Dentala kompositmaterials inverkan
på närliggande celler.
Cytotoxiciteten och ytstrukturens påverkan på cellernas
adhesion till två kompositmaterial.
Emilia Nikolovska och Maria Rivera
Tandteknikerutbildningen K6 2011
Handledare:
Luis Chavez de Paz, Docent
Lars Olsson, Universitetsadjunkt
Odontologiska fakulteten
)
1 SAMMANFATTNING
Inledning
Implantatbehandlingar har blivit allt vanligare och material som associeras med implantat är
oftast dentalt titan och dentala keramer. Även kompositmaterial förknippas ibland med
implantat. Det är inte helt ovanligt att kompositmaterial förekommer vid submukösa
implantatbehandlingar och få studier är hittills gjorda på kompositmaterials cytotoxiska
påverkan på omkringliggande vävnad.
Material och metod
Sammanlagt tillverkades 24 stycken provkroppar till studien av två kompositmaterial
(Crea.lign och SinfonyTM) och ett fältspatsporslin (Noritake). Tre provkroppar av varje
material ytanalyserades med hjälp av optisk interferometri. En provkropp av varje material
användes till pilotstudien och resterande provkroppar utsattes för två olika
cellodlingsmetoder: Live/dead-metod och FISH-fluorescence in situ hybridization. Orala
bakterier som användes i studien var Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum och
Actinomyses naeslundii, vilka odlades i en respektive sju dagar. Samtliga provkroppar
autoklaverades före cellodlingen. Cellerna analyserades i mikroskop och värdena som
framkom omvandlades till diagram och 3D-bilder. Resultaten jämfördes genom en statistisk
analys med hjälp av two-way ANOVA, där signifikansnivån sattes till p=0,05.
Resultat
Samtliga celler var vid liv på samtliga provkroppsytor efter en respektive sju dagars
cellodling, och en signifikant skillnad förelåg i % yttäckning av celler på provkropparna.
Fältspatsporslin uppvisade en signifikant lägre yttäckning av celler med FISH-metoden, i
jämförelse med kompositmaterialen. Med avseende på biofilmen, kunde det konstateras att
detachment (lossning av celler från ytan) förelåg på samtliga provkroppar efter sju dagars
cellodling.
Syfte
Syftet med föreliggande studie var att undersöka (a) tre olika bakteriearters adhesion och
koloniseringsförmåga (b) på fältspatsporslin och två olika kompositmaterial, materialens
toxiska påverkan på de olika bakterierna samt (c) om materialens ytstruktur påverkar
bakteriernas adhesion.
2 INNEHÅLLFÖRTECKNING
Inledning.......................................................................................................... 4
Syfte................................................................................................ 6
Material och metod......................................................................................... 7
Framställning av provkroppar.......................................................... 7
Analys av provkroppsytor................................................................ 9
Cellodling........................................................................................ 10
Live/dead-metod.............................................................................. 10
Fish-metod..................................................................................... 11
Konfokalmikroskop och cellkalkylering.......................................... 11
Statistisk analys............................................................................... 11
Resultat............................................................................................................ 12
Interferometri.................................................................................. 12
Statistisk analys............................................................................... 14
Biofilmstillväxt................................................................................ 15
Livsduglighet................................................................................... 16
Cellfördelning.................................................................................. 16
Diskussion........................................................................................................ 19
Slutsats............................................................................................................. 21
Materiallista.................................................................................................... 22
Material........................................................................................... 22
Materiel........................................................................................... 22
Ordförklaringar.............................................................................................. 23
Tack till ........................................................................................................... 24
Referenser........................................................................................................ 25
3 INLEDNING
Efter att osseointegration introducerades för över 30 år sedan, har implantatbehandlingar
blivit en viktig del av tandvården. Över det osseointegrerade implantatet används ibland olika
distansmaterial som måste uppfylla vissa kriterier som estetik, hållfasthet samt
biokompatibilitet16. Vanliga material som används till distansmaterial är bland annat titan,
aluminiumoxid och zirkoniumdioxid6.
Helkeramiska ersättningar har blivit alltmer populära vid implantatbehandlingar6 tack vare
sina goda egenskaper som biokompatibilitet, kemisk stabilitet och en termisk
expansionskoefficient jämförbar med den naturliga tanden10,35.
Andra material som används vid implantatbehandlingar är polymerer. Vid polymerer i
samband med implantatbehandlingar, finns det en risk att när materialet sätts in i vävnaden,
uppstår det degradation av benvävnaden. Eftersom implantat är ämnade att sitta kvar i
kroppen under en längre tidsperiod, är det viktigt att sådana komponenter inte framkallar
någon ogynnsam reaktion på vävnaden1. Restmonomerer, eller opolymeriserade monomerer,
som friges i små mängder har visat sig ha en cytotoxisk (se sidan 23) effekt på närliggande
celler21,11. Restmonomerer finns även i dentala kompositmaterial, vilket har resulterat i
cytotoxicitet gentemot vävnaden även vid låga mängder restmonomerer8,12, 21,22,28. Studier
visar att när man avlägsnar restmonomerer i en komposit minskar effekten av celldöd med ca
90%11.
Dentala kompositmaterial utvecklades 1962 genom att man kombinerade dimetakrylat och
kvartspulver36. Kvartspulver är oorganiska, hårda partiklar bundna i resinmatris.
Opolymeriserat resin består till största delen av en monomerblandning30.Under de senaste
årtiondena har komposit utvecklats på flera olika sätt. Den viktigaste förändringen som har
gjorts, var en förändring i fillersystemet, vilket har resulterat i minskad polymerisationskrympning14, förutsatt att fillerpartiklarna är väl bundna till matrisen2. Studier visar även att
en ökning av fillerpartiklar leder till ett mindre vätskeupptag25.
Kompositmaterial levereras oftast till dentala laboratorier som pastaform och ett iniatorsystem
behövs för att omvandla det opolymeriserade mjuka resinet till en fast och hållfast
konstruktion. Resinet består i huvudsak av en monomerblandning och de vanligaste
monomerblandningarna som används är bl.a. TEGDMA (trietylenglykolmetakrylat) och
UDMA (uretandimetakrylat) vilka skapar en sammanlänkad polymerstruktur2,29. Vid
polymerisering av kompositmaterial finns tre olika sätt att aktivera polymerisationsprocessen:
värme, ljus eller kemisk aktivering.
Implantatunderstödda suprakonstruktioner har blivit allt vanligare som alternativ för
konventionell avtagbar protetik, med en hög klinisk överlevnads- och lyckandefrekvens15,27.
Även om en hög lyckandefrekvens har visats, är det dokumenterat att komplikationer som till
4 exempel infektionssjukdomar kan uppstå som i sin tur påverkar
omkringliggande mucosa och benvävnad. Tandfickor fungerar
som en reservoar där mikroorganismerna lätt kan kolonisera
det nyinsatta implantatet och utgör en viktig faktor för
utvecklingen av infektioner runt implantatet27. Infektionerna
orsakade av bakterier anses vara en av de vanligaste
komplikationerna knutet till implantatbehandlingar29. Sådana
infektioner kan leda till att.implantatet går förlorat.
Bild 1: Biofilm som uppstod
i en av cellodlingsplattorna.
En bakteriart som ofta associeras med periimplantit är
Fusobacterium nucleatum, vilken är en tidig kolonisatör omkring implantat32, och har en
förmåga att aggregera med andra bakterier17. Samverkan sker oftast mellan olika arter där
Streptokocker, Actinomyses naeslundii och F. nucleatum utgör det största antalet
samarbetspartners i detta sammanhang33. F. nucleatum, spelar en viktig roll i samarbetet, då
de bidrar till en anaerob, skyddande miljö18 och sammanbinder tidigare kolonisatörer på
tandytan inför plackbildning genom aggregation och adhesion7. Streptokocker utgör ungefär
hälften av de odlingsbara mikroorganismerna som finns i munhålan och omkring en fjärdedel
av de odlingsbara mikroorganismerna som finns i tandplack. Nämnda bakterier är orörliga och
växer karaktäristiskt i långa kedjor och bildar små vita kolonier på blodagarplattor19.
Samtliga bakterier är tidiga kolonisatörer av tandytan och samarbetet mellan dem gör att de
kan bilda en biofilm på en ren tandyta18. En biofilm är en komprimering av mikroorganismer
som fäster till en yta30 (bild 1), där bakterier samverkar för att skapa detta skikt på fasta ytor.
Bakterierna kan definieras som fastsittande cellgrupper, oregelbundet fästa till en yta eller till
varandra13.
Ett vanligt exempel på biofilmsbildning i munhålan är dentalt plack. I ostörd plack är det väl
synligt att bakterierna attraheras till andra bakterier5,18,23. För att upprätthålla denna biofilm är
det nödvändigt att de grundläggande byggstenarna, bakterierna, är fast förankrade till
varandra13. Bakteriers förmåga att fästa till andra organismer avgör den tid det tar att utveckla
supragingival och subgingival plackbiofilm27. Näring är också en viktig faktor att ta hänsyn
till under cellodlingen, då innehållet i omkringliggande medium kan orsaka detachment av
celler20.
För att analysera cellviabiliteten samt biofilmstillväxten kan man genom en metod, Live/dead,
färga in celler med en grön respektive röd fluorescerande färg. Friska celler syns i mikroskop
som fluorescerande gröna och döda celler syns som fluorescerande röda3.
Med hjälp av en annan metod, FISH - fluorescence in situ hybridization, kan man se
cellfördelningen av de olika bakteriearterna, men även var de ligger på till exempel
provkroppsytor. Detta sker genom infärgning med olika fluorescenta färger, varefter
analysering i ett konfokalmikroskop sker. Analysering med hjälp av konfokalmikroskopi
innebär att flera olika optiska bilder kombineras och med hjälp av en mjukvara skapas en
tredimensionell bild av till exempel celler24.
Många mikroorganismer i den orala miljön behöver fästa till fasta ytor för att kunna överleva.
Därför är det viktigt att ta hänsyn till materials ytstruktur i detta sammanhang7. Ytstrukturen
5 har visat sig påverka cellernas adhesion till materialet4. Eftersom cellförnyelsen är beroende
av förankring26, måste provkropparna bidra med en lämplig yta för cellnybildning34 men
framförallt måste de vara biokompatibla och därmed icke-toxiska1.
Ytstrukturen hos ett material kan mätas genom en optisk teknik, interferometri. En optisk
interferometer fungerar genom att två ljusvågor i samma frekvens reflekteras från en yta. När
dessa två ljusvågor möts, sker en interferens. Antalet interferenslinjer räknas sedan för att
skapa en datoriserad tredimensionell bild av ytan31
Syfte
Syftet med föreliggande studie var att undersöka (a) tre olika bakteriearters adhesion och
koloniseringsförmåga (b) på fältspatsporslin och två olika kompositmaterial, materialens
toxiska påverkan på de olika bakterierna samt (c) om materialens ytstruktur påverkar
bakteriernas adhesion.
6 MATERIAL OCH METOD
Framställning av provkroppar
Till studien användes två olika kompositmaterial; Crea.lign† och
SinfonyTM*. Inför tillverkningen av provkropparna användes två
glasplattor; en tunn och en lite tjockare. På den tunnare
glasplattan användes cyanoakrylatlimµ för att limma fast
enkronor i varje hörn (bild. 2).
Bild 2: Glasplatta med
enkronor
Den tjockare glasplattan isolerades±. En skopa Putty € blandades enligt fabrikantens
anvisningar och placerades mitt på glasplattan med enkronorna. Med hjälp av den tjockare
glasplattan, pressades puttymassan till ett jämntjockt lager. Glaset trycktes tills uppnådd
kontakt med enkronorna (bild. 3a). Därefter avlägsnades det översta glaset.
Med hjälp av en porslinsmått (1 cm i diameter), gjordes åtta mallar för provkroppsformar,
jämnt fördelade över ytan. Porslinsuppläggaren trycktes igenom puttyn, tills kontakt med
underliggande glas (bild 3b och 3c). Puttyn fick stelna, och överskott avlägsnades samt
enkronorna togs bort från glaset (bild. 3d).
(a)
(b)
(c)
(d)
Bild. 3. (a) Puttymassan mellan glasplattor (b) porslinsuppläggare (c) markerade hål i puttyn
(d) färdig form.
7 Därefter trycktes komposit ut i puttyformarna (bild. 4) och
ljushärdadesα enligt fabrikantens anvisningarπ. Provkropparna
rengjordes från restmonomer¥, och vassa kanter slipades bortβ,
ζ
, och provkropparna polerades enligt fabrikantens anvisningar.
Bild. 4: Komposit före polymerisering.
För fältspatsporslin, användes putty på samma sätt som ovan för att skapa nya
provkroppsformar. Puttyn avlägnades från glaset efter stelning och ett tunt servettlager
penslades fast på glaset med destillerat vatten (bild. 5a). Puttyformarna isolerades¢ och
placerades på glasbrickan, ovanpå servettlagret (bild. 5b).
(a)
(b)
Bild. 5: (a) Ett servettlager placerat på
glasplattan och (b) puttyförgjutningen
placerad ovanpå.
Porslin÷ med tillhörande vätska§ blandades och applicerades i formarna, upp till kanten.
Porslinsprovkropparna kondenserades med en servett och avlägnades genom lätt vibrering
mot puttyn. Därefter placerades de på en glasfiberduk¬ och sintrades२. Porslinsuppläggningen
upprepades tre gånger på vardera porslinspuck och sintrades mellan varje porslinspåläggning.
Slutligen slipades porslinspuckarna plant med diamantfräs¤ i highspeed med vattenkylning६
och glansbrändes därefter i ett selfglaze program enligt fabrikantensanvisningar.
Till undersökningen tillverkades sammanlagt 24stycken provkroppar (Fig. 1). Av varje
material användes 3st provkroppar till ytanalysering med hjälp av interferometri, en
provkropp av varje material användes till pilotstudien och 2 provkroppar av varje material
användes till FISH respektive Live/dead. Med dessa metoder analyserades därefter 1
provkropp av varje material efter 1 dags respektive 7 dagars cellodling.
8 ________________________________________________________________________________
Fig. 1: Totala antalet provkroppar var 24st, 8st av varje material (Crea.lign, Sinfony och
Noritake).
Analys av provkroppsytor
Ytstrukturen analyserades i en optisk interferometer९. Vid mätningarna användes tre
provkroppar från varje grupp och tre mätpunkter togs på varje provkropp. Sammanlagt
avlästes nio mätpunkter inom varje materialgrupp en tredimensionell bild av ytorna togs fram.
Strålkällan utsände ett vitt ljus och reflekterades mot provkroppsytan så att en mätbar
förskjutning kunde registreras utifrån hur yttopografin ser ut. Med den informationen som
registrerades kunde sedan en datorgenererad bild av ytan produceras i både 2D och 3D.
Datainformationen bearbetades med hjälp av mjukvaran MapVue. De vanligaste parametrarna
som används för att beskriva en yta är Sa, Sdr och Sds* där Sa står för medelhöjdsavvikelse
från en yta, det vill säga höjdskillnaden, Sds är antalet toppar och dalar per ytenhet och Sdr
innebär ytarean eller ytförstoringen.
38
* Sa (Average roughness), Sds (Summit density), Sdr (Developed Interfacial Area ratio) .
9 Cellodling
Inför det slutliga försöket, användes tre olika orala
bakteriearter; S. oralis, A. naeslundii och F. nucleatum.
De två förstnämnda bakteriearterna mognade på tre olika
blodagarplattor (bild 6) med femprocentigt fårblod i en
5 % -ig CO2-berikad miljö. F. nucleatum förodlades
också på en blodagarplatta, men utsattes för en anaerob
miljö i en Modular Atmosphere Controlled System.
Bild. 6: Blodagarplattor.
Bakterierna förodlades i 24 timmar i Todd-Hewitt
medium. Bakterier odlades i 1 dag resp 7 dagar där hälften av provkropparna behandlades
med Live/dead-metoden, resterande provkroppar behandlades med FISH. Samtliga
provkroppar autoklaverades☺ i 30 min innan utsättning för experiment.
Live/dead-metod
I studien användes Live/dead BacLight Bacterial Viability kit for
microscopy som förbereddes genom att blanda ihop två lika stora
delar av BacLight fluorescenta färger (A+B). En provkropp av
varje material med cellkultur på, limmades fast på enskilda
glasskivor (bild 7) med cyanoakrylatlimµ och 500µl Live/dead
blandning påfördes på varje glasplatta och inkuberades i 15 min i
mörker i rumstemperatur (25°C). Provkropparna rengjordes
därefter med etanol och immersionolja påfördes på
mikroskopobjektivet varefter provkropparna analyserades i
mikroskop. Proportionerna av friska celler (fluorescerande
gröna) och skadade celler (fluorescerande röda) uppskattades
från 10 stycken slumpmässigt valda områden på varje
provkropps biofilm. Bilder på biofilmsmassan togs genom
användning av Konfokalmikroskop med en konfokaldiameter
på 30µm (Fig. 2).
Fig. 2: 10 stycken slumpmässigt
valda områden av varje yta togs
med en yttäckning av 0.05 mm².
10 Bild 7: Provkroppar fastklistrade
på glasskivor.
FISH-metod
Provkropparna med cellkultur låg i cellodlingsplattor i ett medium. Bakteriekulturvätskan
avlägsnades och 100µl 4 % -ig Paraformaldehyd tillsattes varefter provkropparna inkuberades
i 4°C i ett dygn. Paraformaldehydvätskan avlägsnades därefter med en pipett och
provkropparna sköjdes i 99,9%-ig etanol varefter de lämnades kvar på en servett i 5 min för
torkning. Enzym lysozym hälldes på provkroppsytorna efter att de åter placerats på sina
repektive plattor där det låg kvar i 30min i 37°C. Provkropparna sköljdes därefter med 120µl
destillerat vatten. 99,9%-ig etanol tillsattes ännu en gång, tills provkroppsytorna täcktes.
Detta lämnades kvar i 5 min och etanolen hälldes därefter av. Provkropparna lufttorkades på
en servett. En primer (som behövs vid uppbyggnaden av nytt DNA) blandades ut; 1µl för
varje 30µl hybridization buffer proteinlösning): 50µl Fusall 307(F. nucleatum), 7µl JF201 (A.
naeslundii) och 7µl STR 405 (S. oralis). 50µl av lösningen hälldes på respektive
cellodlingsplatta tills provkroppsytorna täcktes och inkuberades därefter i 48°C i 30min.
Mediumet sögs ut med hjälp av en pipett och 100µl av Washing solution FISH hälldes över
provkropparna för att få bort lösa celler som inte fäst på provkroppsytorna. Därefter
inkuberades de i en humid chamber i 48°C i 30min. Mediumet sögs åter igen ut och
provkropparna sköljdes med 100µl destillerat vatten.
Konfokalmikroskop och cellkalkylering
Allt mikroskopiskt arbete utfördes genom användning
av Eclipse TE2000 Inverted Confocal Scanning Laser
Microscope (Nikon) (bild 8). Bilderna som togs från
varje provkroppsbiofilm analyserades med mjukvaran
BioImage_L. Med hjälp av mjukvaran, räknades antalet
levande och döda celler och cellfördelningen av de
olika bakteriearterna. Numerisk data bearbetades i
Excel, varefter diagram skapades
med SigmaPlot v.12.0.
Bild 8: Confocal mikroskop;
avläser en provkropp.
Statistisk analys
Experimentet genomfördes endast en gång per testmetod (Live/dead och FISH) efter en dags
respektive sju dagars cellodling. För att påvisa eventuella signifikanta skillnader mellan
mängden friska bakterier, variationer hos de olika biofilmerna samt för att se vilket material
som bakterierna mest respektive minst adherar till, gjordes en statistisk analys genom twoway ANOVA (p=0,05). Även standardavvikelser kalkylerades. Numerisk data bearbetades
med hjälp av programmet Prism v.5.0.
11 RESULTAT
Interferometri
Resultaten från interferometern uppvisade att de båda kompositmaterialen, CreaLign och
SinfonyTM, hade en slät yta med långa mikrospår som ett resultat av poleringen medan
porslinsprovkropparna, Noritake, uppvisade en slät yta med upphöjningar av kristallkorn (bild
9).
(b)
(a)
(c)
Bild 9: Resultatet från mätningarna på
provkroppsytorna i interferometern visar
medelvärdesytor på (a) SinfonyTM, (b)
Noritake och (c) CreaLign.
12 Tabell. 1: Värdena från interferometern visade att porslinsytorna hade högst
ytråhetsvärden.Värden från nio mätpunkter på tre provkroppar, medelvärdes beräkning samt
standardavvikelse redovisas nedan. Sa visar provkroppsytornas höjdskillnad i µm, Sds anger
medelvärdet av antalet toppar och dalar på ytan i mm och Sdr visar ett medelvärde av ytarean
i %. Siffrorna inom parantes visar standardavvikelser.
Material
Komposit
SinfonyTM
Sa (µm)
Sds (/mm)
Sdr (%)
0,045(0,014)
188644,104 (11877,052)
1,140 (0,417)
CreaLign
0,070 (0,047)
213154,369 (24138,879)
3,057 (2,817)
Fältspatsporslin
Noritake
0,212(0,039)
102628,960 (10067,040)
8,604 (2,490)
13 Statistisk analys
Resultaten visade signifikanta skillnader i båda metoderna, Live/dead och FISH, efter en dags
respektive sju dagars cellodling. Numerisk data är baserad på ett medelvärde av antalet friska
celler i % (Live/dead) och % yttäckning av celler (FISH) där det inkluderar det totala
resultatet av tio slumpmässigt valda punkter (Fig. 2).
(a)
(b)
_________________________
Fig. 2: Boxplot visar 25%-75% samt median och spridning. De svarta respektive vita boxarna
(a) representerar mängden friska/levande celler i % efter en dags respektive sju dagars
cellodling på från vänster CreaLign, SinfonyTM och Noritake. De gråa respektive vita
boxarna (b) visar yttäckning av celler i % på provkroppsytorna efter en respektive sju dagars
odling på CreaLign, SinfonyTM och Noritake. Spridningen syns som morrhår över och under
boxarna. På figur 2 (a) påvisas en signifikant skillnad i mängden friska celler på Sinfony efter
en dags cellodling, där 100 % av cellerna är friska och har ett p-värde på 0,0001. Efter sju
dagars cellodling (a), påvisas en signifikant skillnad på levande celler på Noritake, p=0,0475.
Även i figur (b) påvisas en signifikant skillnad på Noritake efter en och sju dagars cellodling
jämfört med SinfonyTM och Crea.lign.
14 Biofilmstillväxt
Biofilmstillväxten analyserades genom mikroskopi och cellkalkylering. I resultatet nedan kan
det utläsas att det är detachment av celler på alla ytor med avseende på biovolym efter sju
dagars cellodling (Fig.3).
(a)
(c)
(b)
8
7
7
7
6
6
6
2
2
2
1
1
1
0
0
0
5
B i o v o ly m m m ³ x 1 0
B i o v o lu m e m m ³ x 1 0
6 B i o v o ly m m m ³ x 1 0
6 8
6 8
5
4
5
4
3
4
3
1
7
3
1
7
Antal dagar
1
7
Fig. 3: Diagrammen visar biovolymen i mm3 x 106 efter en respektive sju dagars cellodling.
CreaLign (a) SinfonyTM (b) och Noritake (c) uppvisar synliga detachment efter sju dagar
(inringat i rött).
_______________________________________________________________________
15 Livsduglighet
Livsdugligheten analyserades med hjälp av Live/dead-metoden. Genom infärgning av celler
med fluorescenta färger framgår ett resultat av mängden friska celler respektive döda celler.
Diagrammen nedan (fig. 4) visar hur många % av den totala cellmängden som är friska.
Resultaten visar en liten förändring efter en respektive sju dagars cellodling.
(b)
(c) 100
100
80
80
80
60
% v i a b i li ty
100
% vi a b i li ty
% V i a b i lity
(a)
60
60
40
40
20
20
20
0
0
0
1
7
40
1
7
Antal dagar 1
7 Fig. 4: Cellernas viabilitet/livsduglighet efter en respektive sju dagars cellodling där (a) är
CreaLign, (b) SinfonyTM och (c) är Noritake. De grå staplarna representerar, friska celler av
den totala mängden celler i procent och svarta morrhåren representerar standardavvikelsen.
Kalkyleringar gjordes på tio provkroppsbilder med en total area av 0,5mm². På CreaLign
ökade cellernas livsduglighet med 8 %, medan det på SinfonyTM minskade med 10 % efter sju
dagars cellodling. Noritake uppvisade nästan samma resultat efter sju dagars cellodling som
vid dag ett. Cellfördelning
Med hjälp av Fish-metoden, färgades de tre
bakteriearterna in med olika fluorescenta färger. (Bild
10) är en konfokalmikroskopisk bild som visar
cellfördelningen av de olika bakteriearterna på en av
provkroppsytorna. Cellfördelningen på alla
provkroppsytorna beskrivs på (Fig. 5), som
stapeldiagram med tillhörande konfokalbild undertill.
Bild 10: S. oralis (fluorescerande grön),
F. nucleatum (fluorescerande röd) och
A. naeslundii (fluorescerande blå)
16 _________________________________________________________________________________
(a) dag 1
dag 7
25000
20000
20000
Crea.Lign
2
Biomassa um
Biomassa um
2
25000
15000
10000
5000
0
0
dag 7 25000
20000
20000
SinfonyTM
Biomassa um
Biomassa um
2
2
25000
15000
10000
15000
10000
5000
5000
0
0
17 10000
5000
(b) dag 1
15000
dag 7 (c) dag 1
25000
20000
20000
Noritake
2
Biomassa um
Biomassa um
2
25000
15000
10000
15000
10000
5000
5000
0
0
Fig. 5: Diagrammen ovan visar den totala cellfördelningen på (a) CreaLign. (b) SinfonyTM (c)
Noritake efter en respektive sju dagars cellodling där blå färg = A. naeslundii, grön färg = S.
oralis och röd färg = F. nucleatum. Till varje stapeldiagram finns tillhörande tredimensionell
bild som visar hur det såg ut i konfokalmikroskopet.
18 DISKUSSION
Valet av kompositmaterial beror på att dessa används allt mer på dentala laboratorier,
submuköst vid implantatbehandlingar. Problem som uppstod vid provkroppsframställningen
var att porslinsprovkropparna inte kunde göras lika parallella som kompositprovkropparna.
Detta på grund av den ojämna krympningen under sintringen.
Man vet sedan tidigare att restmonomer kan orsaka cytotoxiska responser i munhålan, och
enligt Ferracane et al11 kan man genom avlägsning av restmonomerer minska cytotoxiciteten
med ca 90 %. Provkropparna framställdes med målet att avlägsna restmonomerer. De
tillverkades i en storlek anpassad för; ca 10mm2 med en tjocklek på ca 1-1,5mm. Porslin
användes som en kontrollgrupp på grund av materialets kända biokompatibilitet, men även för
att detta material används alltmer som ytmaterial vid submukösa implantatbehandlingar.
Även om kompositmaterialens provkroppar behandlades på samma sätt, uppvisade
provkropparna stora skillnader i ytstruktur vid analysering med interferometer. Tunna och
olika långa spår uppkom av poleringen. Före ytbehandling visade provkropparna en slät yta
för ögat, men eftersom dessa material inte lämnas obehandlade på laboratorier, var det av
intresse att ytbehandla dem enligt fabrikantens anvisningar. Porslinsprovkropparna uppvisade
en helt annan ytstruktur på mikroskopisk nivå; en väldigt slät yta med upphöjningar av
kristallkorn. Trots att porslinet har en generellt slätare yta än kompositmaterialen, visade
resultatet högre ytråhetsvärden i parametrarna Sa och Sdr, medan paramertern Sds visade
lägst värden för porslinet. Detta kan bero på att kornen är så pass upphöjda, att resultatet blir
missvisande. Skillnaden i ytstruktur har förmodlingen påverkat resultatet av cellernas
vidhäftningsförmåga på de olika provkropparna. Maria Bachle et al4 skriver att ytstrukturen
hos materialet har en stor påverkan på interaktionen mellan celler och material. Orsaken till
skillnaden i resultat mellan porslinet och de båda kompositerna kan bero på denna skillnad i
ytstruktur. Antagligen kunde inte cellerna fästa eller hålla sig kvar på de släta ytorna. Detta
kan ha resulterat i det detachment som alla provkroppsytorna uppvisade efter sju dagars
cellodling.
Detachment kan även ha en koppling till att cellerna exponerades för samma medium under
samtliga 7 dagar, vilket troligtvis inneburit att näringen i mediumet tagit slut. I en liknande
studie har Justin et al30 också kultiverat celler, men har bytt cellkulturernas medium efter
varje dygn då detta skulle vara nödvändigt för biofilmsbildningen. Chavez de Paz et al9,
däremot, menar att även om näringsvärdet i mediumet är lågt, så finns det ingen signifikant
skillnad på överlevnadsfrekvensen i jämförelse med celler i ett mer näringsrikt medium.
I pilotstudien odlades endast en bakterieart, S. oralis, eftersom de är tidiga kolonisatörer i
munhålan. Bakterierna odlades i ett dygn i en 37°C fuktig miljö som motsvarar en intraoral
miljö, vilket gör det gynnsamt för celler att bilda kolonier.24 Celltillväxten kontrollerades
varje timme, men bakteriekulturen uppvisade väldigt låga tillväxtvärden och därför valdes en
19 annan odlingmetod i den slutliga studien.
För att analysera cellviabiliteten på de olika provkropparna, användes Live/dead-metoden som
genom fluorescenta färger (röd och grön) visar friska respektive döda celler. Resultaten visade
att nästan alla cellerna var friska efter en respektive sju dagars cellodling. Förmodligen beror
cellviabiliteten på att restmonomerer avlägsnades från kompositmaterialen för att minska
toxiciteten och att därmed efterlikna porslinets egenskaper som är ett biokompatibelt material.
Det hade varit av intresse att följa upp cellodlingen under en längre tid för att se om resultatet
hade varit annorlunda. Detta hade blivit mer relevant eftersom man i verkligheten planerar att
ha ett implantat i munnen under en längre tid.
F. nucleatum, A. naeslundii och S. oralis är tidiga kolonisatörer vilka alla delar på en
gemensam egenskap att aggregera med andra bakterier17,24 och för att se cellfördelningen
användes FISH, en metod där man färgar in cellerna med olika fluorecenta färger för att se
hur mycket av varje bakterieart som finns på provkroppsytorna. Eftersom de olika bakterierna
samspelar med varandra vid plackbildning kan det vara viktigt att att se hur mycket av varje
bakterieart som lever. Metoden innebär att provkropparna behandlas med olika vätskor.
Paraformaldehyd, som används för att ”klistra fast” cellerna på provkroppsytan så att de inte
spolas bort vid rengöring med alkohol. Enzym Lysozym öppnar upp cellmembranet hos de
olika cellarterna för att tillåta infärgning.
Under cellfördelningen var noritake en intressant grupp (c), då resultatet visar en markant
minskning av A. naeslundii. Anledningen till detta kan vara att de inte kan hålla sig kvar på
det släta materialet. Troligtvis är de mer känsliga än de andra bakteriearterna. En statistisk
analys gjordes med hjälp av two-way ANOVA, där man tydligt kunde avläsa en signifikant
lägre % yttäckning av celler på porslinsprovkropparna i Fish-metoden; efter en och sju dagars
cellodling.
Bakterierna som användes i studien kommer från kliniskt renodlat plack, det vill säga direkt
från munnen på en person. Resultatet hade kunnat vara annorlunda om samma studie hade
gjorts med bakterier från flera olika personer. Även om vi alla har dessa bakteriearter i
munnen, kan de bete sig olika hos olika personer.
En svårighet har varit att beräkna materialåtgången, då metoden ändrades under studiens
gång. Varken provkroppar eller tid fanns för att upprepa studien flera gånger, vilket hade varit
relevant för att få fram ett mer tillförlitligt resultat.
20 SLUTSATS
Med reservationer för studiens begränsningar, uppvisar varken kompositmaterialen eller
porslinet någon cytotoxisk påverkan på omkringliggande celler. Vad gäller ytstrukturen,
ger ett mer slätt material minskad bakterieadhesion. Vissa bakterier är känsligare än
andra vad gäller ytsrukturen med avseende på adhesion. Näring påverkar cellernas
överlevnad och otillräcklig näring leder till detachment av celler. Vidare studier behövs
för att säkerställa resultaten som framkom i föreliggandestudie.
21 MATERIALLISTA
Material
†
*
±
€
π
¥
β
¢
÷
§
¬
¤
µ
Kompositmaterial: Crea lign dentin A1 094346
Kompositmaterial: 3MTM ESPETM SinfonyTM (Dc3 Lot 311805)
Isoleringsmedel: Stumpfisolierung Die Release
Putty: Labputty, Coltène Whaledent, lot nr 0215185, Hard Coltène (aktivator) 0187649.
Per cirkel mått: en diameterssträng och 40s blandning.
Polymerisering SinfonyTM: 6 min, polymerisering Crea lign: 180s x 2
Rengöring SinfonyTM: Buffalo ROBINSON’S BRISTLE BRUSHES
Rengöring Crea.lign: Bredent Isopropylalkohol 2542252
Hårdmetallfräs: Edenta Cross Cut Superfine 5730.045 HP
Isoleringsmedel: 10830IvoclarVivadent Ceramic separating liquid H36331
Fältspatsporslin: Noritake superporcelain EX-3 (E3) 024699
Forming liquid: Noritake forming liquid BJWPM
Glasfiberduk: Fibrous Pad Firing Supports +J017B01701
Diamantfräs: Two Striper, Taper round end vf04/09 toolnr 777.8
Lim: Sekundenkleben Renfert 1733-0100
Materiel
α Ljushärdare SinfonyTM: 3MTM ESPETM Beta Vario Light Unit, 3MTM ESPETM Visio Vario
N2879F Typ 919022
Ljuhärdare Crea.lign: Dentacolor XS Kulzer.
ζ Handsycke: KaVo EWL 4941
२ Sintringsugn: KaVo TOUCH&PRESS
६ High speed: Turbinmotor KaVo K-Air Plus
९ Optisk interferometer: Micro XAM Surface Mapping Microscope
☺ Autoklav: Getinge Costech model A12B23LTB
22 ORDFÖRKLARINGAR
Aggregegation
Sammanklumpa sig.
Anaeroba bakterier Bakterier som lever utan syre.
Blodagarplattor
Plattor av agargel som innehåller blod och andra näringsämnen.
Plattorna framställs genom att den varma agargelen hälls i flata
plastskålar där den får stelna. Blodagarplattor används i stor
utsträckning för odling av bakterier.
Cytotoxisk
Toxicitet som orsakar celldöd.
Detachment
Avlossning, i detta sammanhang: avlossning av bakterier från en yta.
Immersion
En droppe olja placeras mellan mikroskopobjektivet och
täckglaset/objektet i ett vanligt ljusmikroskop. Immersionsoljan, som
skall ha samma brytningsindex som glas, ökar mikroskopets
upplösning och skärpa.
Medium
Inom mikro- och cellbiologin näringslösning eller näringsgel för
odling av bakterier eller andra celler.
23 TACK TILL
•
Lars Olsson, Universitetsadjunkt, Odontologiska fakulteten.
•
Gunnel Svensäter, Professor, Odontologiska fakulteten.
•
Ryo Jimbo, Post doc, forskare vid Odontologiska fakulteten.
•
Bertil Kinnby, för hjälp med statistisk analys.
•
Teknodont, för utlåning av utrustning.
•
, för tillhandahållande av material.
24 REFERENSER
1. Ali SA, Doherty PJ, Williams DF. Mechanisms of polymer degradation in implantable
devices. 2. Poly(DL-lactic acid). J Biomed Mater Res 1993;27:1409–18.
2. Anusavice Kenneth J., Phillips Ralph W, Phillips’ science of dental materials. St Louis:
Mo: Saunders, 2003.
3. Auty M. A., Gardiner G. E., McBrearty S.J., O’Sullivan E. O., Mulvihill D. M., Collins J.
K., et al. Direct in situ viability assessment of bacteria in probiotic dairy products using
viability staining in conjunction of confocal scanning laser microscopy. Appl Environ
Microbiol. 2001;67:420-5.
4. Bachle M., Kohal R. J. A systematic review of the influence of different titanium surfaces
on proliferation, differentiation and protein synthesis of osteoblast-like MG63 cells. Clin.Oral
Implants Res 2004;15:683-92.
5. Bowden G. H., Hamilton I. R. Survival of oral bacteria. Crit.Rev.Oral Biol.Med.
1998;9:54-85.
6. Bressan E., Paniz G., Lops D., Corazza B., Romeo E., Favero G. Influence of abutment
material on the gingival color of implant-supported all-ceramic restorations: a prospective
multicenter study. Clin Oral Implants Res 2010.
7. Capopreso S , Bacterial Adhesion to Dental Alloys. The Role of the Surface and
Composition. Minerva Stomatol 1999; 48: 509-23.
8. Caughman W. F., Caughman G. B., Shiflett R. A., Rueggeberg F., Schuster G. S.
Correlation of cytotoxicity, filler loading and curing time of dental composites. Biomaterials
1991;12:737-40.
9. Chavez de Paz L. E., Hamilton I. R., Svensater G. Oral bacteria in biofilms exhibit slow
reactivation from nutrient deprivation. Microbiology 2008;154:1927-38.
10. Fabianelli A., Pollington S., Papacchini F., Goracci C., Cantoro A., Ferrari M., et al. The
effect of different surface treatments on bond strength between leucite reinforced feldspathic
ceramic and composite resin. J Dent 2010;38:39-43.
11. Ferracane J. L., Condon J. R. Rate of elution of leachable components from composite.
Dent Mater 1990 ;6:282-7.
12. Ferracane J. L. Elution of leachable components from composites. J.Oral Rehabil.
1994;21:441-52.
13. Gibbons R. J., Nygaard M. Interbacterial aggregation of plaque bacteria. Arch.Oral Biol.
1970 ;15:1397-400, (IN39.)
25 14. Ilie N., Hickel R. Investigations on mechanical behaviour of dental composites. Clin.Oral
Investig. 2009;13:427-38.
15. Karoussis I. K., Salvi G. E., Heitz-Mayfield L.J., Bragger U., Hammerle C. H., Lang N. P.
Long-term implant prognosis in patients with and without a history of chronic periodontitis: a
10-year prospective cohort study of the ITI Dental Implant System. Clin.Oral Implants Res.
2003 ;14:329-39
16. Kim D. J., Lee M. H., Lee D. Y., Han J. S. Mechanical properties, phase stability, and
biocompatibility of (Y, Nb)-TZP/Al(2)O(3) composite abutments for dental implant.
J.Biomed Mate Res. 2000;53:438-43.
17. Kolenbrander Paul E., Andersen Roxanna N., Kazmerzak Karen, Wu Rosemary, Palmer
Jr. Robert J. [24] Spatial organization of oral bacteria in biofilms. Ingår i: Ron J. Doyle, red.
Methods in Enzymology: Academic Press; 1999. 322-32.
18. Kolenbrander P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic
systems. Annu.Rev.Microbiol. 2000;54:413-37.
19. Kuramitsu Howard K., Ellen Richard P. Oral bacterial ecology: the molecular basis.
Wymondham: Horizon Scientific, 2000
20. Lappin-Scott Hilary M., Costerton J.W, Microbial biofilms. Cambridge: Cambridge Unic.
Pr., 1995
21. Lefebvre C. A., Schuster G. S. Biocompatibility of visible light-cured resin systems in
prosthodontics. J Prosthet Dent 1994;71:178-85.
22. Lin N. J., Lin-Gibson S. Osteoblast response to dimethacrylate composites varying in
composition, conversion and roughness using a combinatorial approach. Biomaterials 2009
;30:4480-87.
23. Listgarten M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and
disease in man. A light and electron microscopic study. J Periodontol 1976;47:1-18.
24. Marsh Phillip, Martin Michael V, Oral microbiology. Edinburgh: Churchill Livingstone
Elsevier, 2009
25. Oysaed H., Ruyter I. E. Water sorption and filler characteristics of composites for use in
posterior teeth. J Dent Res 1986;65:1315-8.
26. Prokop A, Rosenberg MZ. Bioreactor for mammalian cell culture.Adv Biochem Eng
Biotechnol 1989;39:29–37
27. Renvert S., Persson G. R. Periodontitis as a potential risk factor for peri-implantitis. J Clin
Periodontol 2009;36 Suppl 10:9-14.
26 28. Schweikl Helmut, Altmannberger Inge, Hanser Nico, Hiller Karl-Anton, Bolay Carola,
Brockhoff Gero, et al. The effect of triethylene glycol dimethacrylate on the cell cycle of
mammalian cells. Biomaterials 2005 7;26:4111-8.
29. Seil J. T., Webster T. J. Reduced Staphylococcus aureus proliferation and biofilm
formation on zinc oxide nanoparticle PVC composite surfaces. Acta Biomater. 2011 21.
30. Svensäter G, Bergenholtz G (2004) Biofilms in endodontic infection. Endod Topics 9: 27
31. Vadgama P, Surfaces and Interfaces for Bio-Materials. Woodhead Publishing, Limited,
2005. Cambridge, Storbritannien.
32. van Winkelhoff A. J., Goene R. J., Benschop C., Folmer T. Early colonization of dental
implants by putative periodontal pathogens in partially edentulous patients. Clin.Oral
Implants Res 2000;11:511-20.
33. Whittaker C. J., Klier C. M., Kolenbrander P. E. Mechanisms of adhesion by oral bacteria.
Annu Rev Microbiol 1996;50:513-52.
34. Williams DF. Biomaterials and biocompatibility. Med Prog Technol1976;20:31–42
35. Yadav S., Upadhyay M., Borges G. A., Roberts W. E. Influence of ceramic (feldspathic)
surface treatments on the micro-shear bond strength of composite resin. Angle Orthod. 2010
;80:577-82.
36. Zimmeli B., Strub M., Jeger F., Stadler O., Lussi A. Composite materials: Composition,
properties and clinical applications. Schweiz Monatsschr Zahnmed 2010;120:972-9.
Övriga referenser
37 Socialstyrelsen, Kunskapscenter för Dentala Material; Dentala kompositmaterial. 2006
38 Michigan Metrology: http://www.michmet.com/3d_s_height_parameters.htm
27 TACK TILL
•
Lars Olsson, Universitetsadjunkt, Odontologiska fakulteten.
•
Gunnel Svensäter, Professor, Odontologiska fakulteten.
•
Ryo Jimbo, Post doc, forskare vid Odontologiska fakulteten.
•
Bertil Kinnby, för hjälp med statistisk analys.
•
Teknodont, för utlåning av utrustning.
•
, för tillhandahållande av material.
28
