UMEÅ UNIVERSITET
Institutionen för molekylärbiologi
2011-01-11
RUT10 - Biomedicinsk vetenskap I
FÄRGNING OCH MIKROSKOPERING AV MIKROORGANISMER
Målsättning
Att använda metoder för direkt observation av mikroorganismer.
Bakgrund
Det mänskliga ögat kan se en partikel med en diameter av ca 0,1 mm på ett avstånd av
25 cm. Bakterier är ytterligare 50-100 gånger mindre (1-2 μm). Ljusmikroskops
maximala upplösningsförmåga är ca 0,2 μm, dvs två partiklar kan inte särskiljas om
avståndet är mindre än 0,2 μm. För att studera sedimenterade celler eller celler som
växer på botten av ett odlingskärl används ett ljusmikroskop som är inverterat, sk
invertmikroskop. För att få fram en skarpare bild av celler kan man använda ett
faskontrastmikroskop där kontrasten mellan celler och omgivande medium förstärkts
eller binda en fluorescerande substans till celler och observera dem i ett
fluorescensmikroskop och då avger cellen ljus medan bakgrunden är mörk. Många
celldelar och cellstrukturer kan ibland påvisas selektivt och på ett iakttagbart sätt med
hjälp av färgningsmetoder. Färgningen medför oftast celldöd. De strukturer som iakttas
i färgade celler förekommer därför inte säkert i den levande cellen utan måste påvisas
genom jämförande studier. Celler avgränsas utåt av cellvägg och cellmembran, som
fungerar som permeabilitetshinder för de flesta färgämnesmolekyler; även inuti cellen
finns det barriärer mot fri diffusion. Av den anledningen får man sällan ett bra resultat
om man behandlar celler direkt med en lösning av färgämnet. För att
färgämnesmolekylerna ska nå cellens inre, måste således cellvägg och membran
förstöras, vilket sker genom fixering med kemiska substanser eller med värme. Vid
fixering i värme koaguleras cellproteinerna genom värmning i låga. Det är en grov
metod i jämförelse med den kemiska fixeringen, men den går fort att utföra. Efter
fixering har utfällt protein ett brytningsindex, som är nästan samma som
immersionsoljans brytningsindex (1.52), medan löst protein (cytoplasma) har ett
betydligt lägre brytningsindex (ca 1.35). Därför syns fixerade celler mycket klarare om
oljeimmersionsobjektivet används.
Mikroskopering:
Att ställa in skärpan på mikroskopet kan vara besvärligt. En bra metod är att börja med
lägsta förstoringen, 10X-objektivet (gult). Ställ in skärpan på täckglasets kant eller på en
luftbubbla. När sedan objektivet vrids till 40X kommer skärpan att vara nästan rätt.
Ställ in exakt, lägg på en droppe immersionsolja, vrid till 100X och finjustera. Olja
måste användas på 100Xobjektivet. Däremot får olja inte användas på de andra
objektiven. Man kan alltså i regel inte gå tillbaka och titta på 40X från 100X. Okularet
(som man tittar i) förstorar 10X. 10X-objektiv + 10X-okular ger 100X förstoring, 40X
ger 400X osv.
Materiel
Färglösningar
Täckglas
Kleenex
Sterilt vatten
Preparatställ (sandlåda)
Objektglas
Acetonsprit
0.15M NaCl
Preparathållare
A. MIKROSKOPISK UNDERSÖKNING AV OFÄRGADE CELLER
Mikroorganismer
t. ex.
Escherichia coli
Sarcina lutea
Saccharomyces cerevisiae
eller andra av assistenten
angivna stammar.
Utförande
1.
2.
3.
4.
övernattkulturer på LAL-platta
48 h gammal kultur på YE-platta
Tvätta ett objektglas med acetonsprit. På det torkade glaset sätts en droppe
0,9% NaCl. Fem μl bakteriekultur doppas direkt på objektglaset.
Lägg försiktigt på ett väl avtorkat täckglas så att luftbubblor inte bildas.
Studera preparaten i mikroskop.
Rita av de olika celltyperna och kommentera iakttagelserna.
B. FÄRGNING AV CELLER MED METYLENBLÅTT
Färgning med metylenblått är en enkel och snabb metod som används för allmän
färgning av bakterier, ibland även för klinisk identifiering. Metylenblått är ett positivt
laddat färgämne som reagerar med negativa laddningar. Eftersom sådana laddningar
förekommer överallt i cellen är metoden avsedd för färgning av hela celler och är
alltså olämplig för studier av substrukturer.
Mikroorganismer
t. ex. Bacillus subtilis (övernattskultur på LAL-platta)
eller annan av assistenten angiven mikroorganism.
Färglösning
Löfflers alkaliska metylenblått.
2
Utförande
1. Tvätta rent ett objektglas med acetonsprit. På det torkade glaset sätts en droppe
0.9% NaCl, i vilken lite celler från en koloni på plattan slammas upp. Droppen
breds ut med plastplatinösen till en yta av ca 1 cm2.
2. Preparatet torkas långsamt ca 50 cm över brännarens stora låga (vattnet får
inte börja koka).
3. Fixera cellerna genom att föra objektglaset med bakteriesidan uppåt genom
stora lågan 4-5 gånger.
4. Droppa flödigt med färglösning på den torkade bakteriesuspensionen och
vänta 2-3 min. Häll av färgen i sandlådan.
5. Doppa glaset i en bägare med kallt vatten. Spola kranvatten mot bägarens kant
tills ingen ytterligare färg löses ut.
6. Torka preparatet försiktigt med Kleenex.
7. Studera preparatet i mikroskop.
8. Rita av preparatet, dvs de färgade cellerna och kommentera dina iakttagelser.
C. GRAMFÄRGNING
Gramfärgningen är värdefull vid klassificiering och identifiering av bakterier.
Gramreaktionen är ett stabilt karakteristikum för en bakterie. Grampositivitet är en
egenskap hos aktivt växande celler av vissa arter. Celler i stationärfas förlorar denna
egenskap och det är därför viktigt att vid färgning använda celler i logaritmisk
tillväxtfas.
Bakterier
t. ex. Staphylococcus aureus och
Escherichia coli (övernattkulturer på LAL-plattor)
eller andra av assistenten angivna bakterier.
Färglösningar
Kristallviolett
Lugols lösning
Avfärgningslösning
Saffraninlösning
Utförande
1. Tvätta rent ett objektglas med acetonsprit. På det torkade glaset sätts en droppe
0,9% NaCl, i vilken litet celler från en bakteriekoloni på plattan slammas upp.
Ta cellprovet från kanten av kolonin där det förekommer aktivt växande celler.
Droppen breds ut med öglan till en yta av ca 1 cm2.
2. Preparatet torkas långsamt ca 50 cm över brännarens stora låga (vattnet får
inte börja koka).
3. Fixera genom att föra objektglaset med bakteriesidan uppåt genom stora lågan
4-5 gånger.
4. Droppa på rikligt med kristallviolett på den torkade bakterie-fläcken och vänta
60 sekunder. Låt färgen rinna av i sandlådan och doppa glaset i en bägare med
kallt vatten. Spola kranvatten mot bägarens kant till dess ingen ytterligare färg
löses ut.
3
5. Droppa på rikligt med Lugols lösning (jod-jodkaliumlösning). Vänta 60
sekunder. Skölj försiktigt i vatten (se ovan).
6. Droppa på rikligt med avfärgningslösning till dess ingen ytterligare färg löses ut.
7. Skölj sedan preparatet noggrant (och försiktigt) i kallt kranvatten i bägare.
Spola vatten mot bägarens kant.
8. Badda preparatet torrt med Kleenex - torka inte bort bakterierna!
9. Mikroskopera. Grampositiva celler blir blå, gramnegativa avfärgas.
10. För att få klarare skillnad mellan grampositiva och gramnegativa celler
kontrastfärgas preparatet med Saffranin som droppas på flödigt. Vänta 45 sekunder.
11. Skölj preparatet med vatten och torka.
12. Mikroskopera.Gram-positiva organismer färgas blå-rödvioletta. Gramnegativa
organismer färgas röda.
Rita av, ange Gramreaktion och redogör för den mikroskopiska bilden av
respektive preparat med och utan kontrastfärgning.
Redogörelse inlämnas i form av ifyllda resultatblad.
4
APPENDIX
RECEPT PÅ FÄRGLÖSNINGAR
Löfflers alkaliska metylenblått.
Recept: Metylenblåttklorid, mättad lösning i
95% etanol (löslighet ca 1,6 g/100 ml vid 20°) 30 ml
KOH löst i vatten, 0.01% 100 ml
Kristallviolett
Recept: Lösning A:
Kristallviolett 10 mg
Etanol 95% 100 ml
Blanda till dess innehållet gått i lösning
Lösning B:
Ammoniumoxalat, 1% i destillerat H2O
Blanda 20 ml av lösning A och 80 ml av lösning B.
Lugols lösning.
Recept: 3.3 g jod och 6.7 g kaliumjodid (KI) blandas i en mortel och
behandlas till dess komponenterna blandats väl. Fukta massan med
små uppmätta portioner vatten, överför allting kvantitativt till en
glasproppsflaska. Fyll på med totalt 1 l vatten. Skaka till dess
innehållet gått i lösning.
Avfärgningslösning för gramfärgning
Recept: Isopropanol, 75 ml plus Aceton 25ml (alt. Etanol 75 ml plus aceton
25 ml).
Saffraninlösning 0.5% vattenlösning.
5
UMEÅ UNIVERSITET
Kurs
__________________
Institutionen för molekylärbiologi
Termin/År __________________
Grupp nr
__________________
Namn
__________________
FÄRGNING OCH MIKROSKOPERING AV MIKROORGANISMER.
RESULTAT
A. MIKROSKOPISK UNDERSÖKNING AV OFÄRGADE CELLER
Kommentarer: __________________________________________________________
______________________________________________________________________
6
B. FÄRGNING AV CELLER MED METYLENBLÅTT
Kommentarer: __________________________________________________________
______________________________________________________________________
C. GRAMFÄRGNING
Kommentarer: : __________________________________________________________
______________________________________________________________________
7
