Genetiska studier
av spädlosta på Tjörn
(Bromus pseudosecalinus)
Rapport 2008:83
Rapportnr: 2008:83
ISSN: 1403-168X
Redaktör: Lars Sjögren
Utgivare: Länsstyrelsen i Västra Götalands län, naturvårdsenheten
Rapporten finns som pdf på www.lansstyrelsen.se/vastragotaland
under Publikationer/Rapporter.
Förord
Denna rapport redovisar resultatet av genetiska studier som gjorts av vad
som ansetts vara en population av spädlosta (Bromus pseudosecalinus). Som
framgår av rapporten visar resultaten att den population som finns på Tjörn
inte är samma art som den spädlosta som förekommer i England.
Den genomförda genetiska studien är ett led i Länsstyrelsens arbete inom
åtgärdsprogrammet för bevarande av spädlosta. Arbetet har utförts vid
Uppsala universitet av Elisabeth Långström, som även är författare till
denna rapport.
Lars Sjögren
Koordinator för åtgärdsprogram för hotade arter
Länsstyrelsen i Västra Götalands län
Rapport:
Genetiska studier av spädlosta (Bromus
pseudosecalinus) på Tjörn
Elisabeth Långström
Uppsala 15 juni 2007
Introduktion
Spädlosta (Bromus pseudosecalinus) är ett konkurrenssvagt ettårigt gräs som
återfinns främst på de Brittiska öarna. Den enda kända svenska i dag levande
populationen finns på Tjörn. Tidigare har arten noterats från Skåne (1930) och
från Danmark (1939 och 1972) men har sedan dess inte setts i dessa områden.
Artens status är omdebatterad i Storbritannien och vissa forskare anser att den inte
ska räknas som en egen art. I de flesta viktigare floraverk har spädlostan
reducerats till en småväxt form (kromosomvariant) av råglosta. Innan denna
undersökning har de olika ståndpunkterna dock inte testats med moderna
genetiska metoder.
På de Brittiska öarna förekommer spädlosta dels i naturliga gräsmarker där
man kan återfinna det från år till år och dels som tillfällig på störda marker. I
Sverige finns den enda kända populationen av spädlosta i en hästhage, en naturlig
gräsmark med blottad jord pga. hästtramp. Arten är konkurrenssvag och beroende
av hävdade, gärna betade marker. Hagen på Tjörn har fungerat som betesmark
åtminstone sedan 1930-talet (Astholm 2005), men sedan 1999 har betestrycket
varit lågt. Detta missgynnade arten som har gått tillbaka. Under de senaste åren
har dock betet återupptagits och en åtgärdsplan upprättats.
För att undersöka den genetiska variationen på Tjörn samt släktskapet med
spädlosta från de Brittiska öarna har en pilotstudie genomförts med tre olika
genetiska metoder. Det första man måste göra är att samla in färskt material eller
frön som kan planteras. Från det färska materialet kan man sedan rena fram DNA
(extrahera DNA). Detta renade DNA har i denna studie använts till två olika
undersökningsmetoder – direkt sekvensering av DNA med påföljande
släktskapsanalys samt genetiska populationsstudier med AFLP (en metod där man
delar upp hela DNAt i många kortare stycken).
Den tredje metoden är kromosomtalsbestämning. De insamlade fröna odlas
i krukor och när de är lagom stora ger man dem extra vatten och ljus under ca 14
dagar för att de ska få en skjuts i tillväxten. När de mår riktigt bra tar skär man av
de yttersta rotspetsarna från plantorna där tillväxten är som intensivast. I
rotspetsarna sker delning av cellerna i tillväxtzonen och det är endast när cellerna
delar sig som man kan se kromosomerna och räkna dem. Däremellan ligger DNA
mer utspritt i cellkärnan. Rotspetsarna med aktiv celldelning fixeras så att
delningen avstannar och färgas in så att det går att räkna hur många kromosomer
växten har.
Uppdrag
I åtgärdsprogrammet för bevarande av spädlosta (Bromus pseudosecalinus;
Astholm 2005) beskrivs behovet av genetiska studier inom spädlosta. Mitt
uppdrag var att genomföra genetiska studier på arten enligt följande:
1. Insamling av material från engelska populationer av spädlosta samt från
populationerna på Tjörn.
2. Kromosomtalsbestämning av färskt Tjörnmaterial.
3. Extraktion av DNA och sekvensering av ITS, dels från 5 populationer från
England, dels från den svenska populationen. ITS (internal transcribed spacer) är
en DNA-region från cellkärnans DNA som ofta används för att konstruera
släktskapsträd hos växter på underfamiljsnivå och lägre (dvs släkten och arter;
Långström & Oxelman 2003) och den är därmed lämplig för denna studie. ITS
kodar inte för någon gen och har därför inte så starkt selektionstryck för att motstå
förändringar i DNA. Den kan alltså mutera tillräckligt ofta för att vi ska hitta
skillnader mellan arter. För att få ytterligare stöd för resultatet från ITS använde
jag också en icke-kodande DNA-region från kloroplasterna (de organeller inuti
cellerna som innehåller klorofyll). Den region jag använt är trnL-genens intron.
Ett intron är en del av DNA som kopieras men sedan redigeras bort innan proteinprodukten bildas (trnL står för transport-RNA leucin; transport-RNA är viktiga
vid proteintillverkningen). trnL-intronet muterar något långsammare än ITS och
ger inte lika bra upplösning på artnivå men ytterligare stöd till större
grupperingar.
4. Populationsstudier med AFLP (Amplified fragment length polymorphism).
AFLP ger många markörer och är en bra metod för att utvärdera finskalig
genetisk struktur. I AFLP-metoden klipper man sönder DNA i små bitar med
hjälp av restriktionsenzymer. Restriktionsenzymerna känner igen vissa
”bokstavskombinationer” i DNA-strängen och producerar många kortare DNAfragment. Dessa fragment (eller kombinationer av fragmenten) blir olika för olika
populationer och kan jämföras för att ge en bild av hur lika eller olika
populationerna är genetiskt.
AFLP-metoden är indelad i tre steg: 1) Klyvning av DNA med hjälp av
restriktionsenzym och ”påklistring” av specifika ändar på alla fragment som
känns igen vid amplifieringen. 2) Selektiv amplifiering av några av dessa
fragment genom PCR (Polymerase Chain Reaction; en metod för att göra många
kopior av ett DNA-fragment). 3) Separation av fragmenten genom elektrofores
med påföljande avläsning av mönstret. Man får ut ett bandmönster som man
sedan kan analysera matematiskt.
I planeringen ingick att göra AFLP-studier för 5 individ från 5 olika
populationer i England och 3 alt 5 individer från varje rumslig subpopulation
inom de svenska grupperna/populationerna.
Genomförande
1. Insamling av material från engelska populationer av spädlosta. Genom
intensiv kontakt med forskarkollegor, naturvårdare och plant recorders inom
BSBI (Botanical Society of the British Isles) samt duktiga amatörbotanister
(rekommenderade av BSBI) har jag fått en god bild av den aktuella utbredningen
av spädlostan i Storbritannien.
2. Kromosomtalsbestämning av färskt Tjörnmaterial. Kromosomtalsräkning
har genomförts med traditionella metoder från växande rotspetsar på växthusodlat
material (förbehandling med ABN (1-brom naftalen), fixering med etanol:
ättiksyra (3:1), hydrolys m 1M HCl, färgning m Schiff’s reagens och squashning i
45% ättiksyra följt av räkning i mikroskop).
Figur 1. Infärgning av rotspetsar med Schiffs reagens (Foto: Anneleen Kool).
3. Extraktion och sekvensering och fylogenetisk analys av ITS och trnLintronet. DNA-extraktion från färskt material, silicageltorkat material och pressat
torkat material gjordes med Carlson-Yoon-metoden (Yoon et al. 1991). Genetiska
undersökningar har gjorts med ITS (icke kodande kärn-DNA för studier på
artnivå) och trnL (icke kodande kloroplast-DNA för studier på något högre än
artnivå). Jag kompletterade med trnL för att få information både från kloroplastDNA och kärn-DNA. För amplifiering av ITS användes primer-paren P17 och
26S-82R (Oxelman & al. 2002). För sekvensering av ITS användes de inre
primer-paren P16 (Oxelman & Lidén 1995) och ITS4 (Whiteet al 1990). För
amplifiering och sekvensering av trnL användes primer-paren trnLBOC
(Oxelman et al. 2005) och trnLD (Taberlet et al. 1991). Fylogenetisk analys för
tolkning av släktskap: DNA-data analyserades i datorprogrammet PAUP*
(parsimonisk analys) ver. 4.0b8a (Swofford, 1998). Inställningar: Heuristic search
10 replicates of random taxon entries. TBR (tree-bisection-reconnection)
swapping and MULPARS (all most-parsimonious trees are kept) were used, with
all characters equally weighted and unordered (Fitch parsimony; Fitch, 1971).
Bootstrap resamplings was performed with 10000 replicates, using TBR swapping
with ten random taxon entries per bootstrap/jackknife replicate and MULPARS
off. Datamatrisen som analyserades hade alignats (ställts in på ett sådant sätt att
genetiskt besläktade regioner jämförs)manuellt och insertioner/deletioner kodats
som extra karaktärer med hjälp av datorprogrammet SeqState (Muller 2005),
Simmons & Ochoterena – simple coding. De alignade matriserna bifogas
rapporten som bilaga 1, 2 och 3. Den tredje matrisen är en utökad ITS-matris med
flera av de närstående arterna där det enbart fanns ITS-sekvenser att tillgå. Den
analysen är gjord för att få en bättre bild av arternas förhållande till varandra. Det
svenska och engelska materialet (spädlosta från Tjörn – Sjögren & Astholm;
spädlosta från England – Keith Spurgin och råglosta från Uppsala botaniska
trädgård – Långström) som DNA-extraktionerna gjorts ifrån finns deponerade i
Uppsalas herbarium (UPS).
4. AFLP (restriktionsenzymmetod för studier på populationsnivå). I denna
studie baserades AFLP-metoden på Vos et al. (1995) med modifikationer enligt
Bensch et al. (2002). Vidare användes 0.5 mM av både E- och M-primer (MWG
Biotech) i det selektiva amplifieringssteget, där E-primern färginmärkts med
FAM. Primerkombinationen vi valde hade ACG som selektiva nukleotider på Eprimern (5’-GACTGCGTACCAATTCNNN-3’) och CTT som selektiva
nukleotider på M-primern (5’-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3’). (Schmidt and
Jensen 2000).
Resultat
1. Insamling av material från engelska populationer av spädlosta. Endast en
av mina kontakter hade möjlighet att skicka material och han skickade frön och
senare också nyinsamlat material från West Cornwall. Lokalen är enligt
insamlaren ganska liten, men har varit beständig i mer än 20 år. Analyserna nedan
är därför baserade på material från en lokal i England och en i Sverige (Tjörn).
Fröna måste vara väl mogna vid insamlandet för att vara grobara. En av de tre
insamlingarna från West Cornwall var insamlad för tidigt och grodde därför inte,
detsamma gällde insamlingarna från Tjörn ett år.
Den aktuella utbredningen av mer stabila populationer verkar nu alltså vara West
Cornwall och Derbyshire (i avtagande). På andra platser kan spädlostan dyka upp
mer tillfälligt. Platser där arten rapporterats nyligen och svar från lokala Plant
Recorders redovisas i bilaga 4.
2. Kromosomtalsbestämning av färskt Tjörnmaterial. Kromosomtalet hos den
svenska populationen av spädlosta stämmer inte överens med det hos de engelska
populationerna som räknats (2n=14), utan har liksom råglosta (B. secalinus) och
flera andra arter 2n=28.
Kromosomerna från en rotspetscell, 2n=28 (Foto: Anne Krag Brysting).
3. Resultat av sekvensering och fylogenetisk analys (släktskapsanalys) av ITS
och trnL-intronet.
De två generna ger något olika resultat vilket delvis beror på att trnL inte ger lika
hög upplösning i trädstrukturen som ITS gör (trnL-intronet är mindre en variabel
region än ITS). En annan orsak är att samplingen (urvalet av arter) är lämpligare
gjort i ITS för denna frågeställning än vad den är för trnL. I trnL saknas de arter
som är närmast besläktade med spädlosta, men det är inte säkert att det skulle ha
gjort någon större skillnad om de hade varit med i analysen. Eftersom de är så
pass nära släkt så kanske det inte hade blivit någon upplösning i den grenen ändå.
I ITS (610 baspar) skiljer det 25 baspar (varav en insertion och en deletion)
mellan de engelska och svenska populationerna av spädlosta, 30 baspar mellan
engelsk spädlosta och svensk råglosta, 3 baspar mellan svensk spädlosta och
råglosta. I trnL (645 baspar) är svensk spädlosta och råglosta identiska. Dessa
skiljer sig från engelsk spädlosta (den egentliga spädlostan) i två insertioner (en
på 6 baspar och en på 5 baspar) och en deletion (3 baspar lång). Totalt skiljer
alltså engelska spädlosta sig från svensk råg- och spädlosta i 14 baspar.
Figur 3. Släktskapsträd från analysen av trnL som
visar att Tjönpopulationerna är närmare släkt med
råglosta än med de engelska populationerna av
spädlosta. Dock gör den ”kam-lika” strukturen i
basen av den gröna grenen att man inte kan säga
något om hur grenarna inom kammen är besläktade
med varandra. Grenen är oupplöst.
De fylogenetiska analyserna ger ett resultat som speglar de kvantitativa resultaten
ovan. Trädet från analysen av trnL (figur 3; bilaga 5) visar att svenska råg- och
spädlosta grupperar sig tillsammans medan engelska spädlostan hör hemma i
samma klad (en gren i trädet) men med en oklar placering inom kladen i
förhållande till de svenska arterna (fler grenar än två vid basen av en gren visar att
analysen inte kunnat lösa upp trädet fullständigt).
Trädet från analysen av ITS (bilaga 6) med samma arturval som för trnL-analysen
ger en liknande men aningens annorlunda bild. Råglosta och svensk spädlosta
bildar inte en självklar grupp (grenen oupplöst vid basen) och de engelska
spädlostorna kommer ut två grenar tidigare i trädet vilket visar på ett större
avstånd mellan dem och de svenska arterna. En analys av ITS med tätare arturval
inom den aktuella gruppen ger ett träd (figur 4; bilaga 7) som visar i princip
samma som det förra men med ett eventuellt större avstånd mellan svensk
spädlosta och råglosta. Grenar som leder farm till den svenska spädlostan är dock
oupplöst vilket innebär att den svenska spädlostan skulle kunna fästa var som
helst inom klad A.
Figur 4. Resultat från släktskapsanalys av ITS (Internal Transcribed Spacer) där man tydligt ser ett
avstånd mellan engelsk spädlosta (Bromus pseudosecalinus Eng) och de svenska populationerna
(Bromus pseudosecalinus Tjörn) samt råglosta från Gotland och Uppsala botaniska trädgård.
4. Resultat av AFLP-analyserna. Dessa analyser är bäst på att förklara genetiska
variationer mellan nära besläktade individer och man kan dra följande slutsatser:
De tre svärmarna är väl avgränsade från varandra (signifikant skilda från
varandra, figur 5; bilaga 8). I analysen i bilaga 8 har man definierat de grupper
som ska särskiljas för att kunna avgöra om de är signifikant skilda från varandra
eller inte. Inga sådana ”constraints” finns i analysen i bilaga 10, där man finner
samma resultat (de är väl skilda från varandra). I bilaga nr 10 framgår liksom i
ITS-analysen att svensk spädlosta är närmare släkt med råglosta än vad de båda är
med engelsk spädlosta. Analysen i bilaga 9 säger oss att de två populationerna på
Tjörn inte är signifikant skilda från varandra.
Figur 5. Resultat från en av AFLP-analyserna. Bromus secalinus=råglosta.
Slutsats
Slutsatserna jag anser att man kan dra utifrån denna studie är att de svenska
populationerna av ”spädlosta” är närmare släkt med råglosta och några andra
Bromus-arter än med den faktiska spädlostan från England och därför inte kan
kallas spädlosta. De har heller inte samma kromosomtal som de engelska
populationerna av spädlosta. De är dock genetiskt skilda från råglosta vilket visar
sig både i ITS-analysen och analyser med AFLP, kanske tillräckligt för att man
ska beskriva en ny art (?; grundlig morfologisk underökning av den gruppen av
Bromus behövs i så fall), och i vart fall kanske tillräckligt för att de ska anses
värda att bevara ur ett genetiskt perspektiv som en del av den genetiska
variationen. Den fylogenetiska analysen av ITS kan egentligen inte placera
”Tjörnlostan” som närmaste släkting till någon av råglosta, brinklosta, renlosta, B.
intermedius och gruppen där kvarnlosta ingår (B. japonicus m fl; klad B bilaga 7).
Skillnaderna i AFLP-analysen och den fylogenetiska analysen beror på att dessa
två metoder räknar på helt olika sätt. AFLP jämför likheter mellan DNAfragmenten rakt av medan den fylogenetiska analysen räknar ut sannolikheten för
släktskap, inte enbart likhet mellan DNA-sekvenser. För att få en tydligare bild av
”Tjörnlostans” släktskap med de överiga lostorna behövs en mer ingående DNAstudie av lostorna (släktet Bromus) genom en fylogenetisk analys av fler arter med
några lämpliga DNA-regioner.
Referenser
Astholm, F. 2005. Åtgärdsprogram för bevarande av spädlosta (Bromus
pseudosecalinus). Naturvårdsverket. Rapport 5471.
Bensch, S. et al. 2002. Amplified fragment length polymorphism analysis
identifies hybrids between two subspecies of warblers./ Mol. Ecol. 11: 473–481.
Långström, E. & Oxelman, B. 2003. Phylogeny of Echiochilon (Echiochileae,
Boraginaceae) based on ITS sequences and morphology. Taxon 52: 725–735.
Müller, K. 2005. SeqState - primer design and sequence statistics for
phylogenetic DNA data sets. Applied Bioinformatics 4: 65-69.
Oxelman, B., Ahlgren, B. & Thulin, M. 2002. Circumscription and phylogenetic
relationships of Gymnocarpos (Caryophyllaceae-Paronychioideae). Edinburgh J.
Bot. 59: 221–237.
Oxelman, B. Kornhall, P. Olmstead, R.C. & Bremer, B. 2005. Further
disintegration of Scrophulariaceae. TAXON 54 (2): 411-425.
Oxelman, B. & Lidén, M. 1995. Generic boundaries in the tribe Sileneae
(Caryophyllaceae) as inferred from nuclear rDNA sequences. Taxon 44: 525–542.
Schmidt, K. & Jensen, K. 2000. Genetic structure and AFLP variation of
remnant populations in the rare plant Pedicularis palustris (Scrophulariaceae) and
its relation to population size and reproductive components. / Am. J. Bot. 87: 678–
689.
Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G. & Bouvet, J. 1991 Universal primers for
amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol.
17, 1105–1109.
Vos, P. et al. 1995. AFLP-a new technique for DNA-fingerprinting./ Nucleic
Acids Res. 23: 4407–4414.
White, T. J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. 1990. Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315–322 in:
Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J. & White, T. J. (eds.), PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications. Academic Press, San Diego.
Yoon, C.-S., Glawe, D. A. & Shaw, P. D. 1991. A method for rapid small-scale
preparation of fungal DNA. Mycologia 83: 835–838.
Bilaga 4.
Platser där arten rapporterats nyligen och svar från lokala Plant Recorders:
• Douglas McKean, Herbariet i Edinburgh (där Philip Morgans Smith † som
beskrev arten arbetade) – tips på litteratur och kontakt m Tom Cope i Kew.
• Michael Fay, Head of Conservation, Jodrell Laboratory, Kew – tipsade om
Tom Cope och Ian Taylor
• Ian Taylor, Conservation officer and Botanist ii Cumbria – Gav mig sex namn
att jobba vidare med i olika distrikt där arten skulle kunna finnas. Talade också
om att de också är intresserade av hur man skall behandla arten. De ser den som
en inkomling med vissa reservationer.
• Tom Cope, grässpecialist i Kew-herbariet, London – Talade om detaljer som
talar både för och emot att spädlostan skulle vara en egen art.
• Ben le Bas, Derbyshire – kontaktades via Ian Taylor men hade inget att
tillföra.
• Simon Leach, Cornwall – kontaktades via Ian Taylor men hade inget att
tillföra.
• Andy Jones, Wales – kontaktades via Ian Taylor men hade inget att tillföra.
• Mark Wright, Northern Ireland – Talade om att den inte finns där idag. Tror
att den som finns med som en markering på kartan är felaktigt bestämd.
• Adele Smith, assistant curator, Herbariet i Edinburgh – lokal för deras enda
kollekt av arten (Worcestershire – har inte setts efter 1988)..
• Charlotte Maunder, Cornwall/Devon – tipsade om Martin Summers.
• Martin Summers, Cornwall/Devon – kunde inte hjälpa mig.
• Fatima Sales, arbetade med PM Smith – har flyttat utomlands och gick ej att
få tag på.
• David Slade, Lanarkshire/Breckonshire – Tipsade om Mike Porter som borde
känna till ifall den finns i Breckonshire.
• Mike Porter, Breckonshire – Fick kontakt med honom men han kunde inte
hjälpa till.
• Andrew King, Breckonshire – bekräftade att arten inte setts på de senaste 20
åren i Breckonshire.
• Scott Riddell, Biodiversity officer, South Lanarkshire – tipsade om fyra
kontakter nedan, jag jobbade vidare med negativt resultat.
• Jonathan Willet, North Lanarkshire – arten finns ej där.
• Keith Watson, South Lanarkshire – arten finns ej där.
• John Douglass, Lanarkshire – Hade kontaktat Peter Mcpherson (Plant
Recorder for Lanarkshire) som bekräftade att arten inte finns i Lanarkshire.
• Pamela Tompsett, Cornwall – rekommenderade kontakt med Ian Bennallick
(kunde ej hjälpa mig) och Keith Spurgin.
• Keith Spurgin, West Cornwall – min kontakt som jag har haft mer
kommunikation med. Han skickade mig frön från sin lokal 2004 och torkat
material som inkluderade frön 2005. De senare skickade han också till Laurie
(Lawrence) Spalton som är Bromus-expert (lyckades aldrig själv få kontakt med
honom) för bekräftelse att materialet verkligen var spädlosta. Detta bekräftades av
Laurie.
• Nick Moyes, Derbyshire – Hjälpsam och kunde se i rullorna att de hade
registrerat ett par lokaler för spädlosta i Derbyshire fram till 2002.
Rekommenderade kontakt med John Hodgson och Rebekah Newman.
• Rebekah Newman, Derbyshire – ville jag skulle vända mig till John Hodgson.
• John Hodgson, Sheffield University – Fick besked från honom om att
vegetationen har ändrats mycket i området där de brukade hitta spädlosta så den
är mkt svår att hitta numer. Han var också oroad över artens osäkra status.
Bilaga 5.
Bilaga 6. Bromus ITS
Bilaga 7. ITS utökad sampling.
Bilaga 8.
Signifikant skillnad mellan populationerna:
Permutation test for capscale under direct model
Model: capscale(formula = distbs ~ Pop, data = Bsdat)
Df
Var
F N.Perm Pr(>F)
Model
4 16.232 3.1527 200.000 < 0.005 ***
Residual 18 23.168
--Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.'
0.1 ' ' 1
Bilaga 9.
Ingen signifikant skillnad mellan Tjörnpopulationerna
Permutation test for capscale under direct model
Model: capscale(formula = distbss ~ Pop, data =
Bsdatsve)
Df
Var
F N.Perm Pr(>F)
Model
1
0.809 1.1881 100.000
0.25
Residual 12
8.169
Bilaga 10.
Hierarkisk klustring, Wards metod
Eng=engelsk spädlosta
B=råglosta
L & T=spädlosta från Tjörn
