REDOVISNING AV ANSLAG Del- och slutredovisning Skickas till: [email protected] Ev. artiklar och publikationer skickas till: Forska Utan Djurförsök, Gamla Huddingevägen 437, 125 42 Älvsjö 1. Anslagstagare Christel Bergström Arbetsplats (fullständig postadress) E-postadress Inst f farmaci, Uppsala Universitet, Box 580, 75123 Uppsala [email protected] 2. Projektnummer Sista redovisningsdatum (se kontraktet) 28/07 2009-08-31 3. Projekttitel (svenska) Datormodeller för prediktion av läkemedelstransport över cellmembran 4. Projektet är avslutat pågår utan med fortsatt stöd från Stiftelsen Forskning utan djurförsök 5a. Kortfattad beskrivning av projektet (syfte och utförande) ca 1 A4-sida 4. Kortfattad beskrivning av projektet (syfte och utförande), ca ½ - max 1 A4-sida Syfte: Projektets primära målsättning är att studera effluxproteiner, vilket är sekretoriska proteiner som pumpar bl a läkemedel ut ur celler. I detta projekt har vi arbetat med tre transportproteiner; breast cancer resistance protein (BCRP), Pgp och Multiresistance protein 2 (MRP2). Dessa uttrycks i flera av kroppens organ, samtliga finns uttryckta i lever, och BCRP och Pgp bl a även i tarm och blodhjärnbarriären. Detta innebär att transportörerna är viktiga för både absorption från tarm (vilken de förhindrar), samt fördelning över till hjärna (förhindras) och utsöndring från lever (drivs). Om ett läkemedel binder till ett av dessa proteiner påverkas därför effekten av det väsentligt. Om flera läkemedel som ges samtidigt interagerar med samma effluxprotein är det också stor risk att biverkningar kommer att uppstå. Det finns idag några svåra biverkningar och registrerade kontraindikationer vid läkemedelsanvändning på grund av läkemedelsinteraktioner på transportörnivå. Syftet med detta projekt är att försöka ta fram datormodeller som förutsäger om ett nytt läkemedel kommer att binda till någon av dessa sekretoriska tranportproteiner och att därigenom även kunna förutsäga om risk för läkemedelsinteraktioner föreligger. Utförande: Experimentella data för interaktion med transportproteinerna har erhållits med hjälp av in vitro metoder. Beroende på transportörens funktion användes antingen cellbaserade system (Saos-2-celler transfekterade med BCRP; MDCK celler transfekterade med P-gp) eller vesikelsystem (BCRP och MRP2). Läkemedelsinteraktionen på proteinnivå med hjälp av ett substrat för proteinet i fråga; en minskad transport av ett substrat indikerar att proteinets funktion har inhiberats av den studerade substansen. För varje transoportör som vi studerat har vi först satt upp en in vitro metod som vi validerat och därefter har stora serier av läkemedel studerats. För BCRP har vi studerat 123 läkemedel, för MRP2 191 läkemedel och i en överlappande studie mellan Pgp, BCRP och MRP2 har vi studerat 122 substanser. Efter att ha sorterat läkemedlen som inhibitorer eller icke-inhibitorer till respektive protein används den erhållna klassificeringen för att utveckla teoretiska modeller baserade på beräknade molekylära egenskaper. I utvecklingen av modeller och analysen av interaktionsmönster har egenskaper beräknade från både 2D- och 3D-representationen av molekylen använts för att erhålla så mycket och god information om läkemedelsinteraktionen som möjligt. Principalkomponentanalys (PCA), “partial least square projection to latent structures” (PLS), PLS-Diskriminant analys (PLS-DA) och “common features pharmacophore modeling” är de tekniker som använts i syfte att erhålla tolkbara och prediktiva datormodeller, samt information om konformations-/interaktionsmönster mellan läkemedlet och transportören. Parallellt med projekten på effluxproteiner som agerar sekretoriskt har vi även forskat på interaktion mellan läkemedel och upptagsproteiner, d v s proteiner som transporterar läkemedel in i cellen. Dessa projekt är pågående, men då vi får data från dessa också kommer vi ha tillgång till en unik uppsättning av in vitro metoder för att studera hur ett läkemedel transporteras in och ut ur cellen. Målet med detta är att modellera samverkan mellan olika proteiner och läkemedelsflöden genom celler och organ ur ett farmakokinetiskt perspektiv. Resultat: 1. BCRP. Vi har etablerat och utvärderat en ny teknik för att bestämma transport och inhibering av transportprotein. Denna metod utnyttjar flödescytometri och fluorescence för kvantifiering av mängd läkemedel som är transporterar. Flödescytometern mäter fluorescence i varje enskild cell som används i in vitro systemet och kan också användas för att detektera hur bra cellerna mår; apparaturen sorterar cellerna i levande och döda. Vi har i BCRP studierna använt oss av Saos-2 celler som har transfekterats med BCRP. Saos-2 celler har sitt ursprung i humant osteosarkom och uttrycker normalt inte någon av de effluxproteiner som vi varit intresserade i så här långt vilket minimerar risken för att andra transportörer påverkat våra resultat. Efter etableringen av metoden har inhibitionspotentialen för 123 olika läkemedel på BCRP bestämts. Av dessa visade sig 46 inhibera BCRP, och av dessa hade 29 inte tidigare publicerats som BCRP inhibitorer. Det visade sig att membranpermeabiliteten av substanser är essentiell för att kunna interagera med BCRP, vilket tyder på att bindningsfickan för BCRP inhibitorer antingen sitter inne i membranet eller in mot cytosolen, något som tidigare inte varit känt. De erhållna inhibitionsdata användes för att försöka få fram en prediktiv datorbaserad modell. I detta arbete användes flera olika modelleringstekniker och vi fick fram en bra datormodell för att särskilja inhibitorer från icke-inhibitorer. I träningssetet som användes i själva modellbyggandet predikterades 93% av inhibitorerna och 92% av icke-inhibitorerna korrekt m h a en modell som baserade sig på endast två molekylegenskaper, nämligen beräknat logP (ClogP) och polariserbarhet. ClogP kan härledas till ett mått på membranpermeation och polariserbarhet till bindningen till proteinet. Utifrån dessa resultat och i samverkan med vad som är vetenskapligt belagt för P-gps mekanism, kunde vi föreslå en ny mekanism för interaktion med BCRP. Enligt denna mekanism måste substansen först ta sig en bit in i mebranet för att senare diffundera i membranet tills det stöter på BCRP, binder därefter BCRP och förhindrar dess transport av ett substrat. Resultaten är publicerade i Matsson et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2007(ref 5 i publikationslistan). 2. MRP2. Vi har etablerat en in vitrometod för interaktionsstudier med MRP2. I denna studie valde vi att använda ett sedan tidigare validerat system där membranvesiklar som innehåller MRP2 proteinet används för att studera transport av ett känt radioaktivt inmärkt substrat. Metoden optimerades för att studera inhibering men trots detta kunde vi även finna en del läkemedel som stimulerade transportproteinet att öka transporten av substratet. I studien undersöktes 191 läkemdel för interaktionen till MRP2 och substanserna sorterades i inhibitorer, icke-inhibitorer (d v s opåverkad transport av substratet) och stimulerare. PLS-DA användes för att ta fram en datormodell för att prediktera vilka substanser som kommer att inhibera MRP2. Datormodellen visade att inhibitorerna var större, mer lipofila och hydrofoba än vad ickeinhibitorerna. var. Modellen kunde förutsäga 86% av substanserna i träningssetet och 72% i testsetet. Utifrån de resultat som erhölls i studien kunde även ett nytt bindningsställe för inhibition av MRP2 transporten föreslås.Vi spekulerar här i att även MRP2, liksom BCRP och Pgp som tillhör samma typ av transportörer, har ett bindningsställe inne i membranet som då det blir uppbundet resulterar i att proteinet inte längre kan transportera substrat. Resultaten från denna studie finns publicerade i Pedersen et al.,Journal of Medicinal Chemistry, 2008 (ref 7 i publikationslistan). 3. Överlapp emllan P-gp, BCRP och MRP2. Mycket arbete har utförts på P-gp och det finns mycket information att hitta i litteraturen. I vår överlappsstudie av de tre transportörerna P-gp, BCRP och MRP2, där vi studerat risk för att ett läkemedel kommer binda till flera transportörer och därigenom få ökad risk för bl a läkemedelsinteraktioner, har vi därför använt oss av litteraturdata för Pgp, och våra egna experimentella data för de övriga två. I denna studie inkluderades totalt 122 substanser och PLS-DA liksom virtuell dockning har använts för att prediktera hur substanserna kan ge multi-spcifik inhibering av effluxtransportörer. I studien hittade vi 23 specifika inhibitorer, d v s substanser som vid en given koncentration endast inhiberade en av de tre transportörerna, och 19 överlappande inhibitorer som vid samma koncentrationen inhiberade minst två av transportörerna. De generella inhibitorerna som slog på flera transportörer var mer lipofila och innehöll mer aromatiska kolväten jämfört med specifika inhibitorer eller icke-inhibitorer. Resultaten kan användas både för att välja vilka inhibitorer som bör användas i in vitro experiment för att utreda transportmekanismer, men även för att förutsäga nya multispecifika respektiva specifika inhibitorer. Resultaten från denna studie finns publicerade i Matsson et al., Pharmaceutical Research, 2009 (ref 10 i publikationslistan). 5b. Ange nyckelord (max 6 st) läkemedelsinteraktion, datormodeller, transportmekanismer, cellmembran, molekylära egenskaper 6. Kortfattad populärvetenskaplig beskrivning av de resultat som uppnåtts (bifoga gärna illustrationer, helst grafiska tekningar), ca ½ max 1 A4-sida För att ett läkemedel ska kunna ge den önskade effekten krävs att läkemedelsmolekylerna når fram till målcellen. Kroppens organ skyddas av olika vävnadsbarriärer, och för att passera dessa måste läkemedlet ta sig in i och igenom kroppens celler. Transporten genom cellernas omgivande membran är därför avgörande för läkemedlets effekt. En molekyl kan passera genom cellmembranet genom två fundamentalt olika mekanismer: passiv diffusion och aktiv transport. Diffusion innebär att molekylerna transporteras i riktning från en hög koncentration till en låg, till exempel från tarmens inre efter att en tablett svalts, och vidare till blodomloppet. Vid aktiv transport pumpas läkemedelsmolekylerna istället genom cellmembranet med hjälp av transportproteiner som sitter insprängda i membranet. I kroppens alla celler hjälper en mängd olika transportproteiner till att ta upp näringsämnen från blodet och att pumpa ut nedbrytningsprodukter och gifter. I detta projekt har arbetet fokuserat på tre medlemmar av en av de största familjerna av transportproteiner, ABC-transportörerna. Dessa har en viktig roll i att påverka hur läkemedel absorberas från tarmen, hur läkemedlen fördelas i kroppen, samt hur de utsöndras efter att de givit den önskade effekten. När en patient tar flera läkemedel samtidigt, kan dessa påverka varandras effekt. Om ett läkemedel hämmar transporten av ett annat, kan det leda till att detta inte når sitt mål och att effekten uteblir. Hämning av transporten kan också göra att giftiga substanser anrikas i kroppens vävnader, vilket kan leda till allvarliga biverkningar. Inom ramen för projektet undersöktes därför ett stort antal olika läkemedel, för att utreda hur de påverkar transportproteinerna breast cancer resistance protein (BCRP) och multidrug-resistance associated protein 2 (MRP2). Ett avsevärt antal läkemedel som används i klinisk praxis visades hämma dessa transportproteiner. Ytterligare undersökningar krävs dock för att visa ifall detta kan leda till allvarliga biverkningar. De experimentella resultaten användes vidare för att utveckla datorbaserade modeller som beskriver hur läkemedlens kemiska struktur påverkar om de hämmar transportproteinet eller inte. Bland annat visades att läkemedel som påverkar flera ABCtransportörer är mer fettlösliga än andra läkemedel. Datorbaserade modeller av detta slag kan användas för att förutsäga ifall nya läkemedel kommer påverka transporten av andra läkemedel. På så vis kan läkemedel som riskerar att ge allvarliga biverkningar sorteras bort i ett tidigt stadium av utvecklingsprocessen. Detta leder till att nya, säkrare läkemedel kan utvecklas effektivare och att andel djurförsök förhoppningsvis kan minska. 7. Sammanfattning av resultatens betydelse för att ersätta/begränsa djurförsök (ge gärna konkreta exempel) I samtliga projekt arbetar vi med tekniker som ersätter djurförsök. Om vi på ett tidigt stadium i utvecklingsprocessen utifrån kemisk struktur eller in vitro screening kan förutsäga ett nytt läkemedels absorption, distribution/disposition, elimination, toxicitet, sidoeffekter och biverkningar skulle mängden djurstudier väsentligt minska. Resultaten från ovannämnda studier innebär att vi har etablerat nya in vitro metoder som är robusta och ger svar på hur ett läkemedel transporteras över cellen. De erhållna data från studierna har vi kunnat utnyttja för att bygga datorbaserade modeller. Det innebär att vi nu har verktyg för att kunna förutsäga risken för läkemedelsinteraktion för nya substanser redan från kemisk struktur. På så vis kommer antalet dåliga substanser som testas i djur förhoppningsvis väsentligt minska. 8. Vilket är den största framgången hittills i projektet? Att vi kunnat etablera vilka typer av molekylära egenskaper hos läkemedlet som ger en påverkan på de mest vanligt förekommande sekretoriska transportproteinerna och att dessa fynd dels kunnat påvisa nya bindningsställen hos transportproteinerna som kommer att inhibera deras funktion , dels kunnat identifiera likheter och skillnader mellan inhibitionsmönster hos dessa transportproteiner. Det senare kommer att vara väsentligt för hur in vitro försök inom tidig läkemedelsutveckling ska designas. 9a. Beskrivning av vad som gjorts för att validera och sprida metoden/metoderna Validering av de experimnetella metoderna har gjorts genom att vid upprepade tillfällen och för nya batcher av celler och vesiklar kunna påvisa att metoderna är robusta. För samtliga system har ett antal kända inhibitorer och substrat studerats för att validera mot tillgänglig litteratur. Validering av datormodellerna har gjorts med hjälp av testset, d v s prediktionsförmågan för datormodellen har prövats genom att prediktera ett dataset som hållits utanför modellbyggandet. Alla resultat från studierna finns publicerade i välrenommerade, granskade tidsskrifter. Presentationer har hållits på nationella och internationella konferenser, samt för regulatoriska myndigheter och läkemedelsindustri. MRP2 metoden har satts upp på bl a AstraZeneca. 9b. Vad mer skulle behöva göras för att metoden/metoderna ska bli spridda och praktiskt användbara? För att få ytterligare genomslagskraft krävs att arbetet med upptagstransportörer slutförs, samt att vi kan koppla ihop resultaten från samtliga studier i en datorbaserad modell som kan prediktera hur dessa transportörer samverkar i samma cell. För det senare krävs en mängd data, och jag ser det som att det ligger ganska långt fram i framtiden att kunna utveckla en "datorbaserad cell" som är robust, med förmåga att förutsäga strukturellt väldigt olika substanser och med en god prediktiv förmåga. 10. Förteckning över publikationer som projektet resulterat i, gärna med länk till sida där publikationen går att läsa (utan krav på prenumeration eller registrering) 1. Matsson P., Bergström C.A.S., Nagahara N., Tavelin S., Norinder U. and Artursson P. Exploring the role of different drug transport routes in permeability screening. J Med Chem, 2005, 48, 604-613. 2. Wassvik C.M., Holmén A.G., Bergström C.A.S., Zamora I. and Artursson P. Contribution of solid-state properties to the aqueous solubility of drugs. Eur J Pharm Sci, 2006, 29, 294-305. 3. Norinder U. and Bergström C.A.S. Prediction of ADMET properties. ChemMedChem, 2006, 1, 920-937 4. Norinder U. and Bergström C.A.S. Prediction of ADMET properties in Chemical Biology From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design. Eds Stuart L. Schreiber, Tarun M. Kapoor and Günther Wess, Volume 3, pp 1003-1042, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007 5. Matsson P., Englund G., Ahlin G., Bergström C.A.S, Norinder U. and Artursson P. A global drug inhibition pattern for the human ATP-binding cassette transporter breast cancer resistance protein (ABCG2). J Pharmacol Exp Ther, 2007, 323, 19-30. 6. Bergström C.A.S., Wassvik C.M., Johansson K and Hubatsch I. Poorly soluble marketed drugs display solvation limited solubility. J Med Chem, 2007, 50, 5858-5862. 7. Pedersen J., Matsson P., Bergström C.A.S., Norinder U., Hoogstraate J. and Artursson P. Prediction and identification of drug interactions with the human ATP-binding cassette transporter multidrug-resistance associated protein 2 (MRP2;ACC2). J Med Chem, 2008, 51, 3275-3287. 8. Wassvik C.M., Holmen A.G., Draheim R., Artursson P. and Bergström C.A.S., Molecular characteristics for solid-state limited solubility. J Med Chem, 2008, 51, 3035-3039. 9. Ahlin G., Karlsson J., Pedersen J.M., Gustavsson L., Larsson R., Matsson P., Nornder U., Bergström C.A.S. and Artursson P. Structural requirements for drug inhibition of the liver specific human organic cation transport protein 1. J Med Chem, 2008, 51, 5932-5942. 10. Matsson P., Pedersen J.M., Norinder U., Bergström C.A.S. and Artursson P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharm res, 2009, epub ahead of print May 7. 11a. Kortfattad vetenskaplig rapport (abstract) på engelska (projekttitel, syfte, utförande, och resultat), ca ½ A4-sida ATP-binding cassette efflux transporters and passive membrane permeability in drug absorption and disposition Transport into and across the cells of the human body is a prerequisite for the pharmacological action of drugs. Passive membrane permeability and active transport mechanisms are major determinants of the intestinal absorption of drugs, as well as of the distribution to target tissues and the subsequent metabolism and excretion from the body. In this project, the role of ATP-binding cassette (ABC) transporters and passive permeability on drug absorption and disposition was investigated. Particular emphasis was placed on defining the molecular properties important for these transport mechanisms. The influence of different transport pathways on predictions of intestinal drug absorption was investigated using experimental models of different complexity. Experimental models that include the paracellular pathway gave improved predictions of intestinal drug absorption, especially for incompletely absorbed drugs. Further, the inhibition of the ABC transporters breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) and multidrug-resistance associated protein 2 (MRP2/ABCC2) was experimentally investigated using structurally diverse datasets that were representative of orally administered drugs. A large number of previously unknown inhibitors were identified among registered drugs, but their clinical relevance for drug-drug interactions and drug-induced toxicity remains to be determined. The majority of the inhibitors affected all three major ABC transporters BCRP, MRP2 and P-glycoprotein (P gp/ABCB1), and these multispecific inhibitors were found to be enriched in highly lipophilic weak bases. To summarize, the present work has led to an increased knowledge of the molecular features of importance for ABC transporter inhibition and passive membrane permeability. Previously unknown ABC transporter inhibitors were identified and predictive computational models were developed for the different drug transport mechanisms. These could be valuable tools to assist in the prioritization of experimental efforts in early drug discovery. 11b. Bifoga eventuellt en vetenskaplig rapport på engelska, max 4 sidor (syfte, utförande, och resultat) Resultaten ovan och bakgrund till projektet finns i avhandlingen "ATP-Binding cassette efflux transporters and passive membrane permeability in drug absorption and disposition" av Dr Pär Matsson (2008). Avhandlingen finns att ladda ner på följande websida: http://uu.diva-portal.org/smash/record.jsf?searchId=1&pid=diva2:171210