Molekylärbiologiblocket
Molekylärbiologins centrala dogma
m
Nukleinsyror (struktur och egenskaper) och replikation: DNA o RNA
Transkription: mRNA
Translation: Protein
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Två olika nukleinsyror:
• DNA deoxyribonukleinsyra
• RNA ribonukleinsyra
Monomererna som bygger upp nukleinsyrorna kallas NUKLEOTIDER.
En nukleotid består av tre delar:
• en fosfatgrupp
• en sockerenhet
• en kvävebas
v
Nukleinsyra
v
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Båda sockermolekylerna
är pentoser
Deoxy betyder från syre
I RNA är sockret ribos och i DNA är sockret deoxyribos:
Deoxyribos
Ribos
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Det finns fem olika kvävebaser som delas in i två grupper efter deras struktur:
Purinbaser
Bicykliska
Pyrimidinbaser
Monocykliska
A
C
I DNA finns: A G C T
I RNA finns: A G C U
G
U
T
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Sockret och kvävebasen kopplas samman via en N-glykosidbindning – en nukleosid bildas:
N
Syftar till
konfigurationen
på bindningen
Kvävebas
H
OH
Socker
C
N
C + H2O
H
H
Nukleosid = Kvävebas + socker
Vatten spjälkas av
vid ihopkopplandet
Nukleinsyrornas uppbyggnad
När en fosfatgrupp kopplas på C5 erhålls en nukleotid.
5
4
3
1
2
Guanin
Nukleotid =
Kvävebas
Socker
Fosfat
Ribos
Energirika bindningar
Adenosin 5’-trifosfat
Nukleotid med tre fosfatgrupper
Guanosin 5’-monofosfat (GMP)
Jämför med dGMP
Deoxyguanosin 3’-monofosfat
http://www.kursnavet.se/kurser/ke1202/
htm/m06/61040.htm
Jämför med ATP
3
Deoxyribos
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Nukleinsyror bildas när nukleotider kopplas samman.
Två nukleotider förbinds via fosfatgruppen i en FOSFODIESTER-BINDNING.
Det är C3 i ett socker som förbinds med C5 i nästa.
Utgångsmaterialet för syntes av nukleinsyra är
TTP, ATP, CTP, GTP – energikrävande process!!
Tymin
3’
Adenin
Nukleotid som har tre fosfatgrupper
5’
3’
Cytosin
5’
Guanin
3’
Fosfodiester
bindning
5’
Nukleinsyrornas uppbyggnad
I nukleinsyrorna kopplas sockermolekylerna ihop med varandra via en fosfatgrupp
Kolatom 3 på eE kol förbinds med kolatom 5 på nästa → 3’,5’-fosfodiesterbindning
Notera att fosfatgruppen bär en negativ laddning – detta gör fosfodiesterbindningen mer
stabil än en vanlig esterbindning – det är svårare för OH- att attackera bindningen då minusladdningarna repellerar varandra – Detta gör att nukleinsyran inte kan brytas ner så lätt!!
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Ordningen på kvävebaserna står för den genetiska informationen!!
Tre kvävebaser i sekvens motsvarar en viss aminosyra i ett protein – kallas för kodon
Nukleinsyrornas uppbyggnad
En DNA- eller RNA-sekvens skrivs ALLTID 5’ 3’ så att inte missförstånd ska uppstå
(precis som proteinsekvensen alltid skrivs N C).
Man börjar med
den nukleotid som
har en fri OH-grupp
i 5’-positionen
Man slutar med den
nukleotid som har
en fri OH-grupp i 3’positionen
OH
Jämför med
OH
H
Nukleinsyrornas uppbyggnad
DNA är dubbelsträngat medan RNA är enkelsträngat.
• En DNA-molekyl består av två
antiparallella nukleotidkedjor.
• Den ena kedjan löper 5’ 3’ och
basparar med en annan kedja som
går 3’ 5’.
5’
3’
• De två kedjorna är komplementära
till varandra.
• Kedjorna associeras spontant
3’
5’
Vätebindninger mellan kvävebaserna håller ihop kedjorna
Nukleinsyrornas uppbyggnad
I DNA-helixen basparar
•
•
cytosin (C) med guanin (G)
adenin (A) med tymin (T)
3 vätebindningar mellan G och C
2 vätebindningar mellan A och T
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Den 3-dimensionella formen av DNA – presenterades 1953 av Watson & Crick
3’
5’
5’
3’
DNA spiral eller DNA helix:
-Två DNA kedjor som är virade runt varandra
- Kedjorna hålls samman med vätebindningar mellan kvävebaserna
Nukleinsyrornas uppbyggnad
20 Å
http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/pa
ge/molecular%20biology/dna-structure.html
•
Fosfatgrupperna och sockerenheterna
sitter på utsidan och kvävebaserna inåt.
•
Eftersom en större pyrimidinbas alltid
basparar med en mindre purinbas är
helixens diameter hela tiden konstant
20Å (1Å = 0.1 nm).
•
Basparen sitter vinlkelrätt mot helixaxeln
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Minor groove
Major groove
Minor groove
http://academic.brooklyn.cuny.edu
/biology/bio4fv/page/molecular%2
0biology/dna-structure.html
Major groove
20 Å
•
Högervriden helix
•
Ett varv i dubbelhelixen är 34 Å (1Å = 0.1 nm) och innehåller 10 baspar.
•
På ett varv finns en ”MAJOR GROOVE” och en ”MINOR GROOVE”. I dessa fördjupningar kan proteiner
fästa.
•
Utsidan av helixen är negativt laddad (fosfatgrupper) vilket stabiliserar DNA-helixen.
•
Positivt laddade joner (katjoner) som Na+ och Mg2+ associeras till DNA:t.
Nukleinsyrornas uppbyggnad
DNA:t i cellkärnan är uppvirat på positivt laddade proteiner, s k histoner, vilket ger
effektiv tätpackning (1 m DNA/cell kan packas till μm-skala)
Elektronmikroskopbild på DNA som visar
”pärlor på en tråd”. Pärlorna är proteinkomplex
som DNA kedjan är uppvirad kring
Schematisk bild som visar tätpackning
av DNA uppvirad runt histoner
Prokaryot DNA är cirkulärt medan eukaryot DNA är linjärt.
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Olika strukturvarianter av DNA:
- A-DNA
- B-DNA
- Z-DNA
Cellulärt DNA: Vanligen B-DNA
A-DNA:
Kortare och bredare högervriden helix där
basparen inte är vinkelräta mot helixaxeln.
Hybridhelixar DNA-RNA som temporärt
bildas har en struktur som påminner om
A-DNA.
Deoxyribosenheten har en annan
konformation än i B-DNA.
Nukleinsyrornas uppbyggnad
Z-DNA:
Vänstervriden helix. Där fosfatgrupperna sitter i sicksack (Z-DNA).
Uppkommer vid sekvenser med varannan purin och varannan pyrimidin som CGCGCG.
Man har funnit proteiner som känner igen just sådana här sekvenser genom deras
speciella struktur.
Denaturering av DNA
Eftersom dubbelhelixen bara hålls samman av nonkovalenta bindningar (vätebindningar)
räcker det att värma ett DNA-prov för att de två kedjorna ska separera.
• När DNA-kedjorna separeras säger man att DNA:t denatureras eller smälter.
• Vilken temperatur som krävs beror på andelen GC-baspar relativt AT-baspar - Högre
temperatur krävs vid flera GC-baspar pga 3 väte-bindningar istället för 2 hos AT.
• Om temperaturen sänks återbildas dubbelhelixen spontant.
Man kan följa denatureringen spektrofotometriskt vid
260 nm. Denaturerat DNA absorberar mer ljus än den
nativa formen eftersom kvävebaserna som svarar för
absorptionen exponeras i denaturerat DNA.
HYPOKROMISM
Tm - den temperatur som krävs för att hälften av
helixarna ska ha förlorat sin struktur (ca 80-90 °C)
Denaturering av DNA
Enkelsträngat DNA har en högre
absorbans vid 260 nm jämfört
med dubbelsträngat DNA
Enkelsträngat RNA
Även enkelsträngat RNA bildar väldefinierade tredimensionella strukturer
som stabiliseras av vätebindningar.
Vätebindningarna binder ihop olika delar av en och samma RNA-kedja.
Ett vanligt motiv är s k hårnålsloopar
RNA-molekyl
Även DNA kan bilda hårnålsloopar
Molekylärbiologins centrala dogma
m
Replikation: Bassekvensen i DNA står för den genetiska informationen. När en cell
ska delas måste DNA:t dupliceras – man måste få nytt DNA med exakt samma
bassekvens som originalet.
Vid proteinsyntes överförs informationen från DNA till aminosyrasekvens i två steg:
Transkription: Bassekvensen i DNA översätts till bassekvens i mRNA. mRNA fungerar
sedan som mall för proteinsyntesen.
Translation: Bassekvens i mRNA översätts till aminosyrasekvens m h a tRNA.
Processen sker på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör den GENETISKA
KODEN och specificerar en viss aminosyra.
Replikationen
Först måste de två DNA-kedjorna separeras och sedan ska två nya kedjor bildas med
originalen som mallar:
Eftersom det i varje ny DNA-molekyl kommer att finnas en ny och en gammal DNA-kedja
säger man att DNA-replikationen är SEMIKONSERVATIV.
(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi (dNTP = deoxy-nukleotid-tri-fosfat)
Det är en energikrävande process dNTP = dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Reaktionen katalyseras av DNA-polymeraser.
Reaktionsmekanism för formation av
en ny fosfodiesterbindning
1. Ny trifosfatnukleotid binder först till mallkedjan genom basparning i.e.
vätebindning mellan två matchande kvävebaser
2. Hydroxylgruppen på C3 i den intilliggande nukleotiden gör en nukleofil attack på
den innersta fosfor-atomen i den nya trifosfatnukleotiden.
3. PPi hydrolyseras och den nya nukleotiden sätts ihop kovalent med resten av DNA
kedjan
4. Energikrävande process. Pyrofosfat (PPi) hydrolyseras varvid energi frigörs
Reaktionsmekanism för formation av
en ny fosfodiesterbindning
Nukleofil
attack av
OH på C3
5
3
3
3’,5’-fosfodiesterbindning
5
5
3
Ny nukleotid
H-bindningar
Fosfaten är kopplad från C3 i kedjan till C5 i nästa socker, alltså 3’,5’-fosfodiesterbindning.
Kedjan växer 5’ → 3’ – förklaring till varför man valt att alltid skriva sekvensen 5’→ 3’
DNA polymeras
DNA-polymeraser kräver en primer för att kunna starta
syntes av en ny kedja.
Primern utgörs av en kort RNA-sekvens och det viktigaste
strukturmotivet är en fri 3’-OH-grupp:
Katalyserar syntes av primer
• I eukaryot DNA startar replikationen
på flera ställen och pågår tills hela
DNA är replikerat – LINJÄRT
• I prokaryot DNA (E.coli) så finns ett
startställe - CIRKULÄRT
RNA-primern tas bort av DNA-polymeras I och ersätts av rätta deoxynukleotider
DNA polymeras
Finns flera olika DNA-polymeraser men de viktigaste är:
DNA-polymeras III:
• Främst ansvarig för polymerisationen av den nya kedjan.
DNA-polymeras I:
• Kontrollerar att rätt nukleotid satts in.
• DNA-polymeras I har EXONUKLEAS-aktivitet vilket innebär att om ett fel upptäcks kan
polymeraset klippa bort det och sätta in rätt nukleotid istället.
Mycket viktigt eftersom fel vid replikationen kan få stora konsekvenser!
Replikationen
Problem:
DNA-polymeras katalyserar bildande av ny DNA-kedja 5’ 3’ och rör sig längs den gamla
kedjan 3’ 5’. Men en av kedjorna i helixen exponeras ju 5’ 3’….
Lösning:
Den ena kedjan syntetiseras diskontinuerligt i s k Okazakifragment.
FEL HÅLL!!
5’
3’
5’
RÄTT HÅLL!!
5’
3’
Lagging
3’
5’
3’
Leading
5’
5’
3’
För varje Okazakifragment krävs en primer
och för att sedan koppla ihop fragmenten
krävs ytterligare ett enzym, DNA-ligas.
Lagging strand formar en loop vid DNA
syntesen så att polymeriseringen av den
komplementära DNA-strängen får samma
riktning som den nya DNA strängen som är
komplementär till leading strand
Replikationen
Proteiner som är viktiga vid replikationen:
Topoisomeras och helikas: Öppnar upp dubbelhelixen.
”Single strand binding proteins”: Binder till enkelsträngat DNA som temporärt bildas och
skyddar det från nukleaser som annars attackerar enkelsträngat DNA och bryter ner det.
Primas: Katalyserar bildandet av RNA-primers som behövs för att DNA-polymeraset ska
kunna syntetisera ny kedja.
Ligas: Kopplar ihop fragment kovalent.
Uppgift Komplementärt DNA
Den ena kedjan är i DNA är:
5’ – CGGATATGTACCTTTACGTA – 3’
Ange den komplementära sekvensen från 5’ → 3’
Mutationer i DNA
PUNKTMUTATIONER
Tre typer:
SUBSTITUTION:
DELETION:
INSERTION:
en kvävebas byts ut mot en annan
en bas tas bort
en bas sätts till
De två sista är allvarligast eftersom de förskjuter hela läsramen.
Substitution är vanligast och finns i två varianter:
*TRANSITION
purin purin
pyrimidin pyrimidin
Felfrekvens: 1/1010 nukleotider
*TRANSVERSION
purin pyrimidin
pyrimidin purin
Mutagener
Kemiska mutagener:
• Ämnen som liknar de normala baserna och därför kan
inkorporeras i deras ställe. Ex. 5-bromouracil.
•
Ämnen som modifierar befintliga baser vilket leder till
mutationer vid nästa replikation. Ex. HNO2 (reduktionsmedel)
•
Ämnen som interkalerar, binder in mellan baserna, i DNAstrukturen och kan uppfattas som en bas vid nästa replikation.
Ex. etidiumbromid.
http://en.wikipedia.org/wiki/File:5Bromouracil_structure.png
UV-ljus:
UV-ljus kan leda till ihopkoppling av närliggande tyminer.
Skydd:
Reparationsmaskineri i tre steg:
• Felet upptäcks och felaktig bas tas bort – olika enzymer för olika fel.
• Ny korrekt bas sätts in av DNA-polymeras I.
• Kedjan kopplas ihop av DNA-ligas.
Mutationer - konsekvenser
Flera cancersjukdomar orsakas av defekt DNA-reparationsmaskineri:
Exempel:
I sjukdomen Xeroderma pigmentosum saknas enzymet som tar bort tymindimererna som bildas vid exponering för UV-ljus.
Patienterna får hudcancer och dör ofta innan de fyllt 30 år.
Tyst mutation:
En mutation som ger skillnad på DNA-nivå men inte på proteinuttrycket pga att
den genetiska koden är degenererad – Detta återkommer vi till vid nästa lektion!
