Avdelningen för kemi och biomedicin Karlstads universitet 2010 Laborationskompendium Biomedicinsk laboratorievetenskap Mikrobiologisk metodik med genteknik 7,5 hp. Innehåll; Schema Kursplan (delar) Skyddsföreskrifter Allmän bakgrund bland annat om: Odlingsmedier och odling av bakterier, utstryksteknik, PCR, leginella pneumophilia *Lab. V.40 Metoder för kvantifiering av bakterier *Lab. V.41 Detektion av Legionella pneumophilia med nestad PCR *Lab. V.42 Identifiering av okänd bakterie (skriftlig labrapport) (skriftlig labrapport) (muntlig individuell examination) *Lab. V.43 Svalg & Urin (muntlig labgrupp examination) *Seminarium v.44 Genteknik/genetik (muntlig helklass redovisning) *Studiehandledning *Bilagor till v.41 se pdf filer på kurshemsidan; Fil ”DNAframrenings-handbok”innehåller mycket värdeful linfo. bland annat hur man renar fram DNA Fil ”PCR-handbok” innehåller mycket värdeful linfo. bland annat hur man ”sätter upp” en PCR *Bilagor till v.42 och v.43 se pdf fil på kurshemsidan Fil ”bilagor okänd bakterie urin&svalg” innehåller följande: Gramfärgning Resistensbestämning m diskdiffusion (även separat fil) Insamling av morgon urin Signifikans tabell för urinvägspatogener. Mängdbestämning av bakterier Step A (synns på vissa ställen dåligt se original version på lab) Fil ”streptex”innehåller beskrvning hur man typar olika streptokock gr A-G Fil ”jäsningsschema”innehåller Jäsningsschema plus lite annan värdefull information Schema BLGAM0 (anm. Kod: KAU-14421) HT-10 Biomedicinsk laboratorievetenskap Mikrobiologisk metodik med genteknik 7,5 hp. Må Ti On To Fr v. 40 4/108/10 41 11/1015/10 42 18/1022/10 43 25/1029/10 44 1/115/11 10.15-12.00 Sal:5F323 Allmän genomgång. Kursupplägg. Bakgrundsteori Seminarieuppg. 9.00-17.00 Lab grupp 1 PH Kvant 9.00-15.00 Lab grupp 1 PH Kvant 9.00-17.00 Lab grupp 2 PH Kvant 9.00-15.00 Lab grupp 2 PH Kvant 9E311/312 9E311/312 9E311/312 9E311/312 9.00-16.00 Lab grupp 2 AE Legionella PCR 9.00-17.00 Lab grupp 2 AE Legionella PCR 9.00-16.00 Lab grupp 1 AE Legionella PCR 9.00-17.00 Lab grupp 1 AE Legionella PCR 9D204 9D204 9D204 9D204 10.30-16.00 Okänd bakt 9.00-15.00 Okänd bakt AA/IL (OBS! 1-2h förberedelse för lab ansvarig Märkning av plattor etc) AA/IL 9.00-14.00 Okänd bakt *** AA/IL 9.00-13.00 Labgenomgång Nr.2 Legionella PCR AE 9D303/313 9D303/313 9.00-14.00 Okänd bakt (reserv dag) *** AE 9D303/313 12.00Organisera er på Lab 9D204 9.00-15.00 Lab grupp 1+2 PH Kvantifiering av bakterier (Kvant) 9E311/312 9D303/313 10.30-13.00 Urin&Svalg *** AA/IL (OBS! 1-2h förberedelse för lab ansvarig Spikning av prov etc) 9D204 9.00-15.00 Urin&Svalg *** AA/IL 9.00-14.00 Urin&Svalg *** 9.00-12.00 Urin&Svalg (reserv dag) *** AA/IL AE 9D303/313 9D303/313 9D303/313 10.15-15.00 10.15-15.00 10.15-12.00 Redovisning av Seminarieuppg. GENTEKNIK AE Sal: 5F323 Redovisning av seminarieuppg. GENTEKNIK AE Sal:5F323 Redovisning av seminarieuppg. GENTEKNIK AE Sal: 5F323 9D303/313 PH= Patrik Holm, KAU;AA= Anna-Sara Ahlquist, IL=Ingegärd lindgren; AE=Ann Erlandsson, KAU. *** Tillfälle då möjlighet finns att examinera ”lab Okänd bakterie” alt urin & svalg”muntligt Kursansvarig och Examinator: Kurssekreterare: Ann Erlandsson (AE) 9D 408 Alice Svedung 5C 348 ann.erlandsson @kau.se [email protected] 054-7002471,0734047221 054-7001735 2 Kursplan Kursens mål (om kursen uppdelas i delar kan även delmål anges) Kursens syfte är att studenten efter genomgången kurs ska ha inhämtat grundläggande kunskaper i mikrobiologisk metodik samt genteknik Efter genomgången kurs ska studenterna kunna: • Med hjälp av laborativt arbete med biokemiska, immunologiska samt molekylärbiologiska test identifiera ett antal medicinskt viktiga bakterier • Med hjälp av laborativt arbete kunna avgöra om en bakterie är resistent, intermediärt känslig eller känslig för ett visst antibiotika • Med hjälp av laborativt arbete kvantifiera bakterier i en suspension samt ange för- och nackdelar med olika kvantifieringsmetoder • Beräkna generationstiden för en bakterie samt sätta upp en relevant spädningsserie, pipettera med en automatpipett på ett tillförlitligt sätt och beräkna variations koefficient i pipetteringsförsök • Beskriva vilket ämne alternativt vilken reaktion som ger en diagnostisk eller selektiv information i ett antal vanligt förekommande mikrobiologiska tester • Beskriva principer för framrening, koncentration, renhets- och storleksbestämning av nukleinsyra (DNA) • Förklara hur PCR reaktionen fungerar • Ange några vanliga infektions sjukdomar som vanligen diagnostiseras med PCR • Presentera ett ämne inom genteknik muntligt samt diskutera detta ämne allmänt och utifrån etiska aspekter med kursdeltagare och kursledare • Beskriva ett kloningsförfarande Kursens huvudsakliga innehåll (undervisningsformer, kursens indelning i olika kursmoment/block) Kursen innehåller: En inledande föreläsning repeterar delar av den medicinska mikrobiologin samt knyter an till mikrobiologisk metodik och genteknik. Ett antal föreläsningar inleder respektive avslutar de olika laborationsmomenten Följande laborativa moment: • Odling av humanpatogena bakterier för diagnostik och artbestämning av dessa med hjälp av Gramfärgning, biokemiska test och immunologisk metodik. • Resistensbestämning av bakterier • Framrening av kromosomalt DNA från bakterier • Detektion av bakterier med PCR-teknik och analys på agarosgelelektrofores • Metoder för kvantifiering av bakterier med hjälp av "viable count", Bürker räknekammare och turbidimetri • Pipetteringsteknik Följande moment redovisas i seminarieform: • Genteknik och etiska aspekter kring genteknik. Examination (även antal provtillfällen om antalet tentamensförsök har begränsats, dock minst fem ordinarie kurser respektive två inom VFU) Muntlig individuell examination, labrapporter, praktisk examination av pippeteringsteknik samt redovisning i seminarieform. 3 Skyddsföreskrifter Allmänna skyddsföreskrifter vid kurs laborationer med levande mikroorganismer vid institutionen för biomedicinsk laboratorievetenskap, Hälsohögskolan i Värmland 1. Laboratorierockar ska skydda privata kläder från kontakt med infekterat material och ska därför vara helt knäppt och helt skydda ärmarna. Ta av er ringar och klockor när ni arbetar med levande mikroorganismer. 2. Tänk på att smitta kan överföras; vid avbränning av platinaplatinöser, via aerosolbildning när man t ex öppnar odlingsflaskor, tar av gummiproppar, samt vid oaktsamhet när man kastar plattor, och packar sopsäckar. Var försiktiga. 3. Tänk på att smitta kan överföras vid slamning av kulturer t.ex. vid resistensbestämning och objektglas agglutinationer. Var försiktiga. 4. Använda objektglas och pasteurpipetter ska kastas i speciella plastbyttor. Plattor, platinöser och andra engångsutensilier som kommit i kontakt med infektiöst material kastas i riskavfall. 5. Vid spill av infekterat material, häll först på desinfektionsmedel, låt stå angiven tid, och torka sedan av. 6. Torka av arbetsytan med desinfektionsmedel efter varje avslutat arbetspass. 7. Händer bör ej komma i kontakt med infekterat material. 8. Tvätta händerna noga (tvål och vatten) varje gång ni lämnar lokalen samt om ni kommit i kontakt med infektiöst ämne. 9. Det är naturligtvis förbjudet att äta och dricka på laboratoriet 4 Allmänt Odlingsmedier för bakterier Olika bakterier har olika krav på näringslösningar samt olika förmåga att tillväxa vid tillsatts av olika kemikalier alternativt under extrema koncentrationer av t.ex. [H+] eller jonstyrka (se Jawetz et al Medical Microbiology). En del bakterier kräver dessutom en speciell miljö omkring sig; aerob miljö (syrerik), CO2 rik miljö, anaerob miljö (helt utan syre), de har dessutom olika tolerans när det gäller uttorkning (se under utstryksteknik). Allmänna medier är näringsrika medier där de allra flesta bakteriearter växer. De används när man misstänker en bakteriellt orsakad infektion t.ex. en sepsis och man vill få den aktuella bakterien att växa fram oavsett vad det är för art. De är dock inte så allmänna att samtliga bakteriearter växer, så vid vissa frågeställningar måste man använda speciella medier. Selektiva medier innehåller ämnen som är toxiska (ex gentianaviolett) alternativt koncentrationer av vanliga ämnen som är toxiska för de flesta arter (ex 10 % NaCllösning) men inte för andra. Selektiva medier kan även vara näringsfattiga och på så sätt selektera bakterier som inte är så näringskrävande. De gynnar sålunda vissa bakteriearter men missgynnar andra. Medierna används när man vill selektera fram och få en viss bakterieart att växa. Diagnostiska eller differentierande medier innehåller ämnen som vissa bakterier kan använda i sin ämnesomsättning medan andra är oförmögna till det. Vid ett eventuellt nyttjande av ämnet (ex laktos) så bildas vid ämnesomsättningen nya produkter (ex mjölksyra) vilka kan påvisas. Om t.ex. produkterna är sura eller basiska ger de ett färgomslag i mediet om detta även innehåller en pH-indikator. Många medier har en dubbel funktion. Ett exempel är gentianaviolett plattan som selekterar växt av streptokocker och innehåller blod vilket gör att man kan se vilken typ av hemolysin streptokockerna producerar eftersom vissa ger en ofullständig nedbrytning (grön nedbrytningsprodukt) och andra en fullständig (uppklarning ”gul”). Medier kan vara fasta (med agar) och finns både som plattor och i rör. Fasta medier gör att man kan urskilja enstaka kolonier och lättare avgöra om man har en ren kultur eller inte. Flytande medier finns i rör och här har man inte möjlighet att avgöra om man har en ren kultur eller inte. Ett sätt till kontroll är dock att efter man doppat öglan i buljongen odla ut på en platta och på så sätt kunna se om man har renkultur. Utstryksteknik Sterilteknik är en teknik som används inom många discipliner. Begreppet steril avser total avsaknad av levande organismer. Vid substratberedning till bakteriologisk odling är steriltekniken helt avgörande. Ett annat exempel är vid odling av eukaryota celler (oftast cellinjer eller s.k. transformerade celler), då dessa celler förökar betydligt långsammare än 5 de prokaryota är de snart överväxta av bakterier och/eller mögel om dessa skulle komma in i provet. För detta finns speciella sterilboxar. När man arbetar med bakteriologiska prov är det viktigt att jobba så rent som möjligt. Man får inte från egen normalflora eller förorenade utensilier tillföra någon bakterie som sedan tillskrivs provet. Det är också viktigt för att skydda sig själv. Vid arbete med vissa bakterier bör man p.g.a. smittrisken arbeta i dragskåp. Dessa bakterier kommer ej att ingå i kommande laborationer. Vi arbetar på våra ordinarie labbänkar (om inte annat anges i manualen). Man kan använda sig av en platinaögla (platinös) som kan brännas av eller av engångsöglor av plast. Det som används mest på medicinskt mikrobiologiska laboratorier är plastöglor. Oavsett om ni använder platinaöglor eller plastöglor kan följande metodbeskrivning användas. Då plastöglor används utgår givetvis alla moment där avbränning och flambering sker men man försöker ändå arbeta så rent som möjligt. Plastöglan tas ur förpackningen först när den ska användas, man lägger aldrig tillbaka en plastögla man tagit ur förpackningen och man lägger inte en använd ögla på en arbetsyta utan den slängs direkt i därför avsedda avfallskärl. Renkulturer av bakterier För att kunna typa bakterier måste ha "rena" bakteriekulturer så kallade renkulturer som härstammar från en enda bakterietyp. Man vill alltså att en enda bakterieart (stam) skall växa på plattan och inte flera olika, för att vara säker på att man arbetar med en renkultur måste alltid bakterier tas från enstaka kolonier på en platta. Om man dagen efter ska ha möjlighet att se om man lyckats med att få en renkultur får man inte ta för mycket material eftersom man då får en konfluerande växt och kan inte med ögat urskilja enstaka kolonier. Av små kolonier (t.ex. streptokocker) kan man ta hela kolonien medan en större koloni (t.ex. koli) doppar man bara platinösen i kolonien. Utstrykstekniken går därför ut på att, oavsett om man använder platinaögla eller plastögla, få fram enstaka kolonier. En enstaka koloni bildas från en enda bakterie som sedan delar sig exponentiellt och ger upphov till flera miljoner bakterier och man får, efter inkubation, en synlig koloni av bakterier. Utstryksteknik på agarplatta 1. Plattan som ska användas läggs på bordet med locket nedåt. Märk plattorna i botten med respektive nummer. Håll platinaöglan med höger hand och glödga den i gaslågan. Vänta i 10-15 sek. för att öglan ska hinna svalna. Alternativ ta plastöglan direkt ifrån förpackningen utan mellanlandning på bänken eller någon annanstans. 2. Plattan med bakteriekulturen, som också ligger på locket, fattas på sidorna med vänstra handens fingrar, lyfts av och vänds med agarytan uppåt. Tag med öglan upp litet bakteriemassa och lägg tillbaka plattan i locket. 6 3. Den oanvända upp- och nedvända plattan fattas med vänstra handens fingrar. Stryk med öglan enligt mönstret nedan. De sista strykningarna bör ge kolonier uppkomna från enstaka celler. Har man ett patientprov (bomullspinne) odlas primärstryket med bomullspinnen och sekundär och tertiärstryk med plastögla. Eventuell bacitracin optochin lapp Sekundärstryk; plastögla (samma) Primärstryk; • bomullspinne vid prov från t ex svalg • platsögla vi odling för renkultur Tertiärstryk; plastögla (samma) 4. Plattan vänds upp och ned och sätts tillbaka på locket. Avbränning av kontaminerad platinaögla utförs så att öglan först torkas i närheten av lågan och därefter glödgas. Om en fuktig ögla glödgas direkt bildas aerosol. Plastöglan kastas direkt (dvs. utan mellanlandning på lab. bänken) i riskavfall. Plattan inkuberas i lämplig miljö. Anaerob miljö i ”anaerobbox”; tillsätt 10 ml dest. vatten i en särskild påse (se bifogad bruksanvisning) och ställ i 37oC inkubator, CO2 - rik miljö i CO2-inkubator. Aerob miljö, inkubera direkt i inkubatorn, sätt en mugg med avjoniserat atten för att öka luftfuktigheten i inkubatorn. Byt vatten varje dag. Utstryksteknik i rör 1. Doppa öglan i den koloni du önskar testa. Se till att det bara är en sort. 2. Röret hålls i vänster och öglan i höger hand. Med högra handens krökta lillfinger fattar man i rörets lock, skruvar av det och håller det kvar. Detta för att inte få med sig föroreningar från labbänken. 3. Öglan förs in i röret och man gör sitt utstryk (ex urea-röret) alternativt doppar om man har en lösning (ex ONPG-röret) eller om man ska testa rörligheten för man ned öglan en gång i agarn och upp i samma spår (ex SIM-röret). Det räcker att man doppar en gång i en lösning, var lugn det kommer att ramla av tillräckligt med bakterier. Man kan och bör använda samma bakteriekoloni genom samtliga test för att försäkra sig om att det är samma bakterie man testar. Det är praxis på många ställen att man efter utodling i buljong kontrollerar att man har renkultur på en agarplatta (ex. blåplatta om man testar Enterobacteriaceae). urea-rör (agar) ONPG-rör (buljong) SIM-rör (agar) 7 Rackling. Vid kvantifiering av bakterier på platta är det viktigt att få en bra och jämn spridning av bakterierna så att kolonierna sedan är lätta att räkna. Som rackla kan en böjd Pasteurpipett användas men det finns också färdiga racklor, både engångs och sådana man måste sterilisera mellan varje användning. Olika typer av medier. Det finns ett stort urval av medier som används på mikrobiologiska laboratorier för att kunna odla fram och identifiera bakterier. Nedan ges en kort beskrivning av cellodlingsmedierna som finns att tillgå vid laborationerna. Fasta medier, agar plattor. Används för att anrika de bakteriearter som finns i det prov som skickas till lab. Dessa kan vara allmänna, selektiva eller diagnostiska, allt beroende på frågeställningen. Choklad agar (hematinplatta) innehåller blod som upphettats och serum. Det är rikt medium som de allra flesta bakterier växer på. Blodagarplattan innehåller blod och är ett rikt medium där de flesta bakteriearter växer dock ej t ex Hemofilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae och Neisseria meningitidis. Anaerobplatta innehåller blod och är ett rikt medium som är fritt från syre. Inkuberas i anaerob miljö. Resistensplatta (Medium A) används för att odla bakterier och testa deras känslighet för olika antibiotika. Mediet är näringsrikt eftersom man vill att så många sorters bakterier som möjligt skall kunna växa på det. Medierna är ofta anpassade till vissa antibiotika-lappar. (eg man måste köpa allt från en firma). Vissa bakteriearter kräver speciellt medium. Det medium som finns till förfogande på den här laborationen är ISOSENSITEST medium A. Blåplattan som innehåller laktos (mjölksocker) och BTB (bromtymolblått) är en diagnostisk platta. Om de odlade bakterierna är laktosjäsare bildas mjölksyra, miljön blir sur och BTB slår om från blått till gult. Streptplatta (Dubbelskiktad blodplatta) består av två skikt. Det övre skiktet innehåller streptomycin som hämmar de flesta bakterier utom Streptokocker. Det innehåller även blod som streptokockerna hemolyserar varför det blir en klar zon runt varje bakteriekoloni. För att man ska se hemolysen tydligt är skiktet tunt. Det undre skiktet funktion är att skydda plattan mot uttorkning (som annars lätt skulle kunna inträffa p.g.a. det tunt gjutna överskiktet). Observera att Stafylokocken inte växer alt. växer dåligt på den här plattan. 8 Flytande medier. Används exempelvis för att odla upp en enda koloni som växer på en platta för att sen preparera fram plasmider från denna bakterie. Alla bakterier i den flytand odlingen är då likadana då de härstammar från en enda koloni på plattan. LB- (Luria-Bertani) medium är lämplig vid uppodling av E.coli, men även andra bakterier kan växa i detta medium. Finns även som fast medie, då med tillsats av agar. Jäsnings"rör", Buljong eller Fasta Medier Dessa används framförallt för att skilja olika arter åt. De kan vara både fasta och flytande beroende på funktion. ONPG. Testet visar om bakterierna kan bryta ner laktos/galaktos eller ej. Det är känsligare än blå-plattan. Det krävs två enzymer, dels ett permeas som aktivt transporterar in laktos i cellen och dels beta-galakotosidas som bryter ner det. ONPG (orto-nitro-phenyl-galaktosid) används som substrat, därför att det vid nedbrytning bildar en färgad (gul) produkt. Urearör. I mediet ingår urinämne. Om bakterierna kan producera enzymet ureas så kan det hydrolysera urinämnena och det bildas ammoniak. Ammoniaken är basisk och ger ett färgomslag till cyklamensrött tack vare en indikator (fenolftalein) i mediet. OD (Ornitindekarboxylas). Bakterier som inokuleras fermenterar dextros vilket leder till sura nedbrytningsprodukter och ger ett färomslag till gult. Den sura miljön stimulerar dekarboxylase aktivitet. Vissa bakterier kan avlägsna karboxylgruppen från ornitin vilket leder till att det bildas en amin (putrecine) och mediet blir mer basiskt dvs mediet återgår till den lila färgen. Den pH-indikator (kresol-röd och bromkresolpurpur) som används är lila i basisk miljö och gul i sur. Observera att det måste vara en bakterie som fermenterar dextros för att testet ska fungera, i annat fall kommer ju den lila färgen att bestå hela tiden. SIM-rör (Svavel-Indol-Motility). Tre olika egenskaper beträffande bakterierna kan utläsas. INDOL. Om bakterierna har ett enzym för att från aminosyran tryptofan avlägsna en aminogrupp bildas indol. Efter övernatt inkubation tillsätts Erlich reagens (pdimetylaminobenzaldehyd) Den bildade indolen ändrar färg och blir röd. H2S-produktion. Om bakterierna har ett enzym för att överföra svavel från den bundna formen i vissa aminosyror till H2S. Mediet innehåller natrium-thio-sulfat, frigjort svavelväte binds till i mediet tillsatt järn och bildar järnsulfid som kan ses som en svart fällning. RÖRLIGHET. Man ser om bakterierna flyttat sig från primärstrecket eller ej. Mediet är halvfast och bakterier med flageller kan röra sig i mediet. För att lättare se rörligheten 9 finns tetrazoliumklorid tillsatt som av bakterierna reduceras från färglöst till rödbrunt. Här är det viktigt att man för öglan ned och upp i röret i samma ”spår”. Vispar man runt kommer det att se grumligt ut i röret oavsett om man har en rörlig bakterie eller inte. Om det växer bakterier utmed sticket men ej för övrigt så är bakterien ej rörlig. Har bakterierna däremot växt ut i mediet är de rörliga. Indol H 2S Tester för påvisande av vissa bakteriearter Oxidase test (ska spädas nytt varje dag). Reagenset droppas direkt på plattan alternativt tar man en bakteriekoloni och för över till ett vitt filterpapper som blötts med reagenset. Pseudomonas, Alcanigenes och Moraxella är exempel på oxidaspositiva bakterier. De får snabbt en kraftig blåfärgning. Man säger att de är oxidaspositiva eftersom de producerar ett cytokromoxidas som bryter ner sitt substrat (tetra-metyl-fenylendiamine dihydroklorid) till en blå produkt. OBS att de bakterier som man hällt oxidas på är döda, man kan alltså inte odla fram dessa igen. Katalas. Väteperoxid används för att detektera förekomst av katalas. Väteperoxiden bildar då syrgas och man kan se att det ”bubblar” om bakterien. 2 H2O2 → 2H2O + O2 . Testen utförs på objektglas för att försäkra sig om att katalaset kommer från bakterien. Stafylokocker och Bacillus är exempel på katalaspositiva bakterier. Streptokocker är katalas negativa. 10 DNA-platta. Plattan innehåller DNA. S. aureus bryter ner DNA (är DNAse positiva) till skillnad från S. epidermidis och S. saprophyticus. Efter inkubering över natt häller man på 1M HCl vilket fäller ut DNA och man kan på så sätt urskilja S. aureus från de övriga Stafylokockarterna. Det bildas en fällning i hela platta förutom runt S. aureus. Dela in plattan i 4 - 8 delar. Tänk på att även andra arter (ex grupp A streptokocker) kan vara DNAse positiva. Klar zon runt utstryket. Inget DNA har fällts ut. S. saprophyticus och S. epidermidis Esculinplatta. Används för att bekräfta enterokockförekomst. De ger en kraftig mörkfärgning av den annars genomskinliga plattan. Enterokockerna hydrolyserar esculin till esculetin och dextros. Esculetin reagerar med ett järnsalt, järnammoniumcitrat, och bildar med detta ett mörkbrunt eller svart komplex. Oxgalla i mediet hämmar andra Grampositiva bakterier än enterokocker och natriumazid hämmar Gramnegativa mikroorganismer. Enterokock Egg yolk -platta innehåller lecithin (äggula). Om de odlade bakterierna (ex Bacillus cereus) innehåller lecithinase bildas en mjölkvit fällning runt bakterien. STREPTEX, Latexagglutination. Antikroppar som reagerar mot gruppspecifika kolhydrater i streptokockens cellvägg är fästade på latex (små plastkulor) kulor och vid en positiv reaktion kommer dessa att klumpas ihop, agglutinera. (se bilaga). Olika ämnen som stimulerar alternativt inhiberar växt av bakterier Antibiotika i en definierad koncentration finns indränkt i lappar som läggs på ett fast medium på vilken man har gjort ett utstryk av sin teststam. De antibiotika lappar vi använder på våra laborationer finns angivna i respektive lab. Tänk på att zonstorleken är påverkad av bakterietätheten. Gör om till påföljande dag om ni är osäkra. 11 Antibiotika kan även användas för diagnostik av bakterier, bacitracin (zon > 16 mm Streptokocker gr A), novobiocin (< 16 mm S. Saprofyticus), optochin ( > 12 mm pneumokock) och oleandomycin (inhiberar växt av de bakterierna normalt förekommande i svalg utom H. influenzae) är sådana exempel. Bacitracin och optochin läggs på streptplatta (eller blodplatta), novobiocin på resistensplattan och oleandomycin på hematinagarn. Faktor X, V och XV. Tillväxtfaktorer som krävs av vissa bakterier. X står för hemin och V för nikotinamiddinukleotid (NAD). OBS att dessa lappar måste läggas på en platta (resistenplatta, medium A) som i sig inte innehåller dessa ämnen. Testen utförs som resistensbestämning (se nedan). Resistensbestämning Resistensbestämning utförs på bakteriella isolat för att bestämma vilket antibiotika som är effektivt mot den stam som har orsakat infektionen. Resistensmönster är i vissa fall även av diagnostiskt intresse (se ovan). Material: Resistensplatta (medium A), blå ögla, bomullspinnar, sterila rör och steril PBSbuffert, antibiotikatestlappar och venflon-nål Rör 1. En blå ögla doppas i 5-10 bakteriekolonier (för att få ett genetiskt representativt underlag). Den uppsamlade bakteriemassan slammas/suspenderas väl i 1 ml PBS-buffert. Denna suspension ska motsvara McFarland 0,5. Rör 2. Späd 1/100 genom att ta 10 mikroliter med blå platinös från rör 1 till 1 ml PBSbuffert. Det ger ett inokulat på ca 106 cfu (coloni forming units) per milliliter. Sätt i en steril bomullspinne och stryk ut. (se figur1). Suspensionen bör användas inom 30 minuter. Figur 1 Sätt i bomullspinne och stryk ut enl nedan Kasta Utodling. Man vill ha en så jämn bakterieväxt som möjligt på hela plattan. Det är viktigt att man får en lagom tät växt av bakterier. Lagom i det här fallet är en knappt konfluerande växt eller en nästan heltäckande matta av bakterier. Tänk på att det är en koncentrationsgradient som bildas runt den antibiotika indränkta lappen. Denna koncentrationsgradient kommer att vara lika från platta till platta (förutsatt att man följer de anvisningar som finns från tillverkarna av dessa antibiotika-lappar). Förutsatt att man 12 har en konstant mängd bakterier (knappt konfluerande växt) kan man med zonens storlek avgöra vid vilken koncentration av respektive antibiotika man har en bakterieavdödande effekt. Se under medier för vilket medie som ska användas samt bilaga jäsnings schema. Utstryk på resistensplatta. I den lösning varifrån utstryket ska göras doppas bomullspinnen ner. Med vilken man stryker ett kryss (fig 2a) och sedan tvärs över plattan som i figur 2 b. Figur 2 a Figur 2 b Figur 3 Sätt till sist, med hjälp av en venflon-nål, på en antibiotikalapp av varje sort på plattan. Fördela lapparna jämt över plattan och låt stå i rumstemperatur i 30 – 60 minuter innan ni ställer plattorna i 37oC termostat. Figur 3. Antibiotika lappar (som används i kommande laboration är) för: G+ Ampicillin, PcV, Erytromycin G- Ampicillin, Trimethoprim, Mecillinam, Nitrofurantoin Gramfärgning Denna färgningsmetod utgör basen för den indelning av bakterier i två huvudgrupper som skiljer sig med avseende på cellväggens uppbyggnad. Metoden har fått sitt namn efter den danske bakteriologen Christian Gram som 1884 upptäckte den av en slump. Han skulle utarbeta en färgningsmetod för humana vävnader och behandlade vävnadssnitt med gentianaviolett och därefter en jodkaliumjodid-lösning (Lugols lösning). När han sedan behandlade med etanol avfärgades snitten. Emellertid innehöll några av dem också bakterier och Gram fann att dessa behöll färgen vid etanol-behandling. Senare fann han att det också förekom bakterier som avfärgades av etanol. Dessa började kallas Gram-negativa till skillnad från de bakterier som behöll färgen och kallades Gram-positiva. Hur denna skillnad i färgningsreaktion uppkommer är inte helt klart men den orsakas av den grundläggande skillnaden i struktur mellan Gram-positiva och Gram-negativa bakteriers cellväggar. Ett färg- (oftast kristallviolett) jodkomplex bildas inne i bakteriernas cellvägg och kan extraheras från Gramnegativa bakterier 13 med organiska lösningsmedel (oftast alkohol eller alkohol-aceton lösning). Grampositiva bakteriers peptidoglycanrika cellväggar dehydratiseras vid behandling med dessa lösningsmedel. Detta får cellväggens porer att sluta sig och gör att färgjodkomplexet ej kan lösas ut utan stannar kvar och den Gram-positiva bakterien färgas därmed blå av kristallviolett-jodkomplexet. Gramfärgning inkluderar numera även en kontrastfärgning med rött, t.ex. karbolfuksin eller safranin, efter alkoholbehandlingen. De Gram-negativa bakterierna blir då röda av kontrastfärgen till skillnad från de blå Gram-positiva. Kocker i hopar, kedjor och par. Feta, stora, smala, små eller kockoida stavar Exempel på Utförande Gramfärgning (se även bilaga för Gramfärgnings metodik) Material: Kristallviolett i droppflaska (A), Lugols lösning i droppflaska (B), Aceton-alkohol i droppflaska (C), Karbolfuksinlösning i droppflaska (D). 0,9 % NaCl, blå ögla, objektglas, tidtagarur, brännare Hushålla med lösningarna. Akta händer, kläder och bänkar. Torka ur diskhon ordentligt efteråt. Om nödvändigt använd lite av aceton-alkohol lösningen för att få bort färgen. 1. Placera med hjälp av den blå öglan en "droppe" fysikalisk koksaltlösning (för varje koloni som ska infärgas) på ett objektglas. Objektglaset kan delas in i 6 fält. Märk med blyerts på den mattade delen. 2. Ta en aning bakteriemassa med en ögla (den mängd ni tagit ska nätt och jämt bli synlig på glaset) och lägg bredvid droppen. Rör sedan ihop bakterien och koksaltdroppen. Dropparna ska inte bli synligt grumliga. Lufttorka preparatet och fixera preparatet genom att försiktigt föra objektglaset, med bakteriesidan uppåt genom en brännares låga. (OBS kokta bakterier ändrar form) 3. Täck bakterierna med kristallviolett (A-lösning) och låt verka i 30 sek. Skölj med vatten. 4. Täck bakterierna med Lugols lösning (B-lösning) och låt verka i 30 sek. Häll av lösningen. Skölj med vatten. 14 5. Avfärga med aceton-alkohol (C-lösning) 30 sek. Skölj med vatten 6. Täck bakterierna med karbolfuksin (D-lösning) och låt verka i 30 sek. Skölj ordentligt med vatten. Låt preparaten lufttorka. 7. Läs av i mikroskop. 100* lins. Använd immersionsolja. Tvätta av mikroskopen med xylen och rispapper efter kursen. Andra infärgningsmetoder Acridiniumorange infärgning. Acridiniumorange interagerar med ds-DNA och fluorescerar med en orange färg, vilket gör det lättare att visualisera bakterier i preparat. Utförande se gramfärgning punkt 1- 4 täck sedan preparatet med acridiniumorange och låt stå en minut. Skölj med vatten och låt preparaten luft torka. Avläs i UV-mikroskop. FA - färgning. Färgning med fluoroscein iso thio cyanat inmärkta antikroppar. Används bl a till identifiering av virus t ex influenzae. Följ de anvisningar som följer med den inmärkta antikroppen. Avläses i UV-mikroskop. 15 PCR-metoden PCR metoden går ut på att göra stora mängder av en utvald bit DNA. En stor mängd DNA är ex. lättare att detektera, det är också mycket lättare att klona en sekvens/gen som man har många kopior av. PCR reaktionen masstillverkar den specifika DNA sekvensen in vitro (i provrör) i princip genom att härma själva DNA replikationen exponentiellt ca 20-30 ggr. För att reaktionen skall kunna fungera blandas bla joner som Mg2+, nukleotider, ett värmestabilt DNA polymeras, och vanligtvis två korta enkelsträngade DNA sekvenser som brukar kallas primer. Detta primerpar gör att DNA polymeraset får en fri 3´-ände att starta sin syntes ifrån. Dessa primers måste vara noga utvalda så att de fäster specifikt till varsin ände på den utvalda DNA sekvensen. PCR reaktionen är extremt känslig eftersom den teoretiskt kan upptäcka en enda kopia av en gen/DNA sekvens. Den går också mycket snabbt genom att tillverkningen är exponentiell. Men för att varje DNA bit skall kunna användas på nytt som mall i varje syntes steg så måste DNA dubbelsträngen göras enkelsträngad så att nya primers kan fästa. I PCR reaktionen görs detta genom en temperatur höjning som är så hög att DNA dubbelsträngarna inte kan hålla ihop längre (ca 95oC), man brukar kalla detta steg kort och gott denaturerings steget. Därefter sänks temperaturen till lämplig nivå så att primerparet bara fäster på sekvenser som stämmer överens i basparning, detta steg kallas annealing steget. Efter annealing steget höjs ofta temperaturen, till ca 72oC, detta steg kallas extensionsteget och är till för att varje DNA dubbelsträng ska hinna bli färdig syntetiserad i varje cykel. *Något mer om PCR reaktionens 3 temperatur steg. 1. denaturering (mha värme ca 95oC i tex 20 sekunder) strängarna i det dubbelsträngade DNA´t separerar. En för kort denaturering gör att denatureringen blir ofullständig och vi får mindre produkt. DNA polymeraset som används i PCRen är ett Polymeras som ursprungligen isolerats från en bakterie som lever i heta källor Thermus aquaticus, därav namnet Taq-polymeras. Taq-polymeraset har sitt temperatur optimum runt 72oC och tål därför PCRens höga temperaturer. En för lång denaturering gör dock att enzym aktivitet går förlorad. 2. annealing, överskott av två kemiskt syntetiserade oligonukleotider/korta enkelsträngade DNA molekyler (primers) som skall fungera som start för DNA polymeraset finns i blandningen dessa är vanligen 15-28 nt långa och binder till vardera änden av fragmentet som skall massproduceras. Det är bra om G/C innehållet i en primer inte överstiger 60%, att primerparet inte har 3´komplementaritet. Det är inte heller bra om primers kan bilda sekundära strukturer. Vidare så bör smältpunkt temperaturen för båda primers bör vara så lika som möjligt för att deras optimala annealing temperatur skall vara den samma. Se PCR handboken för att ta reda på vilken primer koncentration som är rimlig. En alltför hög koncentration ökar risken för att primers ska binda på fel ställe. Framförallt är det baskompositionen (vilka nukleotider) och längden på en primer som påverkar annealing temperaturen (antal G eller C x 4 oC + antal A eller T x 2 oC = den ungefärliga smält temperaturen). Men även 16 koncentrationen joner som K+, Na+, Mg2+ och ämnen som ex. glycerol, formamid el dyl. i bufferten påverkar vilken annealing temperatur man ska använda. Man får också tänka på att den valda annealing temperaturen påverkar både specificiteten och sensitiviteten. En så stringent annealing temperatur som möjligt (dvs en temperatur så nära smältpunkten som möjligt) ökar specificiteten (ibland på bekostnad av att sensitiviteten sjunker). Läs mer om specificitet och sensitivitet nedan. 3. extension, den optimala temperaturen för DNA polymeraset är som sagt ca 72oC vid denna temperatur inkorporereas 35-100 nukleotider/sekund. Längden och koncentrationen på target (mål) sekvensen och temperaturen bestämmer extensions tiden. PCR reaktionen bygger som sagt på att man upprepar punkt 1-3, vanligen upprepas antalet temperatur cykler 20-30 ggr. För många cykler gör att antalet ospecifika bakgrunds produkter ökar och ett för lågt antal cykler gör att produkt utbytet blir lågt. *Några problem i PCR reaktionen; Kontamination. Primer-dimer. Nukleotid felinkorporeringer. Icke specifika bakgrunds produkter pga ospecifik inbindning av primers. För att förhindra kontamination av tidigare amplifierade PCR produkter så delar man ofta in de olika momenten, preparering av prov (patientprov eller vad det kan vara), blandning av rena reagens, tillsatts av prov och detektion eller analys av PCR produkter, (mer om detta kommer nedan vid ”Försiktighetsåtgärder vid användning av PCR”). Enzymet Taq-polymeras ett värmestabilt enzym men så snart man blandat alla reagens så kan polymeraset börja Jobba. Det största problemet uppstår om primrarna fäster på varann (vilket de har möjlighet att gör vid rumstemperatur) och Taq-polymeraset börjar polymerisera ändarna, vilket ger sk. primer-dimer. Men med de nyare sk ”hot start polymerasen” (ex. amplitaq-gold) som kräver att de hettas upp till 95oC innan de blir aktiva så har man dock lyckats komma ifrån problemet. Har man inget sådant enzym så är det viktigt att försöka jobba smidigt och snabbt, eventuellt kan man förvara proverna på is från det att man pytsar mastermixen till det att man sätter i rören i PCR apparaten. Man kan också behöva komma ihåg att Taq polymeraset saknar 3´ till 5´exonukleas aktivitet därför sker ett visst mått av nukleotid felinkorporering (att fel bas sätts in). Därför är det viktigt att man använder speciella Taq polymeras med proofreading aktivitet inbyggd då PCR används för tex kloning. Framförallt är det ospecifik inbindning hos primer tex pga för låg annealing som ger icke specifika bakgrundsprodukter. 17 *Något om PCR optimering; Taq polymeras 0.5-5 unit /100 µl reaktion. För hög koncentration kan ge ospecifika bakgrunds produkter. För låg koncentration ger lågt utbyte av önskad produkt. Deoxiribonukleotidfosfat (dNTP) 20-200mM av varje nukleotid per reaktion är rimlig, en högre koncentration eller en ojämn koncentration av de fyra dNTPerna ger lätt missinkorporeringar. Joner. Mg2+ är mycket viktig för att taq-polymeraset skall fungera, dess aktivitet och noggrannhet påverkas. Vidare påverkar envärda joner som K+och Na+ men också Mg2+ primer annealing, sträng dissosieringstemperaturen, produktspecificiteten och primerdimer formation. Koncentrationen Mg2+ ligger vanligen mellan 0.5-2.5 mM per reaktion. Stimulatorer- Ex. gelatin 100mg/ml. Bovintserumalbumin (BSA) 100mg/ml. Tween 20, NP-40, laureth 0.05-0.1 %. Glycerol <20%. <1% Dimetylsulfoxide (DMSO). Inhibitorer- >1% DMSO och >0.01% SDS hämmar PCR reaktionen – åtgärd späd provet. I patient prover ex saliv så kan för mycket polysaccarider hämma - åtgärd koka provet. I urin finns urea - späd, dialysera eller gör en DNA extraktion för att få bort detta. Faeses innehåller billirubin etc. som troligen hämmar och en massa annat - åtgärd extrahera DNA. Plasma med Na+/Mg2+ - åtgärd minska Na+/Mg2+ i bufferten. Serum med heparin - åtgärd minska K+, Serum med EDTA - åtgärd minska K+, Na+ öka Mg2+, Serum med Citrat - åtgärd öka K+,Na+, Mg2+. *Några PCR applikationer; Diagnostik, kloning, HLA-typning, evolutions-studier, forensics (Brottsmål). *Några PCR varianter; Nested PCR = Två PCR reaktioner körs. Vid den första PCR reaktionen används ett primerpar (ytter primerpar). Denna reaktions produkt används som templat (provsekvens dit primers kan binda) i den andra PCR reaktionen. Den andra PCR reaktionen körs med ett primerpar (inre primerpar) som binder innanför det yttre primerparet. Semi-nested PCR = Som ovan fast i andra PCR steget används en ny primer tillsammans med den ena gamla. RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA analysis. Slumpmässsiga primer/primers (oftast korta ) används i PCR för att kunna studera skillnader i genom-strukturen ”fingerprint mönster”, mellan olika individer eller organismer. Flera regioner amplifieras. 18 Multiplex PCR = Två eller flera regioner amplifieras. Vilket gör att man tex. Kan detektera flera olika bakterier i en och samma PCR körning. Realtids-PCR = RT-PCR, här finns en nästintill oändlig möjlighet att märka in DNA och man kan tex kvantifiera och detektera flera olika sekvenser samtidigt. Detektionen av bildat DNA sker simultant (samtidigt) som syntesen sker mha dataanalys . PCR primer-riktad mutagenes = Degenererade primers används för att introducera nya DNA sekvenser. *Försiktighetsåtgärder vid användning av PCR Det är mycket viktigt speciellt för ett rutin laboratorium som använder sig av PCR för diagnostik, att förhindra spridning av amplifierade PCR-produkter. Detta kan annars leda till falskt positiva analys resultat. Det finns flera metoder som bygger på att amplifierat DNA´t efter eller före detektion på något sätt förstörs men ingen av dessa metoder kan använda sig av då man har en nested PCR. Man får istället vidta stor noggrannhet vid hanteringen, från det att man får patient provet, till analysen av resultat. Separata avdelningar, separata kläder, handskar och stor noggrannhet är A och O. *Något om specificitet och sensitivitet Med sensitivitet menas ungefär hur känsligt ett test är, tex en hög sensitivitet gör att andelen falskt negativa test resultat sjunker (1-sensitiviteten = andel falskt negativa). Med specificitet menas ungefär hur noggrant ett test är, tex en hög specificitet gör att andelen falskt positiva sjunker (1-specificiteten = andel falskt positiva). Man kan också säga så här sensitiviteten= antal med sjukdom och med positivt prov svar /dividerat med totalantal med sjukdom som testats. Och så kan man säga så här om specificiteten= antal utan sjukdom och med negativt prov svar /dividerat med totalantal utan sjukdom som testats. Om ett tests sensitivitet eller specificitet är viktig beror naturligtvis på vad det är man skall detektera. Tex så vill vi ju att ett diagnostiskt test för HIV skall ha så hög sensitivitet som möjligt. Men det är kanske mindre viktigt med sensitiviteten då man skall diagnostisera L.pne. Eftersom man inte kunnat påvisas att L.pne smittar mellan människor och eftersom det är dumt att behandla med antibiotika i onödan så borde man använda ett test som prioriterar specificitet framför sensitivitet då man ska diagnostisera L.pne. 19 Bakterien Legionella pneumophilia Legionella pneumophilia (L.pne) är en Gramnegativ stavformad bakterie. L.pne finns ute i naturen i våra sjöar och vattendrag men bakterien kan också växa till tex i våra luftfuktare, varmvattenberedare och rörsystem, tack vare sin stora temperatur tålighet. L.pne kan överleva lång tid i temperaturer mellan 4oC-60oC, men tillväxer endast i temperaturer mellan 25oC-45oC, med ett temperatur optimum mellan 35oC -37oC. Eftersom L.pne kan infektera människor så är det därför viktigt att vattnet tex i våra duschar är tillräckligt upphettat och att man tex klorerar vatten där upphettning inte kan användas. L.pne fagocyteras in i makrofager och monocyter i lungornas alveoler, där växer dom till och sprider sig så småningom till andra celler. L.pne kan ge upphov till två olika sjukdomar Legionärssjukan och Pontiac feber. Symptomen på legionärssjuka kommer efter 2-10 dagar med inflammation i lungorna, hög feber, huvudvärk och ont i magen. Pontiac feber liknar mer en allergisk reaktion och ger inte lunginflammation. Det är framförallt immunsupprimerade patienter (patienter med nedsatt immunförsvar) som drabbas men även personer med kronisk bronkit, emfysem etc. är utsatta. Det har också visat sig att en stor del av befolkningen har legionella antikroppar vilket kan tyda på att många haft en asymptomatisk infektion. En metod för att detektera Legionella Pneumophilia är odling på agarplatta, metoden tar dock lång tid. Det vanligaste odlingsmediet som används är Charcoal Yeast Extract (CYE)agar med tillsats av cystein och järn joner. Eftersom L.pne växer upp mycket sakta så tillsätts också antibiotika till odlingsmediet för att hämma andra bakteriers tillväxt. Provet som tas på patienten kan vara tex. bronksköljvätska (BAL) eller sputum. Om odling görs på vatten på lab som tex AL-kontroll måste i regel vattnet filtreras genom ett filter med porstorleken 0.2µm, filtret läggs sedan i destillerat vatten och vortexas så att bakterierna lossnar. Övriga metoder som används för detektion är tex direkt immunofluorescens med monoklonala antikroppar mot Legionella, lösliga antigen kan också detekteras med RIA (radio immuno assay) eller EIA (enzyme immuno assay). Och sist men inte minst så har vi PCR metoden för detektion av L.pne. Många har tagit fram primers för detektion av L.pne DNA, vilket innebär att det finns olika PCR reaktioner som detekterar olika delar av DNA´t eftersom det handlar om olika primers. Vidare så finns det både enkla, seminestade och nestade PCR system för detektion av L.pne, de nestade systemen är mer noggranna (specifika) och ofta mer känsliga (sensitiva). 20 Laboration v.40 Metoder för kvantifiering av bakterier Uppgift Vid laborationen ska de olika faserna av bakteriers tillväxt visas genom att två tillväxtkurvor görs. Den ena ska visa OD600 mot tiden medan den andra ska visa bakteriekoncentrationen mot tiden. Baserad på dessa kurvor ska bakteriesuspensionen spädas till lämplig koncentration och odlas ut på platta. Kolonierna räknas sedan nästa dag och en jämförelse görs med det antal kolonier som växer och det antal som förväntades växa. Bakteriens generationstid samt den bakteriekoncentration som motsvarar 1 OD600 skall också beräknas. Materiel Materiel som erhålls: Mikroskop Bürker räknekammare Racklor Petriskålar E.coli i LB-medium Materiel som ska göras: LB-plattor (6 plattor/pers) 100 ml LB-medium i steril 250 ml E-kolv (1 kolv/grupp) Recept för LB-medium NaCl 171 mM Trypton 1% (w/v) Jästextrakt 0,5% (w/v) pH ställs till 7,4 med HCl & NaOH Recept för LB-plattor NaCl 171 mM Trypton 1% (w/v) Jästextrakt 0,5% (w/v) Agar 1,5% (w/v) pH ställs till 7,4 med HCl & NaOH Till varje platta går det åt 30-35 ml. 21 Utförande Dag1 LB-medium/plattor görs. En 250 ml E-kolv med 100 ml LB-medium autoklaveras. Lösningen till plattorna autoklaveras i flaska innan den hälls upp i petriskålarna. Tänk på att inte starta autoklaven förrän alla grupper har ställt in sina lösningar i autoklaven! Dag2 Blanda övernatt kulturen väl och ympa 1ml av denna till E-kolven med 100 ml LB-medium. Placera E-kolven i skakinkubator vid 37°C. Tag ut prover (ca 2 ml) med steril pipett och överför till sterilt 15 ml Falconrör, sätt på is. Prover tas var 30:e minut (exakt tid noteras vid varje provtagning). Fortsätt provtagningen i minst 4 timmar vilket ger minst 9 prover totalt. Mät provernas turbiditet genom att mäta den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) med en spektrofotometer. Om OD600 överstiger l,0 späds en del av provet så att OD understiger 1,0 ex. 1:4 med LB-medium. Som referens och blank används LB-medium. Turbiditeten är proportionell mot den totala cellkoncentrationen, men proportionalitetskonstanten beror på typ av celler, tillväxtbetingelserna och på typen av spektrofotometer som används. I detta moment bestäms den relationen mellan den totala cellkoncentrationen och A600 för E. coli JM109 vid tillväxt i LB-medium. Räkna samtliga prover i Bürker. Om du tycker att bakterierna ligger för tätt så späd med LBmedium tills du tycker att bakterierna ligger lagom tätt. OD600 över 0,4 uppfattas ofta som väldigt tätt. Späd en del av suspensionerna med LB-medium så att en celltäthet på 1000-3000 celler per ml erhålls (utgå från beräknade celltätheter från föregående moment) genom att göra en lämplig spädningsserie. Utgå från 3 olika prover med olika bakteriekoncentration (låg, medel, hög). Sprid l00 µl av den spädda suspensionen noggrant på LB-agarplatta med en rackla. Placera plattorna med locken nedåt i 37°C över natt. 22 Gör dubbelprover på plattan. Odla alltså varje spädning på 2 olika plattor och ta medelvärdet av antalet kolonier. Dag3 Räkna antalet kolonier på LB-agarplattorna och beräkna antalet cfu/ml för den ursprungliga ospädda cellsuspensionen. Rita diagram med logaritmerna för totalantalet cfu/ml och OD600 som funktion av tiden för odlingen. Beräkna generationstiden (tiden det tar för antalet celler att fördubblas) med hjälp av nedstående formler. Beräkna också hur många bakterier som motsvarar 1 OD600. Beräkning av generationstiden De flesta bakterier förökar sig genom enkel delning enl: 1→2→4→8→→→2 n Om n=antalet generationer, N=antal bakterier, N0= antal bakterier från början av log-fasen, fås följande ekvation: N = N 0 ⋅ 2 n - exponentiell tillväxt g= t( N − N0 ) n g= generationstiden, t= tid (min av exponentiell tillväxt) Examination: Muntlig examination, samt labrapport. För labrapport se instruktioner nedan ”Hur skrivs rapporten?” 23 Praktisk examination 25 µl och 100 µl LB-medium eller vatten pipetteras 10 gånger vardera och vägs. Medelvärde, standardavvikelse och CV beräknas. För betyget Godkänd krävs en variationskoefficient (CV) på högst 2 % för 25µl och 1 % för 100µl. x= s= ∑ xi medelvärde n 1 ( xi − x ) 2 ∑ n −1 CV = 100 ⋅ s x standardavvikelse variationskoefficient 24 25 Bürker räknekammare 26 27 Hur skrivs rapporten? Sammanfattning Här skrivs en sammanfattning där rapportens alla delar finns representerade (oftast ej ref). Skrivs ofta sist. Inledning Här presenteras ämnesfältet. Ge en bakgrund till varför man vill veta bakt.konc i olika sammanhang. Inte bara vid sjukdomar. Om bakteriers tillväxt. Tillväxtkurva och faser. Ange referenser! Material & metod Vad gjordes och hur? Redogör för odlingsmediet. Vilken bakterie användes och hur följdes den? Vilka rutor i Bürker användes? Hur gjordes konc och OD uträkningen? Hur beräknades generationstiden? Formler redovisas. Resultat & Diskussion Här redovisas resultaten och de sätts in i ett sammanhang. Vad betyder de? Ange referenser! Diskutera alternativa sätt att göra det ni har gjort. Andra sätt för att beräkna generationstid och omvandlingsfaktor (OD600 till cfu/ml) mha kurvorna. Hur korrelerar OD600 och Bürker räkningarna till varandra? Här redovisas kurvor eller i bilaga. Diskutera problem som uppkomit vid de olika metoderna. Är det någon metod som är mer eller mindre pålitlig? Om resultat & diskussion delas upp i två egna delar ska resultatet enbart innehålla resultat och ingen diskussion. Resultatet redovisas gärna i tabeller och figurer, men förklarande text måste finnas med. Tabeller och figurer får aldrig finnas utan tabell- (över) och figur- (under) texter. I brödtexten måste hänvisningar till tabeller & figurer finnas. Referenser Numrerad lista efter när de dyker upp första gången i texten. 28 Exempel på hur referenser kan skrivas i referenslistan: Artikel 1. Clynes R.A. Towers T.L. Presta L.G. Ravetch J.V. (2000) Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med. 6:443-446. Bok 2. Lundblad R.L. (1995) Techniques in protein modification. CRC press: Boca Raton, FL. USA. Kapitel ur bok 3. Filpula D. McGuire J. Whitlow M. (1996). Production of single-chain Fv monomers and multimers. In Antibody Engineering. (McCafferty J. Hoogenboom H.R. Chisell D.J. eds) pp. 255, IRL press, Oxford. Web-adress 4. Antibody resource page. www.antibodyresource.com Datum Bilaga Kurvor kan tänkas ligga i en bilaga. Pipettereingsuppgiften kan läggas i en bilaga, eller bara medhäftad. Om bilaga finns måste hänvisning till denna finnas någonstans i rapporttexten. För godkänt måste följande redovisas: • • • • • • Kurvor för OD600 & cfu/ml Beräkningen från Bürker till Cfu/ml Beräkning av generationstiden 1 OD600 ≈ X Cfu/ml Cfu/ml baserat på viable count, samt hur spädningsserien är gjord Ange ytterligare ett sätt (än de ni använt under laborationen) att kvantifiera bakterier 29 Laboration v.41 Detektion av Legionella pneumophilia med nestad PCR Frågeställning: Vattenlednings system med tillväxt av Legionella pneumophilia eller Patient med misstänkt Legionella pneumophilia infektion=> Isolering av Bakterien Legionella pneumophilia. Provtagning; vattenprov med filtrering eller BAL alt sputum prov) => Preparering av Legionella pneumophilia DNA=> Amplifiering av DNA; PCR steg 1 => PCR steg 2 => Detektion av amplifierat Legionella pneumophilia DNA på agarose gel. Enzymatisk amplifiering mha PCR av specifika sekvenser för detektion av bakterier, virus eller parasiter är en mycket användbar metod, speciellt i de fall där odling, serologi etc visat sig vara otillräckliga och/eller långsamma. I laborationen har vi valt att detektera Legionella Pneumophilia (L.pneumophilia) mha PCR. För att öka specificiteten och sensitiviteten så har vi valt att använda en PCR som bygger på amplifiering i två steg med två olika primerpar, en sk nested PCR. Den nestade PCRen för detektion av L.pneumophilia är utformad så att det första PCR steget amplifierar en region som är ca 625 bp i 30 cykler. 1/50 (1µl ) av produkten från denna första amplifiering tas därefter ut till ett ytterligare PCR steg, i detta andra steg amplifieras i 30 cykler en region (inom det 625 bp fragmentet) som är ca450 bp. Storleken på de nestade PCR produkterna analyseras därefter på en EtBr inmärkt agarosgel (även PCR produkterna från PCR reaktionens första steg kan analyseras på gel, det kan ibland ge en indikation om koncentrationen bakterier i ursprungs provet var högt eller lågt). Man kan också detektera PCR produkterna på andra sätt än på gel tex. Mha dot-blot och ELISA men i båda dessa detektionssätt behövs en sk probe en enkelsträngad DNA sekvens som fångar upp PCR produkter (som först måste göras enkelsträngade). 30 Den nestade PCR´n ökar som sagt specificiteten men också sensitiviteten till viss del eftersom amplifieringen totalt körs 60 cykler och detta hade inte varit möjligt med ett enda primerpar det hade ökat icke specifika bakgrunds produkter. Inom de amplifierade fragmenten finns också ett restriktions-site, som kan användas för att ytterligare verifiera att det är rätt DNA fragment dvs sannolikheten ökar ytterligare att det verkligen är L.pne patienten har. Detta ska dock vi inte göra i denna lab. Laborations utförande Dag 1-Dag2: 1.)DNA preparation av L.pneumophila bakterier. Varje grupp skall analysera minst ett positivt och ett negativt prov. DNA preparationerna skall göras i ”provpreparerings/provtillsats-rummet” (gör i ordning en dela av eran bänk yta som är avsatt för detta). Vi ska använda oss av ett kit från QIAGEN (DNeasy tissue kit ) se separat beskrivning (DNeasy Tissue Handbook) finns på nätet och på kurshemsidan. Med hjälp av denna beskrivning ska ni själva ta fram metoden för ”framrening av DNA från Gram negativ bakterie”. 2.)Koncentration och renhetsmätning i spektrofotometer På DNA´t som ni renat fram med DNeasy tissue kit ska en ungefärlig koncentration och renhet bestämmas i spektrofotometer vid 260 respektive 280 nm. Mätningen sker i quartz kyvett. En del av det framrenade provet tex 1/5del spädes med vatten till en volym på 500µl. Nollställ spektrofotometern med vatten och mät vid 260 respektive 280 nm. Vid 260 nm absorberar nukleinsyra (DNA och RNA) ljuset, ett absorberat värde 1 motsvarar en koncentration på ca 50 µg/ml. Räkna ut vilken koncentration nukleinsyra du har i ditt (ospädda) prov. Vid 280 nm absorberar vissa aminosyror (de aromatiska) ljus värdet vid 280nm kan därför ses som ett mått på mängden protein, genom att ta kvoten på värdet vid 260 nm genom värdet vid 280 nm så får man en uppskattning om renheten (mängden nukleinsyra i förhållande till mängden protein). I DNA tissue kit hittar ni en hel del tips som ni kan använda vid koncentrations och renhets mätning och tolkning. 3.)PCR förberedelser. Läs informationen i ”Taq PCR Handbook” innan du ”sätter upp”/startar dina PCR reaktioner. Ta reda på vad en mastermix är (se nedan) och vad syftet med denna är. Fundera över om man kan pipettera 1 mikroliter (µl) exakt? Innan ni börjar blanda mastermix (reagensen till alla PCR reaktionen) måste ni , för att undvika kontamination, organisera de olika rummen (bänkytorna) för blandning av rena reagens och provtillsats renat DNA och PCR produkt steg 2. 31 4.)PCR steg 1, reagens ”Tag PCR core kit” I PCR steg 1 används primers Lmip 920 (5´-GCT ACA GAC AAG GAT AAG TTG-3´) och Lmip 1548 (5´-GTT TTG TAT GAC TTT AAT TCA-3´). I ”rena reagens rummet” blandas PCRens reaktions mix den sk ”master mixen” . Volymerna per prov är följande; 24.7 µl vatten, 5 µl 10x PCR buffert, 6 µl Mg 2+ (25 mM), 2 µl dNTP-mix (10mM vardera av dATP, dTTP, dGTP dCTP),1µl primer Lmip 920 (50 µM), 1 µl primer Lmip 1548 (50 µM) och 0.3 µl Taq-polymeras (5 unit/µl). Mängderna ovan är angivna för ett prov om fler prov ska analyseras ex. 3 så blandas ca 3.2 gånger mängden av allt (annars räcker det oftast inte, eftersom det blir ett svinn i rör och pipett tipp), detta mixas noga och pytsas upp på 3 rör (i detta fall 40 µl till varje rör) för att få exakt samma proportioner av alla de ingående reagensen (detta är annars svårt att få när man pipetterar så liten mängd av så många olika saker). Rören med ”master mix” tas sedan till ”provpreparerings/provtillsats-rummet ” där 10 µl prov (legionella DNA eller vatten) tillsätts. Proven placeras i PCR apparaten och körs i ett program med följande temperaturer och tider; 94oC i 15 minuter, 30 cykler i 94oC i 30 sek., 50oC i 30 sek., och 72oC i 60 sek..Och slutligen 72oC i 6 minuter. 5.)PCR steg 2, reagens ”Tag PCR core kit” I PCR steg 2 används primers Lmip 976 (5´-TAA AAA TCA AGG CAT AGA TG -3´) och Lmip 1427 (5´-AGA CCT GAG GGA ACA TAA AT -3´). I ”rena reagens rummet” blandas ”master mixen” , volymerna per prov är; 33.7 µl vatten, 5 µl 10x PCR buffert, 6 µl Mg 2+ (25 mM), 2 µl dNTP-mix (10mM vardera av dATP, dTTP, dGTP dCTP),1 µl primer Lmip 976 (50 µM), 1 µl primer Lmip 1427 (50 µM) och 0.3 µl Taqpolymeras (5 unit/µl). Rören med 49 µl ”master mix” tas sedan till ”provtillsats-rummet nestade-steget” där 1µl av PCR produkterna från steg 1 överförs till respektive mix. Proven placeras i PCR apparaten GenAmp PCR System 2400 och körs i ett program med följande temperaturer och tider; 94oC i 15 minuter, 30 cykler i 94oC i 30 sek., 55oC i 30 sek., och 72oC i 60 sek.. Och slutligen 72oC i 7 minuter. 32 6.) Analys av storlek på PCR produkter och koncentration/renhet på det framrenade DNA´t på agarosegel Blanda TAE-buffert (Tris-acetat-EDTA) så att det räcker till en gel och ett litet geltråg (det går åt ca 300 ml totalt). Recept på TAE-buffert hittar ni på nätet eller i Manniatis. Gjut en 1.5% agarosgel (vikt/volym%). Använd dom små gelhållarna som rymmer ca 40 ml gel. Tag rätt mängd agaros och blanda med TAE-buffert, lös upp agarosen genom att koka blandningen i mikrovågsugn. Lösningen är färdig kokt då den är helt genomskinlig. Låt sedan lösningen svalna till 55oC (bäst att använda vattenbad) tillsätt då 2 µl EtBr (ethidiumbromid 10 mg/ml). Tejpa kanterna på gelhållaren och se till att den står plant. Häll i gelen (ca 5 mm hög) och sätt i 2 kammar (med breda tänder). OBS! då ni häller gelen får den inte vara kallare än 50oC, häll den därför direkt efter att ni tillsatt EtBr och blandat försiktigt. Låt svalna i rumstemperatur och ställ sedan gelen i kylen minst 10 minuter innan ni tar ur kammarna. Om gelen inte skall användas direkt så förvara den inslagen i gladpack i kylen. PCR produkterna från steg 1 och 2 tas från kyl till ”amplifieratmaterial rum”. Här blandas 15 µl av varje PCR produkt med 3 µl färglösning (BPB) på en bit parafilm innan det pipetteras på gelen. Av molekylviktsmarkören tas 5 µl den sätts någonstans i mitten på varje gel rad. Vilken storlek har banden i molekylviktsmarkören? Försök hitta detta på nätet. Firma och namn på molekylviktsmarkören står på rörets etikett dessa kan ni använda som sökord på nätet. Gelelektroforesen körs vid 50-75 V i ca 80 minuter (det negativt laddade DNA´t vandrar mot den positiva polen), därefter placeras gelen på UV bordet och fotograferas. Resultatet analyseras. I labrapporten skall gelen beskrivas så noga som möjligt. Mha MW-markören får ni reda på om storleken på PCR produkterna verkar stämma. Examination av ”Legionella PCR laborationen” sker genom lab rapport Hur skrivs denna rapport? Labrapporten ska vara skriven på dator och innehålla; TITELSIDA. Med laborationstitel, Laborantens namn, laborationsdatum och handledare. Försätts blad finns som separat fil på kurshemsidan. SAMMANFATTNING. Mycket kort inledning, sammanfattning över vad som gjorts och de viktigaste resultaten samt de slutsatser man kommit fram till (alltså egentligen en mycket kortfattad version av inledning, material och metod, resultat och diskussion) INLEDNING Allmänt om bakterien, medicinsk bakgrund, syfte med patientprovtagning respektive vattenprovtagning. Principerna för PCR metoden, DNA preparations metoden (reagensen i qiagen kitet- beskriv deras betydelse/funktion), spektrofotometermätning och 33 gelelektroforesmetoden. Problemställning och avsikt med laborationen ska också finnas med här (helst sist i inledning). MATERIAL OCH METOD. Beskrivning av vad som gjorts vilket material och vilka metoder som använts, beskriv i stora drag med egna ord (dvs skriv inte av labhandledningen), volymer är tex oftast inte intressant att få veta om man inte vet koncentrationen. Ta med avvikelser från metodbeskrivningen och uträkningar. RESULTAT. Beskriv resultatet i en löpande text samt figur för gel och tabell för spektrofotometer resultatet. Börja helst inte resultatet med att smacka dit figur eller tabell, utan börja med någon/några inledande meningar. Koncentration och renhet på det framrenade DNA´t ska som sagt finnas med. Gel fotografiet (som är erat absolut viktigaste resultat) beskrivs i detalj, varje brunn som visas skall vara numrerad och fotot skall ha en figur text. Mha MW-markören ”track it” om det är den ni använt 0.1 µg/µl (storlek på banden: 2652, 800, 700, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50) får ni reda på om storleken på PCR produkterna verkar stämma. Rita en kurva på molekylviktsmarkören, med vandringssträckan från brunn till band i cm på x-axeln och antal baspar i de olika banden på y-axeln. Mät sedan era PCR produkter hur långt de vandrat i cm, gå sedan in på kurvan och se hur många baspar det motsvarar. Försök att uppskatta om koncentrationen bakterier i provet var högt eller lågt beroende på om ni kan se band i PCRens steg 1. Hur ser gelen ut i övrigt? Är molekylviktsmarkörens band tydliga? Är det tex klara tydliga band på det positiva provet? Eller kan man tex se ljusa släpspår (sk smear) på gelen? Är den negativa kontrollen helt ren? Har primerparet bildat primer dimer så kan man se det ganska långt ner. Ibland om man haft lite för hög koncentration av primers kan man se ljusare partier ytterligare lite längre ner. UPPSKATTA KONCERNTRATIONEN framrenat DNA VISUELLT på gelen (mha MW markören) och jämför med koncentrationsbestämningen i spektrofotometern. Ex. på hur man kan göra, använd figur X brunn 14 (framrenat DNA) och brunn 16 (MW-markör, totalt har 2 µl av denna markör à 0.5 µg/ml satts på gelen dvs totalt 1 µg, i texten på samma gel finns antal band i denna markör samt hur många baspar varje band är. När man vet detta kan man tex räkna ut hur mycket DNA det finns i det tjocka 500 bp bandet eftersom jag kan räkna ut hur stor del av den totala mängden DNA i µg som detta band utgör……….500x2 eftersom det av just detta band finns 2st)/(100+200+300+400+500+500+600+700+800+900+1000+1100+1200+1300+1400))x 1µg = antal µg i 500bpbandet -> Nu måste jag visuellt avgöra om mitt DNA i ex brunn 14 lyser lika mycket som 500bp bandet ellet 1.5 ggr mer eller ½ så mycket. Lyser det lika starkt så innehåller mitt DNA lika mycket som 500bp bandet, lyser det hälften så mycket så finns det hälften så mycket………. -FIGURTEXT ska finnas under alla figurer!!!! -TABELLTEXT ovan alla tabeller!!!! Hänvisa tydligt till figurer och tabeller i texten!!! OBS! Om ni inte fått ett tillfredställande resulat på er egen gel kan ni utgå från den gelbild som finns inlagd nedan (figur X) och istället försöka använda och tolka detta resultat!! DISKUSSION. Redogörelse för hur resultat tolkas. Om resultatet var exakt det väntade, om inte varför blev det så då, var noga med att få med eventuella felkällor. 34 REFERENSER. Ange vilken litteratur alt web adresser som används. Referenser ska skrivas efter aktuell text. Se instruktioner i föregående lab v.40 För välgodkänt (VG) skulle följande kunna läggas till i inledningen eller diskussionen; Lite om sensitivitet och specificitet, samt hur viktigt det är att inte få spridning av amplifierade PCR produkter och hur man undviker detta. Ni bör också ta tex medline till hjälp för att hitta aktuell forskning kring bakterien L.pne och då framförallt metoder som finns för att detektera/diagnostisera L.pne. Ett plus är att ta med andra metoder än agarosegel som finns för att detektera PCR produkter. Beskriv real-tids PCR. Tänk på tempus i labrapporten! *Inledning: allmänt beskrivet ex. ”Legionella bakterien är en stavformad G- bakterie…..” ”PCR metoden är baserad på följande steg…….” *Material och metod: Det är ingen metodbeskrivning utan en beskrivning av vad ni har gjort ex. ” DNA från legionella bakterien renades fram mha QIAgen tissue kit….” ”PCRéns master mix innehöll följande komponenter… *Resultat: ”Resultatet från spektrofotometermätnigen av det framrenade DNA´t gav följande absorbansvärden…..””Analys av PCR produkter på EtBr inmärkt agarosgel visade att…(se figur…) *Diskussion: ”Resultaten från den visuella koncentrationsbedömningen och koncentrations mätningen i spektrofotometern vid 260 nm visar att dessa två metoder…..”” Resultaten från analysen av de nestade PCRprodukterna visar att kontamination har resulterat i falskt positiva resultat i ett flertal fall” ” Det är mest troligt att kontaminationen har skett……andra troliga ….” 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Figur X: Brunn:1; 50bp ” track it” (baspar (bp) anges ej för denna markör eftersom den är nedbruten), 2; steg1 pos, 3; steg 1 neg, 4; steg 2 pos, 5; steg 2 neg6; DNA pos (syns ej fast det borde), 7;DNA neg, 8; MW markör 100bpladder totalt har 2 µ l av denna markör à 0.5 µg/ml satts på gelen Storlek på band i bp100,200,300, 400, 500(dubbelt så många av denna storlek därför är detta band tjockare),600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400). Brunn 9-16 samma som 1-8 ovan. (fast här syns även positivt i brunn 11 i steg 1 negativt och framrenat DNA brun 14 (totalt 10 µl satt på gel) 36 Laboration v.42 Identifiering av okänd bakterie från patientprov Uppgift/Tentamen Ni jobba individuellt och varje student får sex okända bakteriearter. Dessa skall identifieras d.v.s. artbestämmas och resistensbestämmas. Proverna har från provtagningsrören odlats ut på blodagarplattor och det är rena kulturer. Använd adekvat kunskap och litteratur, för att identifiera de utlämnade mikroorganismerna. De ska typas så långt ni kan och förses med relevant resistensbestämning. De mikrober som kan förekomma i proverna är: Beta-hemolyserande Streptokocker gr. A, Beta-hemolyserande Streptokocker gr. B, Beta-hemolyserande Streptokocker gr. C eller G, Candida albicans, Enterokocker, E. Coli, Klebsiella pneumoniae Pneumokocker, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa, Stafylococcus aureus, Stafylococcus epidermidis Stafylococcus saprophyticus, Streptokock viridans (alfa-streptokocker) Bacillus cereus, Moraxella (Branhamella) catharralis Ni har till ert förfogande Av dessa tester ska ni välja ut de som är relevanta. OBS! Det finns bara hemtaget reagens för adekvata tester (Kör ni allt mot alla kommer reagens inte att räcka!) Reagens till gramfärgning Blodplatta (delas in i tre delar, använd till samtliga stammar dvs tre stammar per platta), Streptplatta, Blå-platta, Resistensplatta; medium A, Esculinplatta (delas in i åtta delar, använd samma platta till flera grupper), DNA-platta (delas in i åtta delar, använd samma platta till flera grupper), urea-rör, SIM-rör, OD-rör, ONPG-rör, 3 % H2O2 ,Oxidas, Uppsättning för latexagglutintion, Bacitracinlappar Optichinlappar, Novobiocinlappar, Antibiotikalappar 1 M HCl Examination Muntlig examination enskilt, redovisa stegvis hur du gått tillväga vid identifiering 37 Laboration v.43 Svalg & Urin, identifiering av bakterier i patientprov Svalg, material 5 st Strep A+ (snabbtest), uppsättning för latexagglutination gr. A-G, 5 streptplattor, 5 Bacitracinlappar, 5 Optochinlappar, 3 % H2O2 Utförande: Dag 1: 1) Ta med en provtagningspinne varsitt prov från munhålan och svalget. Gör utstryk på en streptplatta. Odla ut 3 st "patientprov" på samma sätt. a)Lägg en bacitracinlapp och en optochinlapp i området mellan primär och sekundär utstryket på respektive platta. b) Inkubera 37oC över natt 2) Testa proverna" med Strep A+. Ett kommersiellt test för snabb detektion av grupp A streptokocker. Följ anvisningarna som medföljer testet (se bilaga). Notera resultatet. Dag 2: Läs anvisningarna till latexagglutinationen, gör de spädningar som behövs för användning till helklass. 1) Läs av plattorna, notera om det finns α eller β hemolys och mät eventuell relevant zon runt bacitracin och optochin lapp. 2) Gruppera de β-hemolytiska streptokockerna. Följ bruksanvisningen som följer med kittet. Urin, material 6 st blå-plattor, SIM-rör (Indol, H2S och rörlighet), Urearör, OD (Ornitindekarboxylas), ONPG-rör, Novobiocin-lappar, Esculinplatta (Plattan delas in i 8 delar), DNA-platta (Plattan delas in i 8 delar), 3 % H2O2 , resistensplattor och antibiotika lappar: ampicillin, trimethoprim, mecillinam och nitrofurantoin, PcV, Erytromycin Dag 1: 1) Ta ett eget urinprov. För att undvika att få med normalflora från huden ska urinprovet tas så rent som möjligt. Man odlar från mittströmsurin ( dvs man tar inte den första urinen som kommer, pga förorenings risken). Se bilaga 3. 2) Odla ut varsitt urinprov och 4 st urinprov på varsin blå-platta. (6 st prov per grupp). Ta en fylld vit ögla och odla ut enl nedan. OBS! Öglan (som rätt använd tar 1 µl) ska vara fylld men inte överfylld, det får inte hänga en droppe i den. Odla ut som i figur. Var lätt på handen, man skär lätt genom agarn. 38 3) Inkubera 37oC över natt. Dag 2. 1) Läs av blå-plattorna. Notera vad ni ser. Räkna ut hur många bakterier per milliliter som finns i provet. Om det i provet finns >104 av en sorts bakterie typar man och resistensbestämmer bakterien även om man räknar med att det ska vara >105 bakterier per milliliter vid två tillfällen för att man ska vara säker på att det är en urinvägsinfektion. 2) Gramfärga de stammar det finns fler än 104 av. 3) Typa stammarna. a) Typa de gram-positiva stammarna. Vilka G+ bakterier föväntas du hitta? Välj mellan tester som katalas, novobiocinkänslighet, DNA:se och esculinplatta. b) Typa de gram-negativa stammarna. Vilka G- bakterier förväntas du hitta? Använd ”jäsningrör” för att se vilken stam. 4) Testa stammarna för antibiotika känslighet. Dag 3 1. Läs av och tolka de olika typningarna. (se även bilaga - jäsningsschema). 2. Läs av resistens mönstren. Se bilaga 1. Examination Varje labgrupp funderar igenom laborationen ordentligt se 5 punkter nedan, och redovisar sedan resultaten muntligt. 1. Förbered er skriftligt så att ni kan redogöra munligt för de bakterierna ni hittade i ert prov. Spar plattorna för att kunna gå tillbaka och titta. 2. Redogör för i vilka prov det finns luftvägspatogener respektive enbart normalflora. Bestäm så långt ni kan vilka/vilken luftvägspatogen ni har. Beskriv hur ni har kommit fram till dessa resultat? Dokumentera steg för steg! Vilken klinisk relevans har dessa? 3. Redogör för i vilka prov det finns urinvägspatogener respektive enbart normalflora. Vilken betydelse har provtagningstekniken? Bestäm så långt ni kan vilka/en urinvägsvägspatogen ni har. Beskriv och dokumentera steg för steg hur ni har kommit fram till dessa resultat? Vilken klinisk relevans har dessa? Redogör för resistensbestämning samt utvärdera de resistensmönster ni har fått. 4. Fundera över analysprincipen för StrepA + testet, och ge ett möjligt förslag på hur den fungerar. 5. Fördelar/nackdelar med snabbtester kontra referensmetoder. Är det någon skillnad i resultat på de olika detektionsmetoderna? Fördelar/nackdelar? 39 Seminarium/Grupparbete i genetik Man ingår i en grupp och tanken är att personerna i gruppen ska ”prata ihop sig” kring ett ämne som valts, se nedan 8 stycken exempel på seminarieämne, meddela Ann Erlandsson så snart som möjligt vilka personer som har valt vilket ämne. Först till kvarn…Varje student redovisar 10-15 minuter, ni måste tillsammans i gruppen komma överens om vad var och en ska prata om så att kurskamraterna som lyssnar får en helhetsbild och en förståelse för ämnet. Det är naturligtvis tillåtet att medföra litteratur och egna anteckningar vid seminariet. Använd gärna OH-bilder, PowerPoint eller skriv på tavlan för att göra informationen lättare att ta till sig. Det är obligatorisk närvaro vid alla seminarieredovisningar! Uppgiften betygssätts med U eller G Nedan följer 8 exempel på seminarieämnen: 1. ”Genmodifierade organismer (GMO) ex. bakterier, växter och djur, regler/lagar, fördelar och nackdelar…exemplifiera ex ”the golden rice”etc” 2. ”Hur klonar man gener? Vilka steg ingår då tex vaccin eller läkemedel tas fram mha kloning, beskriv gärna från det att man plockar ut genen till dess att man har ett färdigt piller på apoteket…” 3. ”Ärftliga sjukdomar, dominant? recessiv?; cystisk fibros, fenylketonuri, duchennes muskeldystrofi, blödarsjuka (typ A), huntingtons sjuka etc.. och vad är genterapi? Kan man med genterapi bota ärftliga sjukdomar? 4. ”Fosterdiagnostik baserade på gentester, provrörsbarn och vad är ett klonat djur ex. fåret Dolly?..” 5. ”Vad är embryonala respektive vuxna stamceller? Och vad kan man använda stamceller till? Laga skadat hjärta? Bota diabetes och behandla parkinsson? Nackdelar?...” 6. ”Kriminologi, genetiska fingeravtryck, hur går det till från blodfläck till fängelse, mass-test? och spanings register?...” 7. ” Diagnostik/Epidemiologisk typning av mikroorganismer med genteknik/molekylärbiologiska metoder ex. realtids-PCR, PCR, sekvensering eller dylikt, ge exempel på mikroorganismer som nuförtiden diagnostiseras mha att man analyserar/hittar deras arvsmassan…” 8. ”Geners roll vi cancer, reglering av celldelning, onkogener, vad kan förändra gener? Miljögifter? etc…” 40 Studiehandledning BLGAM0 Mikrobiologisk metodik med genteknik Kursens mål är att studenten efter genomgången kurs ska ha inhämtat grundläggande kunskaper i mikrobiologisk metodik samt genteknik Efter genomgången kurs ska studenterna kunna: Identifiera bakterier i okända prov samt urin och svalg prover genom praktiskt arbete Beskriva vad som hänt när det blir ett positivt resultat i ett OD-test, SIM-test, oxidase-test, ureas-test och katalas-test Identifiera vilket ämne och vilken reaktion det är i följande odlingsplattor; blå-platta, esculin-platta, DNA-platta, blod-platta och strep-platta som ger en diagnostisk eller selektiv möjlighet vid odling Identifiera vilken bakterie det rör sig om utifrån följande resultat från odling, gramfärgning, biokemiska test och eventuell test av bacitracin/novobiocin zon; • Vid färgning enligt Gram; blåa kocker, Katalas negativ, beta-hemolyserande, bacitracin 16 mm • Vid färgning enligt Gram; röda stavar Oxidase-test ger inget färgomslag, fermenterar laktos, urea-röret är rött, OD-röret gult, SIM-röret: H2S-röret ”beige”, Indol ofärgat och ej rörlig • Vid färgning enligt Gram; röda stavar Oxidase negativa, Fermenterar laktos, urea-röret gult, OD-röret lila SIM-röret: H2S-röret ”beige”, Indol rött och rörlig • Vid färgning enligt Gram; blåa kocker, Katalas positiv, DNA-platta ej utfällning runt bakt, novobiocin 24 mm • Vid färgning enligt Gram; blåa kocker Katalas positiv, DNA-platta fällning runt bakt, novobiocin 5 mm • Vid färgning enligt Gram; blåa kocker Katalas positiv, DNA-platta fällning runt bakt, novobiocin 24 mm • Vid färgning enligt Gram; blåa kocker Katalas negativ, beta-hemolyserande, bacitracin 16 mm • Vid färgning enligt Gram; röda stavar Oxidas test visar blå färg, fermenterar inte laktos, är resistent mot flera antibiotika • Vid färgning enligt Gram; röda stavar Oxidas negativ, fermenterar inte laktos, producerar ureas, dekarboxylerar inte ornitin SIM-röret: H2S-röret svart, Indol rött och rörligt • Vid färgning enligt Gram; blåa kocker Katalas negativ, eskulinplatta visar mörk zon Avgöra med hjälp av ”gränsvärdes lista på antibiotika zon diameter” om en bakterie är R resistent, I intermediärt känslig eller S känslig för ett visst antibiotika. Avgöra med vilken analys/test man kan skilja mellan; Enterokocker och alfa-streptokocker Stafylokocker och Streptokocker Stafylokocker och Bacillus cereus Pneumokocker och alfa-streptokocker Proteus mirabilis och proteus vulgaris Pseudomonas och enterobacteriaceae Stahylokocus epidermidis och Staphylococccus saprofyticus Stahylokocus epidermidis och Staphylococccus aureus E.coli och Klebsiella Stahylococcus epidermidis och Staphylococcus saprofyticus Streptococcus gr A och streptococcus gr C 41 Beskriva hur en Proteus mirabilis/vulgaris ser ut på en blåplatta Beskriva hur en alfa-streptokock ser ut på en streptplatta/blodplatta Beskriva huvudprincipen för step A+ testet Beskriva huvudprincipen för streptex testet Ange fördelar och nackdelar med snabbtester kontra referensmetoder Utföra en DNA preparation, en PCR reaktion samt analysera PCR produkter och framrenat DNA m h a agarosgelelektrofores Beskriva principen för hur man renar fram DNA med QIAGENs DNeasy Mini spin columns Identifiera orsaken till vissa problem som har att göra med DNA fram reningen med QIAGENs DNeasy Mini spin columns tex. då man får ut en för liten mängd DNA eller då det framrenade DNA´t har låg renhet Beskriva de ingående komponenter i PCR reaktionen och hur PCR reaktionen fungerar Nämna några infektions sjukdomar som diagnostiseras med PCR Nämna något tillfälle där kan det vara bättre respektive något tillfälle då det kan vara sämre att använda PCR som en diagnostisk metod Förklara vad det innebär att få ett falskt positivt resultat i ett diagnostiskt test ex. PCR och serologiskt test Förklara vad det innebär att få ett falskt negativt resultat i ett diagnostiskt test ex. PCR och serologiskt test Nämna två sätt att öka specificiteten i en PCR reaktion. Nämna två sätt att öka sensitiviteten i en PCR reaktion. Definiera multiplex PCR och realtids-PCR Gjuta en agarosgel och storleksbestämma kromosomalt DNA och PCR produkter mha ethidiumbromid och UV-ljus Beskriva principen för visualiseringen/detektion av DNA mha ethidiumbromid och UV-ljus på en agarosgel Beskriva koncentration och renhets bestämning av nukleinsyra (DNA och RNA) i en spektrofotometer Uppskatta koncentrationen av nukleinsyra (DNA och RNA) på en agarosgel m h a en molekylvikts markör med känd koncentration Kvantifiera bakterier i en suspension genom turbidimetri, Burker räknekammare och viable count genom praktiskt arbete Beskriva för och nackdelar mellan kvantifieringsmetoderna turbidimetri, Burker räknekammare och viable count Beräkna generationstiden för en bakterie Kunna sätta upp en relevant spädningsserie Pipettera med en automatpipett på ett tillförlitligt sätt Beräkna CV i ett pipetterings försök Presentera (i seminarieform) ett ämne inom genteknik och diskutera etiska aspekter kring genteknik ex. på ämnen fosterdiagnostik, kloning, kriminologi, genterapi, genvaccination, vaccin och/eller läkemedelsproduktion Beskriva ett klonings förfarande från isolering av en gen till att genen börjar uttryckas i en anan organism 42 exempelvis en bakterie Beskriva vad ett restriktionsenzym respektive ligas är, hur dessa fungerar in vivo och hur de utnyttjas in vitro Nämna 3 olika vektorer Beskriva en plasmidvektor mer i detalj Ange 2 exempel på hur en bakterie kan ha nytta av sin plasmid Beskriva på vilket sätt plasmider i bakterier ställa till problem för oss människor 43