg
• platsögla vi odling för renkultur
Tertiärstryk; plastögla (samma)
4. Plattan vänds upp och ned och sätts tillbaka på locket. Avbränning av kontaminerad
platinaögla utförs så att öglan först torkas i närheten av lågan och därefter glödgas.
Om en fuktig ögla glödgas direkt bildas aerosol. Plastöglan kastas direkt (dvs. utan
mellanlandning på lab. bänken) i riskavfall.
Plattan inkuberas i lämplig miljö. Anaerob miljö i ”anaerobbox”; tillsätt 10 ml dest. vatten i
en särskild påse (se bifogad bruksanvisning) och ställ i 37oC inkubator, CO2 - rik miljö i
CO2-inkubator. Aerob miljö, inkubera direkt i inkubatorn, sätt en mugg med avjoniserat
atten för att öka luftfuktigheten i inkubatorn. Byt vatten varje dag.
Utstryksteknik i rör
1. Doppa öglan i den koloni du önskar testa. Se till att det bara är en sort.
2. Röret hålls i vänster och öglan i höger hand. Med högra handens krökta lillfinger
fattar man i rörets lock, skruvar av det och håller det kvar. Detta för att inte få med sig
föroreningar från labbänken.
3. Öglan förs in i röret och man gör sitt utstryk (ex urea-röret) alternativt doppar om
man har en lösning (ex ONPG-röret) eller om man ska testa rörligheten för man ned
öglan en gång i agarn och upp i samma spår (ex SIM-röret). Det räcker att man doppar
en gång i en lösning, var lugn det kommer att ramla av tillräckligt med bakterier. Man
kan och bör använda samma bakteriekoloni genom samtliga test för att försäkra sig
om att det är samma bakterie man testar. Det är praxis på många ställen att man efter
utodling i buljong kontrollerar att man har renkultur på en agarplatta (ex. blåplatta
om man testar Enterobacteriaceae).
urea-rör
(agar)
ONPG-rör
(buljong)
SIM-rör
(agar)
7
Rackling.
Vid kvantifiering av bakterier på platta är det viktigt att få en bra och jämn spridning av
bakterierna så att kolonierna sedan är lätta att räkna. Som rackla kan en böjd
Pasteurpipett användas men det finns också färdiga racklor, både engångs och sådana
man måste sterilisera mellan varje användning.
Olika typer av medier.
Det finns ett stort urval av medier som används på mikrobiologiska laboratorier för att
kunna odla fram och identifiera bakterier. Nedan ges en kort beskrivning av
cellodlingsmedierna som finns att tillgå vid laborationerna.
Fasta medier, agar plattor.
Används för att anrika de bakteriearter som finns i det prov som skickas till lab. Dessa
kan vara allmänna, selektiva eller diagnostiska, allt beroende på frågeställningen.
Choklad agar (hematinplatta) innehåller blod som upphettats och serum. Det är rikt
medium som de allra flesta bakterier växer på.
Blodagarplattan innehåller blod och är ett rikt medium där de flesta bakteriearter växer
dock ej t ex Hemofilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae och Neisseria meningitidis.
Anaerobplatta innehåller blod och är ett rikt medium som är fritt från syre. Inkuberas i
anaerob miljö.
Resistensplatta (Medium A) används för att odla bakterier och testa deras känslighet
för olika antibiotika. Mediet är näringsrikt eftersom man vill att så många sorters
bakterier som möjligt skall kunna växa på det. Medierna är ofta anpassade till vissa
antibiotika-lappar. (eg man måste köpa allt från en firma). Vissa bakteriearter kräver
speciellt medium. Det medium som finns till förfogande på den här laborationen är
ISOSENSITEST medium A.
Blåplattan som innehåller laktos (mjölksocker) och BTB (bromtymolblått) är en
diagnostisk platta. Om de odlade bakterierna är laktosjäsare bildas mjölksyra, miljön blir
sur och BTB slår om från blått till gult.
Streptplatta (Dubbelskiktad blodplatta) består av två skikt. Det övre skiktet
innehåller streptomycin som hämmar de flesta bakterier utom Streptokocker. Det
innehåller även blod som streptokockerna hemolyserar varför det blir en klar zon runt
varje bakteriekoloni. För att man ska se hemolysen tydligt är skiktet tunt. Det undre
skiktet funktion är att skydda plattan mot uttorkning (som annars lätt skulle kunna
inträffa p.g.a. det tunt gjutna överskiktet). Observera att Stafylokocken inte växer alt.
växer dåligt på den här plattan.
8
Flytande medier.
Används exempelvis för att odla upp en enda koloni som växer på en platta för att sen
preparera fram plasmider från denna bakterie. Alla bakterier i den flytand odlingen är då
likadana då de härstammar från en enda koloni på plattan.
LB- (Luria-Bertani) medium är lämplig vid uppodling av E.coli, men även andra
bakterier kan växa i detta medium. Finns även som fast medie, då med tillsats av agar.
Jäsnings"rör", Buljong eller Fasta Medier
Dessa används framförallt för att skilja olika arter åt. De kan vara både fasta och flytande
beroende på funktion.
ONPG. Testet visar om bakterierna kan bryta ner laktos/galaktos eller ej. Det är
känsligare än blå-plattan. Det krävs två enzymer, dels ett permeas som aktivt
transporterar in laktos i cellen och dels beta-galakotosidas som bryter ner det. ONPG
(orto-nitro-phenyl-galaktosid) används som substrat, därför att det vid nedbrytning
bildar en färgad (gul) produkt.
Urearör. I mediet ingår urinämne. Om bakterierna kan producera enzymet ureas så kan
det hydrolysera urinämnena och det bildas ammoniak. Ammoniaken är basisk och ger ett
färgomslag till cyklamensrött tack vare en indikator (fenolftalein) i mediet.
OD (Ornitindekarboxylas). Bakterier som inokuleras fermenterar dextros vilket leder
till sura nedbrytningsprodukter och ger ett färomslag till gult. Den sura miljön stimulerar
dekarboxylase aktivitet. Vissa bakterier kan avlägsna karboxylgruppen från ornitin vilket
leder till att det bildas en amin (putrecine) och mediet blir mer basiskt dvs mediet återgår
till den lila färgen. Den pH-indikator (kresol-röd och bromkresolpurpur) som används är
lila i basisk miljö och gul i sur. Observera att det måste vara en bakterie som fermenterar
dextros för att testet ska fungera, i annat fall kommer ju den lila färgen att bestå hela
tiden.
SIM-rör (Svavel-Indol-Motility). Tre olika egenskaper beträffande bakterierna kan
utläsas.
INDOL. Om bakterierna har ett enzym för att från aminosyran tryptofan avlägsna en
aminogrupp bildas indol. Efter övernatt inkubation tillsätts Erlich reagens (pdimetylaminobenzaldehyd) Den bildade indolen ändrar färg och blir röd.
H2S-produktion. Om bakterierna har ett enzym för att överföra svavel från den bundna
formen i vissa aminosyror till H2S. Mediet innehåller natrium-thio-sulfat, frigjort
svavelväte binds till i mediet tillsatt järn och bildar järnsulfid som kan ses som en svart
fällning.
RÖRLIGHET. Man ser om bakterierna flyttat sig från primärstrecket eller ej. Mediet är
halvfast och bakterier med flageller kan röra sig i mediet. För att lättare se rörligheten
9
finns tetrazoliumklorid tillsatt som av bakterierna reduceras från färglöst till rödbrunt.
Här är det viktigt att man för öglan ned och upp i röret i samma ”spår”. Vispar man runt
kommer det att se grumligt ut i röret oavsett om man har en rörlig bakterie eller inte.
Om det växer bakterier utmed sticket men ej för
övrigt så är bakterien ej rörlig. Har bakterierna
däremot växt ut i mediet är de rörliga.
Indol
H 2S
Tester för påvisande av vissa bakteriearter
Oxidase test (ska spädas nytt varje dag). Reagenset droppas direkt på plattan alternativt
tar man en bakteriekoloni och för över till ett vitt filterpapper som blötts med reagenset.
Pseudomonas, Alcanigenes och Moraxella är exempel på oxidaspositiva bakterier. De får
snabbt en kraftig blåfärgning. Man säger att de är oxidaspositiva eftersom de producerar
ett cytokromoxidas som bryter ner sitt substrat (tetra-metyl-fenylendiamine
dihydroklorid) till en blå produkt. OBS att de bakterier som man hällt oxidas på är döda,
man kan alltså inte odla fram dessa igen.
Katalas. Väteperoxid används för att detektera förekomst av katalas. Väteperoxiden
bildar då syrgas och man kan se att det ”bubblar” om bakterien. 2 H2O2 → 2H2O + O2 .
Testen utförs på objektglas för att försäkra sig om att katalaset kommer från bakterien.
Stafylokocker och Bacillus är exempel på katalaspositiva bakterier. Streptokocker är
katalas negativa.
10
DNA-platta. Plattan innehåller DNA. S. aureus bryter ner DNA (är DNAse positiva) till
skillnad från S. epidermidis och S. saprophyticus. Efter inkubering över natt häller man
på 1M HCl vilket fäller ut DNA och man kan på så sätt urskilja S. aureus från de övriga
Stafylokockarterna. Det bildas en fällning i hela platta förutom runt S. aureus. Dela in
plattan i 4 - 8 delar. Tänk på att även andra arter (ex grupp A streptokocker) kan vara
DNAse positiva.
Klar zon runt utstryket.
Inget DNA har fällts ut.
S. saprophyticus och S. epidermidis
Esculinplatta. Används för att bekräfta enterokockförekomst. De ger en kraftig
mörkfärgning av den annars genomskinliga plattan. Enterokockerna hydrolyserar esculin
till esculetin och dextros. Esculetin reagerar med ett järnsalt, järnammoniumcitrat, och
bildar med detta ett mörkbrunt eller svart komplex. Oxgalla i mediet hämmar andra
Grampositiva bakterier än enterokocker och natriumazid hämmar Gramnegativa
mikroorganismer.
Enterokock
Egg yolk -platta innehåller lecithin (äggula). Om de odlade bakterierna (ex Bacillus cereus)
innehåller lecithinase bildas en mjölkvit fällning runt bakterien.
STREPTEX, Latexagglutination. Antikroppar som reagerar mot gruppspecifika
kolhydrater i streptokockens cellvägg är fästade på latex (små plastkulor) kulor och vid en
positiv reaktion kommer dessa att klumpas ihop, agglutinera. (se bilaga).
Olika ämnen som stimulerar alternativt inhiberar växt av bakterier
Antibiotika i en definierad koncentration finns indränkt i lappar som läggs på ett fast
medium på vilken man har gjort ett utstryk av sin teststam. De antibiotika lappar vi
använder på våra laborationer finns angivna i respektive lab. Tänk på att zonstorleken är
påverkad av bakterietätheten. Gör om till påföljande dag om ni är osäkra.
11
Antibiotika kan även användas för diagnostik av bakterier, bacitracin (zon > 16 mm Streptokocker gr A), novobiocin (< 16 mm S. Saprofyticus), optochin ( > 12 mm pneumokock) och oleandomycin (inhiberar växt av de bakterierna normalt
förekommande i svalg utom H. influenzae) är sådana exempel. Bacitracin och optochin
läggs på streptplatta (eller blodplatta), novobiocin på resistensplattan och oleandomycin
på hematinagarn.
Faktor X, V och XV. Tillväxtfaktorer som krävs av vissa bakterier. X står för hemin och V
för nikotinamiddinukleotid (NAD). OBS att dessa lappar måste läggas på en platta
(resistenplatta, medium A) som i sig inte innehåller dessa ämnen. Testen utförs som
resistensbestämning (se nedan).
Resistensbestämning
Resistensbestämning utförs på bakteriella isolat för att bestämma vilket antibiotika som
är effektivt mot den stam som har orsakat infektionen. Resistensmönster är i vissa fall
även av diagnostiskt intresse (se ovan).
Material: Resistensplatta (medium A), blå ögla, bomullspinnar, sterila rör och steril PBSbuffert, antibiotikatestlappar och venflon-nål
Rör 1. En blå ögla doppas i 5-10 bakteriekolonier (för att få ett genetiskt representativt
underlag). Den uppsamlade bakteriemassan slammas/suspenderas väl i 1 ml PBS-buffert.
Denna suspension ska motsvara McFarland 0,5.
Rör 2. Späd 1/100 genom att ta 10 mikroliter med blå platinös från rör 1 till 1 ml PBSbuffert. Det ger ett inokulat på ca 106 cfu (coloni forming units) per milliliter. Sätt i en
steril bomullspinne och stryk ut. (se figur1). Suspensionen bör användas inom 30 minuter.
Figur 1
Sätt i bomullspinne och stryk ut enl nedan
Kasta
Utodling. Man vill ha en så jämn bakterieväxt som möjligt på hela plattan. Det är viktigt
att man får en lagom tät växt av bakterier. Lagom i det här fallet är en knappt
konfluerande växt eller en nästan heltäckande matta av bakterier. Tänk på att det är en
koncentrationsgradient som bildas runt den antibiotika indränkta lappen. Denna
koncentrationsgradient kommer att vara lika från platta till platta (förutsatt att man följer
de anvisningar som finns från tillverkarna av dessa antibiotika-lappar). Förutsatt att man
12
har en konstant mängd bakterier (knappt konfluerande växt) kan man med zonens
storlek avgöra vid vilken koncentration av respektive antibiotika man har en
bakterieavdödande effekt. Se under medier för vilket medie som ska användas samt bilaga
jäsnings schema.
Utstryk på resistensplatta. I den lösning varifrån utstryket ska göras doppas
bomullspinnen ner. Med vilken man stryker ett kryss (fig 2a) och sedan tvärs över plattan
som i figur 2 b.
Figur 2 a
Figur 2 b
Figur 3
Sätt till sist, med hjälp av en venflon-nål, på en antibiotikalapp av varje sort på plattan.
Fördela lapparna jämt över plattan och låt stå i rumstemperatur i 30 – 60 minuter innan
ni ställer plattorna i 37oC termostat. Figur 3.
Antibiotika lappar (som används i kommande laboration är) för:
G+ Ampicillin, PcV, Erytromycin
G- Ampicillin, Trimethoprim, Mecillinam, Nitrofurantoin
Gramfärgning
Denna färgningsmetod utgör basen för den indelning av bakterier i två
huvudgrupper som skiljer sig med avseende på cellväggens uppbyggnad. Metoden
har fått sitt namn efter den danske bakteriologen Christian Gram som 1884
upptäckte den av en slump. Han skulle utarbeta en färgningsmetod för humana
vävnader och behandlade vävnadssnitt med gentianaviolett och därefter en jodkaliumjodid-lösning (Lugols lösning). När han sedan behandlade med etanol
avfärgades snitten. Emellertid innehöll några av dem också bakterier och Gram fann
att dessa behöll färgen vid etanol-behandling. Senare fann han att det också
förekom bakterier som avfärgades av etanol. Dessa började kallas Gram-negativa till
skillnad från de bakterier som behöll färgen och kallades Gram-positiva.
Hur denna skillnad i färgningsreaktion uppkommer är inte helt klart men den
orsakas av den grundläggande skillnaden i struktur mellan Gram-positiva och
Gram-negativa bakteriers cellväggar. Ett färg- (oftast kristallviolett) jodkomplex
bildas inne i bakteriernas cellvägg och kan extraheras från Gramnegativa bakterier
13
med organiska lösningsmedel (oftast alkohol eller alkohol-aceton lösning). Grampositiva bakteriers peptidoglycanrika cellväggar dehydratiseras vid behandling med
dessa lösningsmedel. Detta får cellväggens porer att sluta sig och gör att färgjodkomplexet ej kan lösas ut utan stannar kvar och den Gram-positiva bakterien
färgas därmed blå av kristallviolett-jodkomplexet. Gramfärgning inkluderar numera
även en kontrastfärgning med rött, t.ex. karbolfuksin eller safranin, efter
alkoholbehandlingen. De Gram-negativa bakterierna blir då röda av kontrastfärgen
till skillnad från de blå Gram-positiva.
Kocker i hopar, kedjor och par.
Feta, stora, smala, små eller kockoida stavar
Exempel på Utförande Gramfärgning (se även bilaga för Gramfärgnings metodik)
Material:
Kristallviolett i droppflaska (A), Lugols lösning i droppflaska (B), Aceton-alkohol i
droppflaska (C), Karbolfuksinlösning i droppflaska (D).
0,9 % NaCl, blå ögla, objektglas, tidtagarur, brännare
Hushålla med lösningarna. Akta händer, kläder och bänkar. Torka ur diskhon
ordentligt efteråt. Om nödvändigt använd lite av aceton-alkohol lösningen för att få
bort färgen.
1. Placera med hjälp av den blå öglan en "droppe" fysikalisk koksaltlösning (för
varje koloni som ska infärgas) på ett objektglas. Objektglaset kan delas in i 6 fält.
Märk med blyerts på den mattade delen.
2. Ta en aning bakteriemassa med en ögla (den mängd ni tagit ska nätt och jämt bli
synlig på glaset) och lägg bredvid droppen. Rör sedan ihop bakterien och
koksaltdroppen. Dropparna ska inte bli synligt grumliga. Lufttorka preparatet
och fixera preparatet genom att försiktigt föra objektglaset, med bakteriesidan
uppåt genom en brännares låga. (OBS kokta bakterier ändrar form)
3. Täck bakterierna med kristallviolett (A-lösning) och låt verka i 30 sek. Skölj med
vatten.
4. Täck bakterierna med Lugols lösning (B-lösning) och låt verka i 30 sek. Häll av
lösningen. Skölj med vatten.
14
5. Avfärga med aceton-alkohol (C-lösning) 30 sek. Skölj med vatten
6. Täck bakterierna med karbolfuksin (D-lösning) och låt verka i 30 sek. Skölj
ordentligt med vatten. Låt preparaten lufttorka.
7. Läs av i mikroskop. 100* lins. Använd immersionsolja. Tvätta av mikroskopen med
xylen och rispapper efter kursen.
Andra infärgningsmetoder
Acridiniumorange infärgning. Acridiniumorange interagerar med ds-DNA och
fluorescerar med en orange färg, vilket gör det lättare att visualisera bakterier i preparat.
Utförande se gramfärgning punkt 1- 4 täck sedan preparatet med acridiniumorange och
låt stå en minut. Skölj med vatten och låt preparaten luft torka. Avläs i UV-mikroskop.
FA - färgning. Färgning med fluoroscein iso thio cyanat inmärkta antikroppar. Används bl
a till identifiering av virus t ex influenzae. Följ de anvisningar som följer med den
inmärkta antikroppen. Avläses i UV-mikroskop.
15
PCR-metoden
PCR metoden går ut på att göra stora mängder av en utvald bit DNA. En stor mängd DNA
är ex. lättare att detektera, det är också mycket lättare att klona en sekvens/gen som man
har många kopior av. PCR reaktionen masstillverkar den specifika DNA sekvensen in vitro
(i provrör) i princip genom att härma själva DNA replikationen exponentiellt ca 20-30
ggr. För att reaktionen skall kunna fungera blandas bla joner som Mg2+, nukleotider, ett
värmestabilt DNA polymeras, och vanligtvis två korta enkelsträngade DNA sekvenser som
brukar kallas primer. Detta primerpar gör att DNA polymeraset får en fri 3´-ände att
starta sin syntes ifrån. Dessa primers måste vara noga utvalda så att de fäster specifikt till
varsin ände på den utvalda DNA sekvensen.
PCR reaktionen är extremt känslig eftersom den teoretiskt kan upptäcka en enda kopia av
en gen/DNA sekvens. Den går också mycket snabbt genom att tillverkningen är
exponentiell. Men för att varje DNA bit skall kunna användas på nytt som mall i varje
syntes steg så måste DNA dubbelsträngen göras enkelsträngad så att nya primers kan
fästa. I PCR reaktionen görs detta genom en temperatur höjning som är så hög att DNA
dubbelsträngarna inte kan hålla ihop längre (ca 95oC), man brukar kalla detta steg kort
och gott denaturerings steget. Därefter sänks temperaturen till lämplig nivå så att
primerparet bara fäster på sekvenser som stämmer överens i basparning, detta steg kallas
annealing steget. Efter annealing steget höjs ofta temperaturen, till ca 72oC, detta steg
kallas extensionsteget och är till för att varje DNA dubbelsträng ska hinna bli färdig
syntetiserad i varje cykel.
*Något mer om PCR reaktionens 3 temperatur steg.
1. denaturering (mha värme ca 95oC i tex 20 sekunder) strängarna i det dubbelsträngade
DNA´t separerar. En för kort denaturering gör att denatureringen blir ofullständig och vi
får mindre produkt. DNA polymeraset som används i PCRen är ett Polymeras som
ursprungligen isolerats från en bakterie som lever i heta källor Thermus aquaticus, därav
namnet Taq-polymeras. Taq-polymeraset har sitt temperatur optimum runt 72oC och tål
därför PCRens höga temperaturer. En för lång denaturering gör dock att enzym aktivitet
går förlorad.
2. annealing, överskott av två kemiskt syntetiserade oligonukleotider/korta
enkelsträngade DNA molekyler (primers) som skall fungera som start för DNA
polymeraset finns i blandningen dessa är vanligen 15-28 nt långa och binder till vardera
änden av fragmentet som skall massproduceras.
Det är bra om G/C innehållet i en primer inte överstiger 60%, att primerparet inte har 3´komplementaritet. Det är inte heller bra om primers kan bilda sekundära strukturer.
Vidare så bör smältpunkt temperaturen för båda primers bör vara så lika som möjligt för
att deras optimala annealing temperatur skall vara den samma. Se PCR handboken för att
ta reda på vilken primer koncentration som är rimlig. En alltför hög koncentration ökar
risken för att primers ska binda på fel ställe. Framförallt är det baskompositionen (vilka
nukleotider) och längden på en primer som påverkar annealing temperaturen (antal G
eller C x 4 oC + antal A eller T x 2 oC = den ungefärliga smält temperaturen). Men även
16
koncentrationen joner som K+, Na+, Mg2+ och ämnen som ex. glycerol, formamid el dyl. i
bufferten påverkar vilken annealing temperatur man ska använda. Man får också tänka på
att den valda annealing temperaturen påverkar både specificiteten och sensitiviteten. En
så stringent annealing temperatur som möjligt (dvs en temperatur så nära smältpunkten
som möjligt) ökar specificiteten (ibland på bekostnad av att sensitiviteten sjunker). Läs
mer om specificitet och sensitivitet nedan.
3. extension, den optimala temperaturen för DNA polymeraset är som sagt ca 72oC vid
denna temperatur inkorporereas 35-100 nukleotider/sekund. Längden och
koncentrationen på target (mål) sekvensen och temperaturen bestämmer extensions
tiden.
PCR reaktionen bygger som sagt på att man upprepar punkt 1-3, vanligen upprepas
antalet temperatur cykler 20-30 ggr. För många cykler gör att antalet ospecifika
bakgrunds produkter ökar och ett för lågt antal cykler gör att produkt utbytet blir lågt.
*Några problem i PCR reaktionen; Kontamination. Primer-dimer. Nukleotid
felinkorporeringer. Icke specifika bakgrunds produkter pga ospecifik inbindning av
primers.
För att förhindra kontamination av tidigare amplifierade PCR produkter så delar man ofta
in de olika momenten, preparering av prov (patientprov eller vad det kan vara),
blandning av rena reagens, tillsatts av prov och detektion eller analys av PCR produkter,
(mer om detta kommer nedan vid ”Försiktighetsåtgärder vid användning av PCR”).
Enzymet Taq-polymeras ett värmestabilt enzym men så snart man blandat alla reagens så
kan polymeraset börja Jobba. Det största problemet uppstår om primrarna fäster på
varann (vilket de har möjlighet att gör vid rumstemperatur) och Taq-polymeraset börjar
polymerisera ändarna, vilket ger sk. primer-dimer. Men med de nyare sk ”hot start
polymerasen” (ex. amplitaq-gold) som kräver att de hettas upp till 95oC innan de blir
aktiva så har man dock lyckats komma ifrån problemet. Har man inget sådant enzym så
är det viktigt att försöka jobba smidigt och snabbt, eventuellt kan man förvara proverna
på is från det att man pytsar mastermixen till det att man sätter i rören i PCR apparaten.
Man kan också behöva komma ihåg att Taq polymeraset saknar 3´ till 5´exonukleas
aktivitet därför sker ett visst mått av nukleotid felinkorporering (att fel bas sätts in).
Därför är det viktigt att man använder speciella Taq polymeras med proofreading
aktivitet inbyggd då PCR används för tex kloning.
Framförallt är det ospecifik inbindning hos primer tex pga för låg annealing som ger icke
specifika bakgrundsprodukter.
17
*Något om PCR optimering;
Taq polymeras 0.5-5 unit /100 µl reaktion. För hög koncentration kan ge ospecifika
bakgrunds produkter. För låg koncentration ger lågt utbyte av önskad produkt.
Deoxiribonukleotidfosfat (dNTP) 20-200mM av varje nukleotid per reaktion är rimlig,
en högre koncentration eller en ojämn koncentration av de fyra dNTPerna ger lätt
missinkorporeringar.
Joner. Mg2+ är mycket viktig för att taq-polymeraset skall fungera, dess aktivitet och
noggrannhet påverkas. Vidare påverkar envärda joner som K+och Na+ men också Mg2+
primer annealing, sträng dissosieringstemperaturen, produktspecificiteten och
primerdimer formation. Koncentrationen Mg2+ ligger vanligen mellan 0.5-2.5 mM per
reaktion.
Stimulatorer- Ex. gelatin 100mg/ml. Bovintserumalbumin (BSA) 100mg/ml. Tween 20,
NP-40, laureth 0.05-0.1 %. Glycerol <20%. <1% Dimetylsulfoxide (DMSO).
Inhibitorer- >1% DMSO och >0.01% SDS hämmar PCR reaktionen – åtgärd späd provet. I
patient prover ex saliv så kan för mycket polysaccarider hämma - åtgärd koka provet. I
urin finns urea - späd, dialysera eller gör en DNA extraktion för att få bort detta. Faeses
innehåller billirubin etc. som troligen hämmar och en massa annat - åtgärd extrahera
DNA. Plasma med Na+/Mg2+ - åtgärd minska Na+/Mg2+ i bufferten. Serum med heparin
- åtgärd minska K+, Serum med EDTA - åtgärd minska K+, Na+ öka Mg2+, Serum med
Citrat - åtgärd öka K+,Na+, Mg2+.
*Några PCR applikationer;
Diagnostik, kloning, HLA-typning, evolutions-studier, forensics (Brottsmål).
*Några PCR varianter;
Nested PCR = Två PCR reaktioner körs. Vid den första PCR reaktionen används ett
primerpar (ytter primerpar). Denna reaktions produkt används som templat (provsekvens
dit primers kan binda) i den andra PCR reaktionen. Den andra PCR reaktionen körs med
ett primerpar (inre primerpar) som binder innanför det yttre primerparet.
Semi-nested PCR = Som ovan fast i andra PCR steget används en ny primer tillsammans
med den ena gamla.
RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA analysis. Slumpmässsiga primer/primers
(oftast korta ) används i PCR för att kunna studera skillnader i genom-strukturen
”fingerprint mönster”, mellan olika individer eller organismer. Flera regioner amplifieras.
18
Multiplex PCR = Två eller flera regioner amplifieras. Vilket gör att man tex. Kan
detektera flera olika bakterier i en och samma PCR körning.
Realtids-PCR = RT-PCR, här finns en nästintill oändlig möjlighet att märka in DNA och
man kan tex kvantifiera och detektera flera olika sekvenser samtidigt. Detektionen av
bildat DNA sker simultant (samtidigt) som syntesen sker mha dataanalys .
PCR primer-riktad mutagenes = Degenererade primers används för att introducera nya
DNA sekvenser.
*Försiktighetsåtgärder vid användning av PCR
Det är mycket viktigt speciellt för ett rutin laboratorium som använder sig av PCR för
diagnostik, att förhindra spridning av amplifierade PCR-produkter. Detta kan annars leda
till falskt positiva analys resultat. Det finns flera metoder som bygger på att amplifierat
DNA´t efter eller före detektion på något sätt förstörs men ingen av dessa metoder kan
använda sig av då man har en nested PCR. Man får istället vidta stor noggrannhet vid
hanteringen, från det att man får patient provet, till analysen av resultat. Separata
avdelningar, separata kläder, handskar och stor noggrannhet är A och O.
*Något om specificitet och sensitivitet
Med sensitivitet menas ungefär hur känsligt ett test är, tex en hög sensitivitet gör
att andelen falskt negativa test resultat sjunker (1-sensitiviteten = andel falskt
negativa).
Med specificitet menas ungefär hur noggrant ett test är, tex en hög specificitet gör
att andelen falskt positiva sjunker (1-specificiteten = andel falskt positiva).
Man kan också säga så här sensitiviteten= antal med sjukdom och med positivt prov svar
/dividerat med totalantal med sjukdom som testats.
Och så kan man säga så här om specificiteten= antal utan sjukdom och med negativt prov
svar /dividerat med totalantal utan sjukdom som testats.
Om ett tests sensitivitet eller specificitet är viktig beror naturligtvis på vad det är man
skall detektera. Tex så vill vi ju att ett diagnostiskt test för HIV skall ha så hög sensitivitet
som möjligt. Men det är kanske mindre viktigt med sensitiviteten då man skall
diagnostisera L.pne. Eftersom man inte kunnat påvisas att L.pne smittar mellan
människor och eftersom det är dumt att behandla med antibiotika i onödan så borde man
använda ett test som prioriterar specificitet framför sensitivitet då man ska diagnostisera
L.pne.
19
Bakterien Legionella pneumophilia
Legionella pneumophilia (L.pne) är en Gramnegativ stavformad bakterie. L.pne finns ute i
naturen i våra sjöar och vattendrag men bakterien kan också växa till tex i våra
luftfuktare, varmvattenberedare och rörsystem, tack vare sin stora temperatur tålighet.
L.pne kan överleva lång tid i temperaturer mellan 4oC-60oC, men tillväxer endast i
temperaturer mellan 25oC-45oC, med ett temperatur optimum mellan 35oC -37oC.
Eftersom L.pne kan infektera människor så är det därför viktigt att vattnet tex i våra
duschar är tillräckligt upphettat och att man tex klorerar vatten där upphettning inte kan
användas.
L.pne fagocyteras in i makrofager och monocyter i lungornas alveoler, där växer dom till
och sprider sig så småningom till andra celler. L.pne kan ge upphov till två olika
sjukdomar Legionärssjukan och Pontiac feber. Symptomen på legionärssjuka kommer
efter 2-10 dagar med inflammation i lungorna, hög feber, huvudvärk och ont i magen.
Pontiac feber liknar mer en allergisk reaktion och ger inte lunginflammation. Det är
framförallt immunsupprimerade patienter (patienter med nedsatt immunförsvar) som
drabbas men även personer med kronisk bronkit, emfysem etc. är utsatta. Det har också
visat sig att en stor del av befolkningen har legionella antikroppar vilket kan tyda på att
många haft en asymptomatisk infektion.
En metod för att detektera Legionella Pneumophilia är odling på agarplatta, metoden tar
dock lång tid. Det vanligaste odlingsmediet som används är Charcoal Yeast Extract (CYE)agar med tillsats av cystein och järn joner. Eftersom L.pne växer upp mycket sakta så
tillsätts också antibiotika till odlingsmediet för att hämma andra bakteriers tillväxt.
Provet som tas på patienten kan vara tex. bronksköljvätska (BAL) eller sputum. Om
odling görs på vatten på lab som tex AL-kontroll måste i regel vattnet filtreras genom ett
filter med porstorleken 0.2µm, filtret läggs sedan i destillerat vatten och vortexas så att
bakterierna lossnar.
Övriga metoder som används för detektion är tex direkt immunofluorescens med
monoklonala antikroppar mot Legionella, lösliga antigen kan också detekteras med RIA
(radio immuno assay) eller EIA (enzyme immuno assay).
Och sist men inte minst så har vi PCR metoden för detektion av L.pne. Många har tagit
fram primers för detektion av L.pne DNA, vilket innebär att det finns olika PCR
reaktioner som detekterar olika delar av DNA´t eftersom det handlar om olika primers.
Vidare så finns det både enkla, seminestade och nestade PCR system för detektion av
L.pne, de nestade systemen är mer noggranna (specifika) och ofta mer känsliga
(sensitiva).
20
Laboration v.40
Metoder för kvantifiering av bakterier
Uppgift
Vid laborationen ska de olika faserna av bakteriers tillväxt visas genom att två tillväxtkurvor
görs. Den ena ska visa OD600 mot tiden medan den andra ska visa bakteriekoncentrationen mot
tiden. Baserad på dessa kurvor ska bakteriesuspensionen spädas till lämplig koncentration och
odlas ut på platta. Kolonierna räknas sedan nästa dag och en jämförelse görs med det antal
kolonier som växer och det antal som förväntades växa.
Bakteriens generationstid samt den bakteriekoncentration som motsvarar 1 OD600 skall också
beräknas.
Materiel
Materiel som erhålls:
Mikroskop
Bürker räknekammare
Racklor
Petriskålar
E.coli i LB-medium
Materiel som ska göras:
LB-plattor (6 plattor/pers)
100 ml LB-medium i steril 250 ml E-kolv (1 kolv/grupp)
Recept för LB-medium
NaCl 171 mM
Trypton 1% (w/v)
Jästextrakt 0,5% (w/v)
pH ställs till 7,4 med HCl & NaOH
Recept för LB-plattor
NaCl 171 mM
Trypton 1% (w/v)
Jästextrakt 0,5% (w/v)
Agar 1,5% (w/v)
pH ställs till 7,4 med HCl & NaOH
Till varje platta går det åt 30-35 ml.
21
Utförande
Dag1
LB-medium/plattor görs.
En 250 ml E-kolv med 100 ml LB-medium autoklaveras.
Lösningen till plattorna autoklaveras i flaska innan den hälls upp i petriskålarna.
Tänk på att inte starta autoklaven förrän alla grupper har ställt in sina lösningar i autoklaven!
Dag2
Blanda övernatt kulturen väl och ympa 1ml av denna till E-kolven med 100 ml LB-medium.
Placera E-kolven i skakinkubator vid 37°C.
Tag ut prover (ca 2 ml) med steril pipett och överför till sterilt 15 ml Falconrör, sätt på is. Prover
tas var 30:e minut (exakt tid noteras vid varje provtagning). Fortsätt provtagningen i minst 4
timmar vilket ger minst 9 prover totalt.
Mät provernas turbiditet genom att mäta den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) med en
spektrofotometer. Om OD600 överstiger l,0 späds en del av provet så att OD understiger 1,0 ex.
1:4 med LB-medium. Som referens och blank används LB-medium.
Turbiditeten är proportionell mot den totala cellkoncentrationen, men proportionalitetskonstanten
beror på typ av celler, tillväxtbetingelserna och på typen av spektrofotometer som används. I
detta moment bestäms den relationen mellan den totala cellkoncentrationen och A600 för E. coli
JM109 vid tillväxt i LB-medium.
Räkna samtliga prover i Bürker. Om du tycker att bakterierna ligger för tätt så späd med LBmedium tills du tycker att bakterierna ligger lagom tätt. OD600 över 0,4 uppfattas ofta som
väldigt tätt.
Späd en del av suspensionerna med LB-medium så att en celltäthet på 1000-3000 celler per ml
erhålls (utgå från beräknade celltätheter från föregående moment) genom att göra en lämplig
spädningsserie. Utgå från 3 olika prover med olika bakteriekoncentration (låg, medel, hög).
Sprid l00 µl av den spädda suspensionen noggrant på LB-agarplatta med en rackla. Placera
plattorna med locken nedåt i 37°C över natt.
22
Gör dubbelprover på plattan. Odla alltså varje spädning på 2 olika plattor och ta medelvärdet av
antalet kolonier.
Dag3
Räkna antalet kolonier på LB-agarplattorna och beräkna antalet cfu/ml för den ursprungliga
ospädda cellsuspensionen.
Rita diagram med logaritmerna för totalantalet cfu/ml och OD600 som funktion av tiden för
odlingen.
Beräkna generationstiden (tiden det tar för antalet celler att fördubblas) med hjälp av nedstående
formler. Beräkna också hur många bakterier som motsvarar 1 OD600.
Beräkning av generationstiden
De flesta bakterier förökar sig genom enkel delning enl:
1→2→4→8→→→2
n
Om n=antalet generationer, N=antal bakterier, N0= antal bakterier från början av log-fasen, fås
följande ekvation:
N = N 0 ⋅ 2 n - exponentiell tillväxt
g=
t( N − N0 )
n
g= generationstiden, t= tid (min av exponentiell tillväxt)
Examination:
Muntlig examination, samt labrapport.
För labrapport se instruktioner nedan ”Hur skrivs rapporten?”
23
Praktisk examination
25 µl och 100 µl LB-medium eller vatten pipetteras 10 gånger vardera och vägs. Medelvärde,
standardavvikelse och CV beräknas.
För betyget Godkänd krävs en variationskoefficient (CV) på högst 2 % för 25µl och 1 % för
100µl.
x=
s=
∑ xi
medelvärde
n
1
( xi − x ) 2
∑
n −1
CV = 100 ⋅
s
x
standardavvikelse
variationskoefficient
24
25
Bürker räknekammare
26
27
Hur skrivs rapporten?
Sammanfattning
Här skrivs en sammanfattning där rapportens alla delar finns representerade (oftast ej ref). Skrivs
ofta sist.
Inledning
Här presenteras ämnesfältet. Ge en bakgrund till varför man vill veta bakt.konc i olika
sammanhang. Inte bara vid sjukdomar. Om bakteriers tillväxt. Tillväxtkurva och faser. Ange
referenser!
Material & metod
Vad gjordes och hur?
Redogör för odlingsmediet. Vilken bakterie användes och hur följdes den?
Vilka rutor i Bürker användes?
Hur gjordes konc och OD uträkningen?
Hur beräknades generationstiden? Formler redovisas.
Resultat & Diskussion
Här redovisas resultaten och de sätts in i ett sammanhang. Vad betyder de? Ange referenser!
Diskutera alternativa sätt att göra det ni har gjort. Andra sätt för att beräkna generationstid och
omvandlingsfaktor (OD600 till cfu/ml) mha kurvorna. Hur korrelerar OD600 och Bürker
räkningarna till varandra? Här redovisas kurvor eller i bilaga. Diskutera problem som uppkomit
vid de olika metoderna. Är det någon metod som är mer eller mindre pålitlig?
Om resultat & diskussion delas upp i två egna delar ska resultatet enbart innehålla resultat och
ingen diskussion.
Resultatet redovisas gärna i tabeller och figurer, men förklarande text måste finnas med.
Tabeller och figurer får aldrig finnas utan tabell- (över) och figur- (under) texter.
I brödtexten måste hänvisningar till tabeller & figurer finnas.
Referenser
Numrerad lista efter när de dyker upp första gången i texten.
28
Exempel på hur referenser kan skrivas i referenslistan:
Artikel
1. Clynes R.A. Towers T.L. Presta L.G. Ravetch J.V. (2000) Inhibitory Fc receptors
modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med. 6:443-446.
Bok
2. Lundblad R.L. (1995) Techniques in protein modification. CRC press: Boca
Raton, FL. USA.
Kapitel ur bok
3. Filpula D. McGuire J. Whitlow M. (1996). Production of single-chain Fv
monomers and multimers. In Antibody Engineering. (McCafferty J. Hoogenboom
H.R. Chisell D.J. eds) pp. 255, IRL press, Oxford.
Web-adress
4. Antibody resource page.
www.antibodyresource.com
Datum
Bilaga
Kurvor kan tänkas ligga i en bilaga. Pipettereingsuppgiften kan läggas i en bilaga, eller bara
medhäftad. Om bilaga finns måste hänvisning till denna finnas någonstans i rapporttexten.
För godkänt måste följande redovisas:
•
•
•
•
•
•
Kurvor för OD600 & cfu/ml
Beräkningen från Bürker till Cfu/ml
Beräkning av generationstiden
1 OD600 ≈ X Cfu/ml
Cfu/ml baserat på viable count, samt hur spädningsserien är gjord
Ange ytterligare ett sätt (än de ni använt under laborationen) att kvantifiera bakterier
29
Laboration v.41
Detektion av Legionella pneumophilia med nestad
PCR
Frågeställning: Vattenlednings system med tillväxt av Legionella pneumophilia eller
Patient med misstänkt Legionella pneumophilia infektion=>
Isolering av Bakterien Legionella pneumophilia. Provtagning; vattenprov med
filtrering eller BAL alt sputum prov) =>
Preparering av Legionella pneumophilia DNA=>
Amplifiering av DNA;
PCR steg 1 =>
PCR steg 2 =>
Detektion av amplifierat Legionella pneumophilia DNA på agarose gel.
Enzymatisk amplifiering mha PCR av specifika sekvenser för detektion av bakterier, virus
eller parasiter är en mycket användbar metod, speciellt i de fall där odling, serologi etc
visat sig vara otillräckliga och/eller långsamma.
I laborationen har vi valt att detektera Legionella Pneumophilia (L.pneumophilia) mha
PCR. För att öka specificiteten och sensitiviteten så har vi valt att använda en PCR som
bygger på amplifiering i två steg med två olika primerpar, en sk nested PCR. Den nestade
PCRen för detektion av L.pneumophilia är utformad så att det första PCR steget
amplifierar en region som är ca 625 bp i 30 cykler. 1/50 (1µl ) av produkten från denna
första amplifiering tas därefter ut till ett ytterligare PCR steg, i detta andra steg
amplifieras i 30 cykler en region (inom det 625 bp fragmentet) som är ca450 bp. Storleken
på de nestade PCR produkterna analyseras därefter på en EtBr inmärkt agarosgel (även
PCR produkterna från PCR reaktionens första steg kan analyseras på gel, det kan ibland
ge en indikation om koncentrationen bakterier i ursprungs provet var högt eller lågt).
Man kan också detektera PCR produkterna på andra sätt än på gel tex. Mha dot-blot och
ELISA men i båda dessa detektionssätt behövs en sk probe en enkelsträngad DNA
sekvens som fångar upp PCR produkter (som först måste göras enkelsträngade).
30
Den nestade PCR´n ökar som sagt specificiteten men också sensitiviteten till viss del
eftersom amplifieringen totalt körs 60 cykler och detta hade inte varit möjligt med ett
enda primerpar det hade ökat icke specifika bakgrunds produkter.
Inom de amplifierade fragmenten finns också ett restriktions-site, som kan användas för
att ytterligare verifiera att det är rätt DNA fragment dvs sannolikheten ökar ytterligare att
det verkligen är L.pne patienten har. Detta ska dock vi inte göra i denna lab.
Laborations utförande Dag 1-Dag2:
1.)DNA preparation av L.pneumophila bakterier.
Varje grupp skall analysera minst ett positivt och ett negativt prov.
DNA preparationerna skall göras i ”provpreparerings/provtillsats-rummet” (gör i ordning
en dela av eran bänk yta som är avsatt för detta). Vi ska använda oss av ett kit från
QIAGEN (DNeasy tissue kit ) se separat beskrivning (DNeasy Tissue Handbook) finns på
nätet och på kurshemsidan. Med hjälp av denna beskrivning ska ni själva ta fram
metoden för ”framrening av DNA från Gram negativ bakterie”.
2.)Koncentration och renhetsmätning i spektrofotometer
På DNA´t som ni renat fram med DNeasy tissue kit ska en ungefärlig koncentration och
renhet bestämmas i spektrofotometer vid 260 respektive 280 nm. Mätningen sker i quartz
kyvett. En del av det framrenade provet tex 1/5del spädes med vatten till en volym på
500µl. Nollställ spektrofotometern med vatten och mät vid 260 respektive 280 nm. Vid
260 nm absorberar nukleinsyra (DNA och RNA) ljuset, ett absorberat värde 1 motsvarar
en koncentration på ca 50 µg/ml. Räkna ut vilken koncentration nukleinsyra du har i ditt
(ospädda) prov. Vid 280 nm absorberar vissa aminosyror (de aromatiska) ljus värdet vid
280nm kan därför ses som ett mått på mängden protein, genom att ta kvoten på värdet
vid 260 nm genom värdet vid 280 nm så får man en uppskattning om renheten (mängden
nukleinsyra i förhållande till mängden protein). I DNA tissue kit hittar ni en hel del tips
som ni kan använda vid koncentrations och renhets mätning och tolkning.
3.)PCR förberedelser. Läs informationen i ”Taq PCR Handbook” innan du ”sätter
upp”/startar dina PCR reaktioner. Ta reda på vad en mastermix är (se nedan) och
vad syftet med denna är. Fundera över om man kan pipettera 1 mikroliter (µl)
exakt?
Innan ni börjar blanda mastermix (reagensen till alla PCR reaktionen) måste ni ,
för att undvika kontamination, organisera de olika rummen (bänkytorna) för
blandning av rena reagens och provtillsats renat DNA och PCR produkt steg 2.
31
4.)PCR steg 1, reagens ”Tag PCR core kit”
I PCR steg 1 används primers Lmip 920 (5´-GCT ACA GAC AAG GAT AAG TTG-3´) och
Lmip 1548 (5´-GTT TTG TAT GAC TTT AAT TCA-3´).
I ”rena reagens rummet” blandas PCRens reaktions mix den sk ”master mixen” .
Volymerna per prov är följande; 24.7 µl vatten, 5 µl 10x PCR buffert, 6 µl Mg 2+ (25 mM), 2
µl dNTP-mix (10mM vardera av dATP, dTTP, dGTP dCTP),1µl primer Lmip 920 (50 µM), 1
µl primer Lmip 1548 (50 µM) och 0.3 µl Taq-polymeras (5 unit/µl).
Mängderna ovan är angivna för ett prov om fler prov ska analyseras ex. 3 så blandas ca 3.2
gånger mängden av allt (annars räcker det oftast inte, eftersom det blir ett svinn i rör och
pipett tipp), detta mixas noga och pytsas upp på 3 rör (i detta fall 40 µl till varje rör) för att
få exakt samma proportioner av alla de ingående reagensen (detta är annars svårt att få när
man pipetterar så liten mängd av så många olika saker).
Rören med ”master mix” tas sedan till ”provpreparerings/provtillsats-rummet ” där 10 µl
prov (legionella DNA eller vatten) tillsätts.
Proven placeras i PCR apparaten och körs i ett program med följande temperaturer och
tider; 94oC i 15 minuter, 30 cykler i 94oC i 30 sek., 50oC i 30 sek., och 72oC i 60 sek..Och
slutligen 72oC i 6 minuter.
5.)PCR steg 2, reagens ”Tag PCR core kit”
I PCR steg 2 används primers Lmip 976 (5´-TAA AAA TCA AGG CAT AGA TG -3´) och
Lmip 1427 (5´-AGA CCT GAG GGA ACA TAA AT -3´).
I ”rena reagens rummet” blandas ”master mixen” , volymerna per prov är; 33.7 µl vatten, 5
µl 10x PCR buffert, 6 µl Mg 2+ (25 mM), 2 µl dNTP-mix (10mM vardera av dATP, dTTP,
dGTP dCTP),1 µl primer Lmip 976 (50 µM), 1 µl primer Lmip 1427 (50 µM) och 0.3 µl Taqpolymeras (5 unit/µl).
Rören med 49 µl ”master mix” tas sedan till ”provtillsats-rummet nestade-steget” där 1µl
av PCR produkterna från steg 1 överförs till respektive mix.
Proven placeras i PCR apparaten GenAmp PCR System 2400 och körs i ett program med
följande temperaturer och tider; 94oC i 15 minuter, 30 cykler i 94oC i 30 sek., 55oC i 30
sek., och 72oC i 60 sek.. Och slutligen 72oC i 7 minuter.
32
6.) Analys av storlek på PCR produkter och koncentration/renhet på det framrenade
DNA´t på agarosegel
Blanda TAE-buffert (Tris-acetat-EDTA) så att det räcker till en gel och ett litet geltråg
(det går åt ca 300 ml totalt). Recept på TAE-buffert hittar ni på nätet eller i Manniatis.
Gjut en 1.5% agarosgel (vikt/volym%). Använd dom små gelhållarna som rymmer ca 40
ml gel. Tag rätt mängd agaros och blanda med TAE-buffert, lös upp agarosen genom att
koka blandningen i mikrovågsugn. Lösningen är färdig kokt då den är helt genomskinlig.
Låt sedan lösningen svalna till 55oC (bäst att använda vattenbad) tillsätt då 2 µl EtBr
(ethidiumbromid 10 mg/ml). Tejpa kanterna på gelhållaren och se till att den står plant.
Häll i gelen (ca 5 mm hög) och sätt i 2 kammar (med breda tänder). OBS! då ni häller
gelen får den inte vara kallare än 50oC, häll den därför direkt efter att ni tillsatt EtBr och
blandat försiktigt. Låt svalna i rumstemperatur och ställ sedan gelen i kylen minst 10
minuter innan ni tar ur kammarna. Om gelen inte skall användas direkt så förvara den
inslagen i gladpack i kylen.
PCR produkterna från steg 1 och 2 tas från kyl till ”amplifieratmaterial rum”. Här blandas
15 µl av varje PCR produkt med 3 µl färglösning (BPB) på en bit parafilm innan det
pipetteras på gelen. Av molekylviktsmarkören tas 5 µl den sätts någonstans i mitten på
varje gel rad. Vilken storlek har banden i molekylviktsmarkören? Försök hitta detta på
nätet. Firma och namn på molekylviktsmarkören står på rörets etikett dessa kan ni
använda som sökord på nätet.
Gelelektroforesen körs vid 50-75 V i ca 80 minuter (det negativt laddade DNA´t vandrar
mot den positiva polen), därefter placeras gelen på UV bordet och fotograferas. Resultatet
analyseras. I labrapporten skall gelen beskrivas så noga som möjligt. Mha MW-markören
får ni reda på om storleken på PCR produkterna verkar stämma.
Examination av ”Legionella PCR laborationen” sker genom lab rapport
Hur skrivs denna rapport?
Labrapporten ska vara skriven på dator och innehålla;
TITELSIDA. Med laborationstitel, Laborantens namn, laborationsdatum och handledare.
Försätts blad finns som separat fil på kurshemsidan.
SAMMANFATTNING. Mycket kort inledning, sammanfattning över vad som gjorts och de
viktigaste resultaten samt de slutsatser man kommit fram till (alltså egentligen en mycket
kortfattad version av inledning, material och metod, resultat och diskussion)
INLEDNING Allmänt om bakterien, medicinsk bakgrund, syfte med patientprovtagning
respektive vattenprovtagning. Principerna för PCR metoden, DNA preparations metoden
(reagensen i qiagen kitet- beskriv deras betydelse/funktion), spektrofotometermätning och
33
gelelektroforesmetoden. Problemställning och avsikt med laborationen ska också finnas med här
(helst sist i inledning).
MATERIAL OCH METOD. Beskrivning av vad som gjorts vilket material och vilka metoder
som använts, beskriv i stora drag med egna ord (dvs skriv inte av labhandledningen), volymer är
tex oftast inte intressant att få veta om man inte vet koncentrationen. Ta med avvikelser från
metodbeskrivningen och uträkningar.
RESULTAT. Beskriv resultatet i en löpande text samt figur för gel och tabell för
spektrofotometer resultatet. Börja helst inte resultatet med att smacka dit figur eller tabell, utan
börja med någon/några inledande meningar. Koncentration och renhet på det framrenade DNA´t
ska som sagt finnas med. Gel fotografiet (som är erat absolut viktigaste resultat) beskrivs i detalj,
varje brunn som visas skall vara numrerad och fotot skall ha en figur text. Mha MW-markören
”track it” om det är den ni använt 0.1 µg/µl (storlek på banden: 2652, 800, 700, 600, 500, 450,
400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50) får ni reda på om storleken på PCR produkterna verkar
stämma. Rita en kurva på molekylviktsmarkören, med vandringssträckan från brunn till band i
cm på x-axeln och antal baspar i de olika banden på y-axeln. Mät sedan era PCR produkter hur
långt de vandrat i cm, gå sedan in på kurvan och se hur många baspar det motsvarar. Försök att
uppskatta om koncentrationen bakterier i provet var högt eller lågt beroende på om ni kan se
band i PCRens steg 1. Hur ser gelen ut i övrigt? Är molekylviktsmarkörens band tydliga? Är det
tex klara tydliga band på det positiva provet? Eller kan man tex se ljusa släpspår (sk smear) på
gelen? Är den negativa kontrollen helt ren? Har primerparet bildat primer dimer så kan man se
det ganska långt ner. Ibland om man haft lite för hög koncentration av primers kan man se
ljusare partier ytterligare lite längre ner.
UPPSKATTA KONCERNTRATIONEN framrenat DNA VISUELLT på gelen (mha MW
markören) och jämför med koncentrationsbestämningen i spektrofotometern. Ex. på hur man kan
göra, använd figur X brunn 14 (framrenat DNA) och brunn 16 (MW-markör, totalt har 2 µl av denna
markör à 0.5 µg/ml satts på gelen dvs totalt 1 µg, i texten på samma gel finns antal band i denna markör
samt hur många baspar varje band är. När man vet detta kan man tex räkna ut hur mycket DNA det finns i
det tjocka 500 bp bandet eftersom jag kan räkna ut hur stor del av den totala mängden DNA i µg som
detta band utgör……….500x2 eftersom det av just detta band finns
2st)/(100+200+300+400+500+500+600+700+800+900+1000+1100+1200+1300+1400))x 1µg = antal µg
i 500bpbandet -> Nu måste jag visuellt avgöra om mitt DNA i ex brunn 14 lyser lika mycket som 500bp
bandet ellet 1.5 ggr mer eller ½ så mycket. Lyser det lika starkt så innehåller mitt DNA lika mycket som
500bp bandet, lyser det hälften så mycket så finns det hälften så mycket……….
-FIGURTEXT ska finnas under alla figurer!!!!
-TABELLTEXT ovan alla tabeller!!!!
Hänvisa tydligt till figurer och tabeller i texten!!!
OBS! Om ni inte fått ett tillfredställande resulat på er egen gel kan ni utgå från den gelbild som
finns inlagd nedan (figur X) och istället försöka använda och tolka detta resultat!!
DISKUSSION. Redogörelse för hur resultat tolkas. Om resultatet var exakt det väntade, om inte
varför blev det så då, var noga med att få med eventuella felkällor.
34
REFERENSER. Ange vilken litteratur alt web adresser som används.
Referenser ska skrivas efter aktuell text.
Se instruktioner i föregående lab v.40
För välgodkänt (VG) skulle följande kunna läggas till i inledningen eller diskussionen; Lite om
sensitivitet och specificitet, samt hur viktigt det är att inte få spridning av amplifierade PCR produkter och
hur man undviker detta. Ni bör också ta tex medline till hjälp för att hitta aktuell forskning kring bakterien
L.pne och då framförallt metoder som finns för att detektera/diagnostisera L.pne. Ett plus är att ta med
andra metoder än agarosegel som finns för att detektera PCR produkter. Beskriv real-tids PCR.
Tänk på tempus i labrapporten!
*Inledning: allmänt beskrivet ex. ”Legionella bakterien är en stavformad G- bakterie…..” ”PCR metoden är
baserad på följande steg…….”
*Material och metod: Det är ingen metodbeskrivning utan en beskrivning av vad ni har gjort ex. ” DNA från
legionella bakterien renades fram mha QIAgen tissue kit….” ”PCRéns master mix innehöll följande
komponenter…
*Resultat: ”Resultatet från spektrofotometermätnigen av det framrenade DNA´t gav följande
absorbansvärden…..””Analys av PCR produkter på EtBr inmärkt agarosgel visade att…(se figur…)
*Diskussion: ”Resultaten från den visuella koncentrationsbedömningen och koncentrations mätningen i
spektrofotometern vid 260 nm visar att dessa två metoder…..”” Resultaten från analysen av de nestade PCRprodukterna visar att kontamination har resulterat i falskt positiva resultat i ett flertal fall” ” Det är mest
troligt att kontaminationen har skett……andra troliga ….”
35
1
2 3 4 5 6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16
Figur X: Brunn:1; 50bp ” track it” (baspar (bp) anges ej för denna markör eftersom den är nedbruten), 2; steg1 pos, 3; steg 1
neg, 4; steg 2 pos, 5; steg 2 neg6; DNA pos (syns ej fast det borde), 7;DNA neg, 8; MW markör 100bpladder totalt har 2 µ l av
denna markör à 0.5 µg/ml satts på gelen Storlek på band i bp100,200,300, 400, 500(dubbelt så många av denna storlek därför
är detta band tjockare),600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400).
Brunn 9-16 samma som 1-8 ovan. (fast här syns även positivt i brunn 11 i steg 1 negativt och framrenat DNA brun 14 (totalt 10
µl satt på gel)
36
Laboration v.42
Identifiering av okänd bakterie från patientprov
Uppgift/Tentamen
Ni jobba individuellt och varje student får sex okända bakteriearter. Dessa skall
identifieras d.v.s. artbestämmas och resistensbestämmas. Proverna har från
provtagningsrören odlats ut på blodagarplattor och det är rena kulturer. Använd adekvat
kunskap och litteratur, för att identifiera de utlämnade mikroorganismerna. De ska typas
så långt ni kan och förses med relevant resistensbestämning.
De mikrober som kan förekomma i proverna är:
Beta-hemolyserande Streptokocker gr. A, Beta-hemolyserande Streptokocker gr. B,
Beta-hemolyserande Streptokocker gr. C eller G, Candida albicans,
Enterokocker, E. Coli, Klebsiella pneumoniae
Pneumokocker, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa, Stafylococcus aureus, Stafylococcus epidermidis
Stafylococcus saprophyticus, Streptokock viridans (alfa-streptokocker)
Bacillus cereus, Moraxella (Branhamella) catharralis
Ni har till ert förfogande
Av dessa tester ska ni välja ut de som är relevanta. OBS! Det finns bara hemtaget reagens
för adekvata tester (Kör ni allt mot alla kommer reagens inte att räcka!)
Reagens till gramfärgning
Blodplatta (delas in i tre delar, använd till samtliga stammar dvs tre stammar per platta),
Streptplatta, Blå-platta, Resistensplatta; medium A,
Esculinplatta (delas in i åtta delar, använd samma platta till flera grupper),
DNA-platta (delas in i åtta delar, använd samma platta till flera grupper),
urea-rör, SIM-rör, OD-rör, ONPG-rör,
3 % H2O2 ,Oxidas,
Uppsättning för latexagglutintion, Bacitracinlappar
Optichinlappar, Novobiocinlappar, Antibiotikalappar
1 M HCl
Examination
Muntlig examination enskilt, redovisa stegvis hur du gått tillväga vid identifiering
37
Laboration v.43
Svalg & Urin, identifiering av bakterier i patientprov
Svalg, material
5 st Strep A+ (snabbtest), uppsättning för latexagglutination gr. A-G, 5 streptplattor, 5
Bacitracinlappar, 5 Optochinlappar, 3 % H2O2
Utförande:
Dag 1:
1) Ta med en provtagningspinne varsitt prov från munhålan och svalget. Gör utstryk på
en streptplatta. Odla ut 3 st "patientprov" på samma sätt.
a)Lägg en bacitracinlapp och en optochinlapp i området mellan primär och sekundär
utstryket på respektive platta.
b) Inkubera 37oC över natt
2) Testa proverna" med Strep A+. Ett kommersiellt test för snabb detektion av grupp A
streptokocker. Följ anvisningarna som medföljer testet (se bilaga). Notera resultatet.
Dag 2:
Läs anvisningarna till latexagglutinationen, gör de spädningar som behövs för
användning till helklass.
1) Läs av plattorna, notera om det finns α eller β hemolys och mät eventuell relevant zon
runt bacitracin och optochin lapp.
2) Gruppera de β-hemolytiska streptokockerna. Följ bruksanvisningen som följer med
kittet.
Urin, material
6 st blå-plattor, SIM-rör (Indol, H2S och rörlighet), Urearör, OD (Ornitindekarboxylas),
ONPG-rör, Novobiocin-lappar, Esculinplatta (Plattan delas in i 8 delar), DNA-platta
(Plattan delas in i 8 delar), 3 % H2O2 , resistensplattor och antibiotika lappar: ampicillin,
trimethoprim, mecillinam och nitrofurantoin, PcV, Erytromycin
Dag 1:
1) Ta ett eget urinprov. För att undvika att få med normalflora från huden ska urinprovet
tas så rent som möjligt. Man odlar från mittströmsurin ( dvs man tar inte den första
urinen som kommer, pga förorenings risken). Se bilaga 3.
2) Odla ut varsitt urinprov och 4 st urinprov på varsin blå-platta. (6 st prov per grupp).
Ta en fylld vit ögla och odla ut enl nedan. OBS! Öglan (som rätt använd tar 1 µl) ska
vara fylld men inte överfylld, det får inte hänga en droppe i den.
Odla ut som i figur.
Var lätt på handen, man
skär lätt genom agarn.
38
3) Inkubera 37oC över natt.
Dag 2.
1) Läs av blå-plattorna. Notera vad ni ser. Räkna ut hur många bakterier per milliliter
som finns i provet. Om det i provet finns >104 av en sorts bakterie typar man och
resistensbestämmer bakterien även om man räknar med att det ska vara >105 bakterier
per milliliter vid två tillfällen för att man ska vara säker på att det är en
urinvägsinfektion.
2) Gramfärga de stammar det finns fler än 104 av.
3) Typa stammarna.
a) Typa de gram-positiva stammarna. Vilka G+ bakterier föväntas du hitta? Välj
mellan tester som katalas, novobiocinkänslighet, DNA:se och esculinplatta.
b) Typa de gram-negativa stammarna. Vilka G- bakterier förväntas du hitta? Använd
”jäsningrör” för att se vilken stam.
4) Testa stammarna för antibiotika känslighet.
Dag 3
1.
Läs av och tolka de olika typningarna. (se även bilaga - jäsningsschema).
2.
Läs av resistens mönstren. Se bilaga 1.
Examination
Varje labgrupp funderar igenom laborationen ordentligt se 5 punkter nedan, och
redovisar sedan resultaten muntligt.
1. Förbered er skriftligt så att ni kan redogöra munligt för de bakterierna ni hittade i ert
prov. Spar plattorna för att kunna gå tillbaka och titta.
2. Redogör för i vilka prov det finns luftvägspatogener respektive enbart normalflora.
Bestäm så långt ni kan vilka/vilken luftvägspatogen ni har. Beskriv hur ni har kommit
fram till dessa resultat? Dokumentera steg för steg! Vilken klinisk relevans har dessa?
3. Redogör för i vilka prov det finns urinvägspatogener respektive enbart normalflora.
Vilken betydelse har provtagningstekniken? Bestäm så långt ni kan vilka/en
urinvägsvägspatogen ni har. Beskriv och dokumentera steg för steg hur ni har kommit
fram till dessa resultat? Vilken klinisk relevans har dessa? Redogör för
resistensbestämning samt utvärdera de resistensmönster ni har fått.
4. Fundera över analysprincipen för StrepA + testet, och ge ett möjligt förslag på hur den
fungerar.
5. Fördelar/nackdelar med snabbtester kontra referensmetoder. Är det någon skillnad i
resultat på de olika detektionsmetoderna? Fördelar/nackdelar?
39
Seminarium/Grupparbete i genetik
Man ingår i en grupp och tanken är att personerna i gruppen ska ”prata ihop sig” kring ett
ämne som valts, se nedan 8 stycken exempel på seminarieämne, meddela Ann Erlandsson
så snart som möjligt vilka personer som har valt vilket ämne. Först till kvarn…Varje
student redovisar 10-15 minuter, ni måste tillsammans i gruppen komma överens om vad
var och en ska prata om så att kurskamraterna som lyssnar får en helhetsbild och en
förståelse för ämnet. Det är naturligtvis tillåtet att medföra litteratur och egna
anteckningar vid seminariet. Använd gärna OH-bilder, PowerPoint eller skriv på tavlan
för att göra informationen lättare att ta till sig. Det är obligatorisk närvaro vid alla
seminarieredovisningar! Uppgiften betygssätts med U eller G
Nedan följer 8 exempel på seminarieämnen:
1. ”Genmodifierade organismer (GMO) ex. bakterier, växter och djur, regler/lagar,
fördelar och nackdelar…exemplifiera ex ”the golden rice”etc”
2. ”Hur klonar man gener? Vilka steg ingår då tex vaccin eller läkemedel tas fram
mha kloning, beskriv gärna från det att man plockar ut genen till dess att man har
ett färdigt piller på apoteket…”
3. Ӏrftliga sjukdomar, dominant? recessiv?; cystisk fibros, fenylketonuri, duchennes
muskeldystrofi, blödarsjuka (typ A), huntingtons sjuka etc.. och vad är genterapi?
Kan man med genterapi bota ärftliga sjukdomar?
4. ”Fosterdiagnostik baserade på gentester, provrörsbarn och vad är ett klonat djur
ex. fåret Dolly?..”
5. ”Vad är embryonala respektive vuxna stamceller? Och vad kan man använda
stamceller till? Laga skadat hjärta? Bota diabetes och behandla parkinsson?
Nackdelar?...”
6. ”Kriminologi, genetiska fingeravtryck, hur går det till från blodfläck till fängelse,
mass-test? och spanings register?...”
7. ” Diagnostik/Epidemiologisk typning av mikroorganismer med
genteknik/molekylärbiologiska metoder ex. realtids-PCR, PCR, sekvensering eller
dylikt, ge exempel på mikroorganismer som nuförtiden diagnostiseras mha att man
analyserar/hittar deras arvsmassan…”
8. ”Geners roll vi cancer, reglering av celldelning, onkogener, vad kan förändra
gener? Miljögifter? etc…”
40
Studiehandledning
BLGAM0
Mikrobiologisk metodik med genteknik
Kursens mål är att studenten efter genomgången kurs ska ha inhämtat grundläggande kunskaper i mikrobiologisk
metodik samt genteknik
Efter genomgången kurs ska studenterna kunna:
Identifiera bakterier i okända prov samt urin och svalg prover genom praktiskt arbete
Beskriva vad som hänt när det blir ett positivt resultat i ett OD-test, SIM-test, oxidase-test, ureas-test och katalas-test
Identifiera vilket ämne och vilken reaktion det är i följande odlingsplattor; blå-platta, esculin-platta, DNA-platta,
blod-platta och strep-platta som ger en diagnostisk eller selektiv möjlighet vid odling
Identifiera vilken bakterie det rör sig om utifrån följande resultat från odling, gramfärgning, biokemiska test och
eventuell test av bacitracin/novobiocin zon;
• Vid färgning enligt Gram; blåa kocker,
Katalas negativ, beta-hemolyserande, bacitracin 16 mm
• Vid färgning enligt Gram; röda stavar
Oxidase-test ger inget färgomslag, fermenterar laktos, urea-röret är rött, OD-röret gult, SIM-röret: H2S-röret
”beige”, Indol ofärgat och ej rörlig
• Vid färgning enligt Gram; röda stavar
Oxidase negativa, Fermenterar laktos, urea-röret gult, OD-röret lila
SIM-röret: H2S-röret ”beige”, Indol rött och rörlig
• Vid färgning enligt Gram; blåa kocker,
Katalas positiv, DNA-platta ej utfällning runt bakt, novobiocin 24 mm
• Vid färgning enligt Gram; blåa kocker
Katalas positiv, DNA-platta fällning runt bakt, novobiocin 5 mm
• Vid färgning enligt Gram; blåa kocker
Katalas positiv, DNA-platta fällning runt bakt, novobiocin 24 mm
• Vid färgning enligt Gram; blåa kocker
Katalas negativ, beta-hemolyserande, bacitracin 16 mm
• Vid färgning enligt Gram; röda stavar
Oxidas test visar blå färg, fermenterar inte laktos, är resistent mot flera antibiotika
• Vid färgning enligt Gram; röda stavar
Oxidas negativ, fermenterar inte laktos, producerar ureas, dekarboxylerar inte ornitin
SIM-röret: H2S-röret svart, Indol rött och rörligt
• Vid färgning enligt Gram; blåa kocker
Katalas negativ, eskulinplatta visar mörk zon
Avgöra med hjälp av ”gränsvärdes lista på antibiotika zon diameter” om en bakterie är R resistent, I intermediärt
känslig eller S känslig för ett visst antibiotika.
Avgöra med vilken analys/test man kan skilja mellan;
Enterokocker och alfa-streptokocker
Stafylokocker och Streptokocker
Stafylokocker och Bacillus cereus
Pneumokocker och alfa-streptokocker
Proteus mirabilis och proteus vulgaris
Pseudomonas och enterobacteriaceae
Stahylokocus epidermidis och Staphylococccus saprofyticus
Stahylokocus epidermidis och Staphylococccus aureus
E.coli och Klebsiella
Stahylococcus epidermidis och Staphylococcus saprofyticus
Streptococcus gr A och streptococcus gr C
41
Beskriva hur en Proteus mirabilis/vulgaris ser ut på en blåplatta
Beskriva hur en alfa-streptokock ser ut på en streptplatta/blodplatta
Beskriva huvudprincipen för step A+ testet
Beskriva huvudprincipen för streptex testet
Ange fördelar och nackdelar med snabbtester kontra referensmetoder
Utföra en DNA preparation, en PCR reaktion samt analysera PCR produkter och framrenat DNA m h a
agarosgelelektrofores
Beskriva principen för hur man renar fram DNA med QIAGENs DNeasy Mini spin columns
Identifiera orsaken till vissa problem som har att göra med DNA fram reningen med QIAGENs DNeasy Mini spin
columns tex. då man får ut en för liten mängd DNA eller då det framrenade DNA´t har låg renhet
Beskriva de ingående komponenter i PCR reaktionen och hur PCR reaktionen fungerar
Nämna några infektions sjukdomar som diagnostiseras med PCR
Nämna något tillfälle där kan det vara bättre respektive något tillfälle då det kan vara sämre att använda PCR som en
diagnostisk metod
Förklara vad det innebär att få ett falskt positivt resultat i ett diagnostiskt test ex. PCR och serologiskt test
Förklara vad det innebär att få ett falskt negativt resultat i ett diagnostiskt test ex. PCR och serologiskt test
Nämna två sätt att öka specificiteten i en PCR reaktion.
Nämna två sätt att öka sensitiviteten i en PCR reaktion.
Definiera multiplex PCR och realtids-PCR
Gjuta en agarosgel och storleksbestämma kromosomalt DNA och PCR produkter mha ethidiumbromid och UV-ljus
Beskriva principen för visualiseringen/detektion av DNA mha ethidiumbromid och UV-ljus på en agarosgel
Beskriva koncentration och renhets bestämning av nukleinsyra (DNA och RNA) i en spektrofotometer
Uppskatta koncentrationen av nukleinsyra (DNA och RNA) på en agarosgel m h a en molekylvikts markör med
känd koncentration
Kvantifiera bakterier i en suspension genom turbidimetri, Burker räknekammare och viable count genom
praktiskt arbete
Beskriva för och nackdelar mellan kvantifieringsmetoderna turbidimetri, Burker räknekammare och viable count
Beräkna generationstiden för en bakterie
Kunna sätta upp en relevant spädningsserie
Pipettera med en automatpipett på ett tillförlitligt sätt
Beräkna CV i ett pipetterings försök
Presentera (i seminarieform) ett ämne inom genteknik och diskutera etiska aspekter kring genteknik ex. på
ämnen fosterdiagnostik, kloning, kriminologi, genterapi, genvaccination, vaccin och/eller
läkemedelsproduktion
Beskriva ett klonings förfarande från isolering av en gen till att genen börjar uttryckas i en anan organism
42
exempelvis en bakterie
Beskriva vad ett restriktionsenzym respektive ligas är, hur dessa fungerar in vivo och hur de utnyttjas in vitro
Nämna 3 olika vektorer
Beskriva en plasmidvektor mer i detalj
Ange 2 exempel på hur en bakterie kan ha nytta av sin plasmid
Beskriva på vilket sätt plasmider i bakterier ställa till problem för oss människor
43