Frågor + Svar

Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
KORTSVARSFRÅGOR
1. Förklara begreppet katabolit repression i bakterier (Mekanistisk beskrivning
behövs ej). (2p)
Svar: Hög tillgång på glukos nedreglerar vissa andra geners transkription.
2. Vad skiljer en temperat från en virulent bakteriofag? (2p)
Svar: En virulent bakteriofag genomgår endast en lytisk infektion – den replikerar
snabbt och lyserar värdcellen. En temperat bakteriofag kan genomgå en lytisk
infektion, men även inkorporera sitt DNA i bakteriekromosomen – lysogeni. Den
lysogena, temperata bakteriofagen kan sedan aktiveras och ger då lytisk infektion.
3. Vilka två kriterier på DNA måste vara uppfyllda för att det ska kunna packas i
lambda in vitro? (2p)
Svar. Det måste innehålla cos-sekvensen; dvs de basparskomplementära
ändstrukturerna i lambda DNA och mänden DNA måste vara lagom stort, ej för
kort och ej för långt.
4. Vad innebär blå/vit selektion i samband med kloning av främmande DNA
fragment? (2p)
Svar: Vissa plasmidvektorer innehåller en gen (lacZ´) som kodar för en del av ett
enzym som heter beta-galaktosidas. Beta-galaktosidas kan bryta ner X-gal till en
produkt med en blå färg. I plasmidens lacZ´ gen finns klyvningssäten för diverse
restriktionsenzymer och genom att klona in ett DNA fragment här kan inget aktivt
beta-galaktosidas bildas. Genom att växa bakterier med plasmid på plattor med
X-gal kan vi skilja på de plasmider som upptagit ett DNA fragment och därmed
inaktiverat beta-galaktosidas från de bakterier som innehåller plasmid utan insatt
DNA fragment. Bakteriekolonier med upptaget DNA fragment i plasmiden blir
vita, medan de utan DNA fragment i plasmiden bildar aktivt beta-galaktosidas och
därför blir blå.
1
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
5. Virus behöver enzymer för genom replikation. Vissa virus måste ta med sig
replikations enzymer från den infekterade cellen för att kunna infektera en ny cell.
Finns det replikations enzymer och i så fall vilka enzymer i A) alfavirus (ett RNA
virus med positiv polaritet, även kallat sense RNA), B) mässlingvirus (negativt
RNA), C) influenssavirus (segmenterat negativt RNA) och D) retrovirus
(RNA/DNA virus)? (4p)
Svar:
A) inga, B) RNA-polymeras, C) RNA-polymeras, D) proteas, omvänd transkriptas
och integras
6.
a)
b)
c)
Vilka av följande påståenden om Herpes virus är korrekta? (6p)
Cytomegalo virus ligger latent i nervceller.
Vid latens integreras det virala genomet i värdcellens genom.
Herpes virus membran fusion sker vid plasmamembranet och är således pH
oberoende.
d) Herpes virus är beroende av värdcellens DNA polymeras för replikation.
e) Herpes simplex virus protein ICP34.5 inhiberar interferon signalering genom
att fosforylera initiations faktor 2.
f) Acyclovir aktiveras endast av viruskodat tymidin kinas och inte av cellens
eget tymidin kinas.
Rätt svar: c och f
a)
b)
c)
d)
e)
CMV ligger latent i lymfocyter.
Det virala genomet vilar episomalt.
rätt.
Kodar för sitt eget DNA polymeras.
ICP34.5 binder det cellulära proteinet fosfatas 1alfa som i sin tur
defosforylerar initiations faktor 2.
f) rätt.
7. Nämn 4 virus som sprids till människa via insekter. (4p)
Svar:
fästing buren enkefalit (TBE), gula feber, Dengue, SFV, Sindbis, Ockelbo m. fl.
8. Vad menar man inom jästgenetiken med en "multi-copy suppressor"? (2 p)
2
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
Svar:
A multi-copy (or gene dosage) suppressor is a gene, which, when expressed at
high levels, overcomes (some of) the effects of a certain mutation.
9. Förklara principen bakom det så kallade 2-hybrid systemet. Vad används detta
system till? (3 p)
Svar:
Two putative interacting proteins X and Y are fused to the DNA binding domain
(BD) or activation domain (AD) of a yeast transcriptional activator. An
interaction between X and Y reconstitutes the activator and leads to transcription
of a reporter gene, resulting in an easily detectable phenotype. To identify and
characterize protein-protein interactions.
10. Trots att det humana genomet nu är fullständigt sekvenerat kan vi fortfarande
få mycket nyttig information genom att sekvenera cDNA. Vilken typ av
information? (2 p)
Svar:
Info om: Alternativ splicing Var finns exoner och introner - svårt att förutsäga
helt korrekt med bioinformatik. Vävnadsspecifikt genuttryck (ex.v. cDNA från
lever).
11. Homologa gener kan antingen vara paraloger (paralogues) eller ortologer
(orthologues). Förklara kortfattat dessa båda begrepp. (2 p)
Svar:
Ortolog: gen som är homolog till en gen hos en organism av en annan art
Paralog: gen som är homolog till en gen hos samma organism Anmärkning:
Paraloga gener har uppkommit genom att en ursprunglig gen duplicerats så att
de två kopiorna kunnat utvecklas oberoende av varandra och få olika funktioner.
Exempel på paralogi är hemoglobin- och myoglobingenerna hos människa
12. Beskriv och förklara funktion för de olika element som ingår i en reportergenexpressionsvektor som kan användas i mammalieceller. Förklara gärna genom att rita en
schematisk figure (4p)
Svar:
Element i reportergen-expressionsvektor:
Multiple cloning site, polylinker plats för insättande av regulatorisk gensekvens
3
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
Reportergen
Poly A
Bacterial Ori
kodande sekvens för reporterprotein
polyadenyleringssignal
“Origin of replication”, replikeringsstartpunkt i E Coli
Antibiotikaresistens markör för
selektion av bakterier som innehåller
vektor.
AmpR
13. Vilka olika funktionella domäner har nukleära receptorer? (3p)
Svar: N-terminal (activation domain), DNA bindande (DNA-binding domain),
ligand bindande (Ligand-binding domain)
(Additionally: Dimerzation domain, C-terminal ligand-dependent activation
domain, repression domain, nuclear localization dignals…)
14. What is the purpose with drugs acting on nuclear receptors? (1p)
Svar: To increase or decrease the activity of NRs with the intention to redress the
balance and the dynamics of biological and biochemical processes in the body.
To affect NR target gene expression positively or negatively.
15. Provide examples of post-translational modifications that occur on histone
tails.Which type of amino acid residues are subject to these modifications? (3p)
Svar (alternatives)
Acetylation – lysine (most common modification by HAT enzymes),
(Deacetylation – acetyl-lysine ; by HDAC enzymes)
Methylation – lysine, arginine
Phosphorylation – serine, threonine
Ubiquitination - lysine
16. Beskriv kortfattat hur Cre/loxP systemet fungerar.(2p)
Svar: Cre/loxP systemet används ofta för att göra konditionella knockouter. Två
korta DNA-sekvenser, loxP sites, kan baspara med varandra om de sitter i samma
orientering. Enzymet Cre, ett rekombinase, klyver ut sekvensen som finns mellan
loxP sekvenserna. Cre kan uttryckas transient i cell-linjer eller med hjäp av
transgena möss.
4
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
17. Hur många transkript kan man detektera mha. en genexpressionsarray? (1p)
Svar: Från hundratals till över 55 000 beroende på array och teknologi.
18. Förklara följande termer: (4p)
a)
Inversion
b)
Reciprok translokation
c)
Mosaicism
d)
Deletion
Svar:
a) Strukturell intra-kromosomal avvikelse. Efter två kromosombrott på samma
kromosom sker en 1800 rotation av det interstitiella kromosomsegment.
b) Ett ömsesidigt utbyte av kromsommaterial mellan två eller flera kromosomer.
c) Individ bestående av flera olika cellinjer (som härstammar från samma
zygot).
d) Förlust av kromosommaterial.
5
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
19. Ett par väntar sitt första barn. Mannens morbror avled i tonåren till följd av
Duchennes muskeldystrofi, en sjukdom som nedärvs X-bundet recessivt
(incidensen är 1/5 000 pojkar). Paret är mycket oroligt och undrar hur stor risken
är att det väntade barnet har sjukdomen. Vilken information ger Du? (2p)
Svar: Mannen har ej anlaget eftersom han då skulle vara sjuk.
Risken för paret är densamma som i övriga befolkningen, dvs 1/10 000.
1p
1p
20. Nämn två monogena sjukdomar för vilka alla nyfödda i Sverige screenas.
Varför screenar man för just dessa mycket ovanliga sjukdomar? (3p)
Svar: 1 p för varje sjukdom (max. 2p); 1 p för motivering
PKU, galaktosemi, 21-hydroxylasbrist, (+hypothyreos, vissa former kan vara monogena),
biotinidasbrist
Dessa sjukdomar ger svåra irreversibla skador som kan undvikas med tidig
behandling
21.Vad är den principiella skillnaderna mellan funktionell kloning och positions
kloning av en sjukdomsgen? Beskriv de olika strategierna i stora drag! (2p)
Svar: Funktionell kloning utgår från att man har kunskap/kännedom om vilket
protein som är defekt vid den aktuella sjukdomen. Detta protein kan isoleras,
sekvensbestämmas och utifrån aminosyrasekvens kan man härleda DNA sekvens
och sedan med olika metoder isolera motsvarande gen på DNA nivå.
Vid positionskloning behöver man ej ha kunskap om protein defekten. Genen
identifieras genom att lokalisera genen till en viss kromosomregion. Detta kan
underlättas av att man har en cytogenetiskt detekterbar aberration hos sjuka
individer (t ex translokation , fragilt site, deletion). Oftast finns inte detta, utan
genen lokaliseras
m h a kopplingsanalys, mappning. Efter identifiering av en kromosomregion
studeras denna region i detalj och kandidatgener identifieras. Dessa kandidatgener
karakteriseras och analyseras m a p mutationer.
22. Vi förväntar oss att ett protein i sin nativa strukutur skall innehålla mycket
sekundärstruktur. Varför är det så, och hur kan man experimentellt bestämma ett
proteins sekundärstrukturinnehåll utan att ha dess tredimensionella struktur? (2p)
Svar: För att N-H och C=O grupperna i ryggraden skall kunna bilda
vätebindningar. CD spektroskopi.
6
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
23. Markera i den schematiska pentapeptiden nedan (sidokedjorna visas som "R"):
(2p)
a) mellan vilka atomer det skulle finnas vätebindningar om peptiden har en αhelix konformation
b) torsionsvinklarna ϕ och ψ vid respektive bindning i någon av de mittre
residuerna.
H
N
H
O
R
H
C
C
N
C
N
R
H
H
H
O
R
H
C
C
N
C
C
N
O
R
H
H
O
H
C
C
O
R
24. Hur kan man känna igen ett membranbundet protein från dess aminosyresekvens?
(1p)
Svar: Transmembranhelixar ger en typisk ca 20 aa lång hydrofob signatur.
7
C
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
BERÄTTARFRÅGOR
25. En plasmid innehåller följande nukleotidsekvens:
...AAACTGCAGAAGCGCATTGGATCCCATTGC... osv
...TTTGACGTCTTCGCGTAACCTAGGGTAACG...
AspProIle
Följande gäller:
a)
b)
c)
d)
e)
En öppnen läsram börjar GATCCCATT osv och kodar för Asp-Pro-Ile osv
En prokaryot promotor finns till vänster om den utritade sekvenser och
transkriberar från vänster till höger in i läsramen.
Enzymet Pst I klyver CTGCA*G med 3´överhängande komplementära ändar
(..CTGCA-3´) (understruket i sekvensen ovan)*=klyvningspunkten.
Enzymet Bam HI klyver G*GATCC med 5´överhängande komplementära
ändar (5´-GATC..) (understruket i sekvensen ovan) *=klyvningspunkten.
Translations initiering saknas.
UPPGIFTEN: (9p)
Designa två oligonukleotider som, när de annealat med varandra, kan ligeras in
mellan Pst och Bam i plasmiden.
Denna nya DNA snutt (= fragment) ska tillföra plasmiden möjlighet att translatera
den öppna läsramen GATCCCATT osv.
Ledtråd: den del av 16sRNA som basparar med ett RBS har sekvensen 5´-CCUCC
Svar:
5´- GGAGGNNNNNNNNNATG
och
5´-GATCCATMMMMMMMMMCCTCCTTGCA
som efter annealing blir:
GGAGGNNNNNNNNNATG
ACGTCCTCCMMMMMMMMMTACCTAG-5´
N=vilken nukleotid som helst med M som komplementär.
Det måste i svaret framgå att man tagit hänsyn till
1
2
3
4
5
korrekt läsram (2p)
korrekt överhäng vid restriktionsenzymerna med 3´överhäng för Pst och
5´överhäng för Bam. (2p)
korrekt ribosom bindande site (GGAGG) (2p)
korrekt avstånd mellan RBS och ATG (4-10 nt) (1p)
ett ATG som initiering (2p)
8
Tentamen Molekylärbiologi med strukturbiokemi T3
2004-01-09
___________________________________________________________________
Frågor + Svar
26. ”Cross-talk” between transcription factors (e.g. glucocorticoid receptor and
NFκB) is common to intracellular signaling pathways and can occur via various
distinct mechanisms. Draw models and explain at least three (3) of these mechanisms!
(6p)
Svar: > 10 mechanisms possible, positive and negative corss-talk
DNA-binding competition
Transrepression
Cofactor competition
IkB induction
GC induced degradation
GC induced modification
(see Review cross-talk lab …)
27. Det finns flera olika kriterier för att bedöma kvaliteten hos en struktur som
bestämts med röntgenkristallografi. Redogör för minst tre sådana kriterier (vad man
tittar på, hur det skall tolkas).(6p)
SVAR: RAMACHANDRAN, R-FAKTOR/R-FREE,GOD FÖRDELNING
POLÄRA/OPOLÄRA, VÄTEBINDINGAR SATISFIERADE, SEKUNDÄRSTRUKTUR,
UPPLÖSNING
9