Ätbara vacciner
Sören Andersson
Överläkare, docent, verksamhetschef
Laboratoriemedicin
Universitetssjukhuset, Örebro
& Örebro universitet
Arabidopsis thaliana (backtrav)
2013-08-28
1
Ätbara vacciner
(Vaccinproduktion i transgena växter)
Sören Andersson
Överläkare, docent, verksamhetschef
Laboratoriemedicin
Universitetssjukhuset, Örebro
& Örebro universitet
Arabidopsis thaliana (backtrav)
2013-08-28
2
HIV-positiv morot!
2013-08-28
3
HIV-positiv morot!
(90 ng HIV-1 p24 protein per gram färsk
växt)
2013-08-28
4
[IAVI = International AIDS Vaccine Initiative, 2008]
2013-08-28
5
Många infektionssjukdomar tar
sig in i kroppen via slemhinnor:
- luftvägar
- mag-tarmkanalen
- könsorganen
Total yta 400 m2 !
2013-08-28
6
MALT = Mucosa-associated lymphoid
tissue
GALT = Gut-associated…
BALT = Bronchus-…
NALT = Nasal-…
2013-08-28
Lycke N. 12, 592-605 (August 2012)
7
The gut-associated lymphoid tissue (GALT) contains
60-70% of the total lymphoid system in the body
2013-08-28
8
Hur uppstår immunbristen vid
HIV-infektion?
• CD4+/CCR5+ T-hjälparceller (minnes-T-celler) infekteras – massiv
replikation i tarmslemhinnan
• Infekterade celler dör av
– Virusproduktion (producerar virus och lyseras)
– Immunsvar riktat mot celler med virus
– Apoptos (programmerad celldöd = försvarsmekanism)
• Konstant immunaktivering
– Immunsystemet kroniskt infekterat – konstant aktivt – kontinuerlig
virusreplikation (produktion)
– Hyperimmunglobulinemi, proinflammatoriska cytokiner, ökad
cellomsättning
– Th17+/CD4+ T-hjälparceller infekteras, dör, har betydelse för:
– Slemhinnebarriären bryts, bakterier mm svämmar ut i vävnader & driver på
inflammationen
– Immunsystemet utmattas (immune exhaustion)
2013-08-28
För sammanfattn se t ex Lackner et al, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine
9 2012
Slemhinne-vaccination
• Immunisera (vaccinera) över slemhinnor där
många infektioner tar sig in (t ex sexuellt
överförbara infektioner, HIV)
• > 60% av lymfoid vävnad finns i magtarmkanalen
• Ger även systemiskt skydd
• Injektioner ej nödvändiga (dvs kan slippa
kylkedja och steril utrustning)
2013-08-28
10
Orala vacciner fungerar
• Polio
• Kolera + ETEC (Dukoral)
• Rabies (vilda djur)
Intranasala vacciner fungerar
• Influensa
• Expermental systems
2013-08-28
11
Idealiskt vaccin
Existerande vaccin
• En dos – livslångt skydd
• Kombinerat
• Inga bieffekter
• Billigt
• Enkelt att ta (ge)
• Lång hållbarhet, enkel
distribution
• Flera doser, månader – år
• Enstaka sjd vanligen
• Lokala/generella bieff.
• Injektioner,
sjukvårdspersonal
• Kylkedja, steril förpackning
och utrustning
2013-08-28
12
På väg till ”outreach clinic”, Tanzania, 2005
2013-08-28
13
Potentiella fördelar med ett
växtproducerat vaccin
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
2013-08-28
Storskalig kostnadseffektiv produktion
Produktion & lagring nära användare
Minimala krav på ytterligare bearbetning
Värmestabila (ingen kylkedja)
Minskad risk för kontamination
Proteiner skyddas med hjälp av ’bioencapsulation’
Systemisk och slemhinne-immunitet
Upprepade vaccinationer
Eukaryot system
Många proteiner i samma växt
14
Mars 2013
Växtvacciner i veterinärmedicin
• Regulatoriska fördelar
• Stora besättningar – förenklad administration
• Kan ev producera i målväxten direkt för
konsumtion
• Kan utvärdera i aktuellt djurslag direkt
• Ekonomiskt intresse & potential
2013-08-28
16
Biotechnological applications of
transgenic plant techniques
Enzyme production for detergents
Agriculture (e.g. insect resistant maize and cotton)
”Plantibodies”
2013-08-28
17
2013-08-28
18
Molecular farming och vaccinforskning
vid Örebro universitet – modellen
• Produktionssystem för rekombinanta
proteiner
• Produktion och administration av ätbara
orala och nasala vacciner
• Verktyg för att studera slemhinneimmunitet
2013-08-28
19
Arabidopsis thaliana
(backtrav)
Växtforskarnas
“labråtta”
2013-08-28
20
Arabidopsis tar lite plats att odla
Självkorsare
Varje planta producerar massor av fröskidor
som innehåller 30-50 frön
Frön kan långtidsförvaras i -70ºC
Kort livscykel (c:a 6 veckor från frö till frö)
2013-08-28
21
Transformation of plants
Agrobacterium tumefaciens
2013-08-28
22
Agrobacteria
cause “crown
gall”.
2013-08-28
23
2013-08-28
24
Stable transformation and two non-toxic plant systems
T-DNA
Floral
dip
Arabidopsis
Plant
expression
vector
(pGreen0229)
Co-cultivation
Carrot
2013-08-28
25
Agrobacterium transfer DNA to the plant genome
The DNA is
integrated,
expressed and
“transforms” the plant
cells.
This DNA can be exchanged for any other
DNA
The integration is not sequence specific, can occur in any chromosome
2013-08-28
26
Växthormoner styr celldelning
och differentiering
auxin
Auxin och cytokinin
stimulerar både rot
och skottutvecklingen
cytokinin
2013-08-28
auxin +
cytokinin
27
Morot som vaccin?
•
•
•
•
•
Accepteras över hela världen
Kan ätas rå
Låg produktionskostnad
Robust (lagring och transport)
Tvåårig (liten risk för okontrollerad
spridning)
• Human och veterinärmedicin
2013-08-28
I samarbete med Prof Peter Engström
& Ass Prof Anita Wallin,
Evolutionsbiologiskt centrum, Uppsala
28
universitet
Prototype vaccines produced
in transgenic plants (humans)
• E. coli enterotoxin (LT-B) – potatoe (Nat
Med 1998;4:607-9)
•
•
•
•
HBsAg – lettuce (Adv Exp Med Biol 2001;495:299-303)
Norwalk virus – potatoe (J Inf Dis 200;182:302-5)
Rabies virus – spinach (Vaccine 2002;20:3155-64)
HBsAg – potatoe (Proc Natl Acad Sci 2005;102:3378-82)
2013-08-28
29
Transgen potatis producerande delar av hepatit B virus (HBsAg) som
bildar pseudovirioner i vakuoler i cytoplasman
2013-08-28
30
Immunogenicity in humans of an edible vaccine for
hepatitis B
Thanavala , et al. PNAS 2005;102:3378-82
• Tidigare hepatit B - vaccinerade (fas I studie)
• Upprepad vaccination med 100 g rå transgen
potatis x 2 or 3 (d 0, 14, 28)
• Varje dos ~0.8 mg HBsAg
• 10/16 (3 doser) och 9/17 (2 doser) fick
signifikant immunsvar
• 0/9 placebo potatis
2013-08-28
31
Hepatit B vaccin producerat i växter?
•Globala behovet för
barnvaccinationsprogram – 200 acres
(tunnland, ½ hektar)
•Kinas totala behov – 40 acres
2013-08-28
32
Outline of the project
2013-08-28
33
HIV-1 subtyp C, p24
(capsidprotein)
2013-08-28
35
2013-08-28
36
Accumulation of p24 protein
p24
S1
L1
R1
SWT LWT RWT p24
S, stem
L, leaf
R, root
2013-08-28
37
Detection of HIV p24 antigen
(Abbott Architect HIV combo)
2013-08-28
Specimen
S/CO S/CO after
anti-p24 Mab
Pos contr
3.24
ND
Neg contr
0.09
ND
WT
0.25
ND
Plant (1)
61.77 0.37
Plant (2)
6.11
Plant (3)
23.95 3.75
1.63
38
Feeding mice transgenic plants containing 17 – 366 ng HIV-1 p24
protein/g fresh weight
2013-08-28
39
Systemic (serum) anti-p24 IgG-response in mice after
feeding transgenic plants + boost
2013-08-28
40
Transgen morot har högre primingeffekt än vildtyp
2013-08-28
41
Arabidopsis
Carrot
2013-08-28
Line
Arabidopsis(pGreen0229/p24_SEKDEL)
1
2
3
4
5
6
7
9
ng p24/g fresh weight
Genetic inserts
193
67
8
233
366
43
138
199
1
2 or 3
3
2 or 3
2
1
2 or 3
1
Carrot (pGreen0229/p24_SEKDEL)
21
26
60
49
48
90
n.d.
n.d.
2
Arabidopsis (pGreen0229/p24)
1
2
7
10
34
36
16
17
4
3
2
1
42
Högdosväxt ger lägre immunsvar än lågdos
2013-08-28
43
Oral tolerance?
2013-08-28
44
Oral tolerance?
• Not one entity
• Immune regulation by several pathways
• Can be modulated (e.g. adjuvants)
• Not always the result of eating specific
antigens (prototype oral vaccines work)
• Further studies needed
–
–
–
–
2013-08-28
Doses
Frequency
Antigen preparations
Adjuvants
45
Induktion av oral tolerans mot kollagen skyddar mot artrit i
musmodell
Transgen
växt x 4
Lycke, Hansson, Strid, Andersson, Göteborgs och Örebro universitet,
ej publicerat
IL-6
HIV vaccines
Scientific challenges
Virus changes rapidly – new variants appear
continuously and ”cheats” the immune defence
Virus genome integrates in human genome forever
Target cells for infection = cells in the immune
system
Correlation animal model vs humans?
Lack of good laboratory parameters for protection
2013-08-28
48
HIV VACCINE CLINICAL TRIALS
Phase I (~25)
Phase II (4)
Phase III (2)
Haiti
T&T
Conduct/ed Clinical trials
Planned
> 50 intressanta HIV-”vaccinkandidater” prövade i djurmodell
The Thai Trial
Inledande vaccinationer (priming)
Fågelpoxvirus (Canary pox) med tre olika antigen
(protein) från HIV-1 (0, 1, 3, 6 mån). Ej adjuvant.
Uppföljande vaccination (boost)
Recombinant höljeprotein (env) (3 & 6 mån).
Alum-adjuvant.
2013-08-28
50
The Thai Trial
Protective efficacy – 31.2% (1.1 – 52.1%, p=0.039)
51/8197 vaccinees infected
74/8198 placebo infected
No effect on viral load
2013-08-28
51
STEP studien
avbröts i September 2007
efter interim analys
Vaccinerade volontärer med Ad5 antikroppar löpte högre risk att få HIV än placebo
gruppen
Charlotta Nilsson 130410
Lu W, …, Andrieu
J-M. Cell Reports
2012;2:1736-46.
2013-08-28
53
HIV-vaccin - oral immunisering
Lu et al. Cell Reports 2012:2, 1736-46
Lactobacillus plantarum + avdödat SIV gav totalt skydd i
15/16 rektalt exponerade apor. Immunsvar uteblev, men
man fann ett ökat antal HLA-E beroende SIV-specifika
CD8+ T celler (Treg).
Charlotta Nilsson 130410
CD8+ Tregmedierad oral
tolerans
Arabidopsis
Antigen
Gene
mRNA Protein
p17
*
p17_SEKDEL
*
*
Tat/Nef
*
*
p24
*
*
Feeding
p24
*
*
p17
Tat/Nef
Crossing the
transgenic plants
p24;p17;Tat/Nef
Nef
How vaccines are developed
Basic research
Preclinical development
Laboratory
in vitro & animal studies
Discovery
Vaccine concept
Clinical trials
Phase I/II
Phase III
Human research
Safety,
Efficacy
Immunogenicity
Experiments in primates
Human trials
Exploration
1
2
3
Safety, immunogenicity
4
5
6
Likelihood of protection
in humans
1: Recombinant Protein – 2: Synthetic Peptides – 3: Naked DNA
vectors- 5: Whole inactivated virus – 6: Live attenuated virus
2013-08-28
4. Live-recombinant
57
Molecular farming och vaccinforskning vid
Örebro universitet - projekten
•
•
•
•
•
HIV-1 (p24, p17, tat, nef)
Klamydia (Major Outer Membrane Protein, MOMP)
Rift Valley Fever (boskapsvirus)
Autoimmun artrit (samarb N. Lycke, Göteborg)
Helicobacter pylori (ton B; magsårsbakterier, samarb L.
Engstrand, KI)
•
•
•
•
•
•
•
Hemofilus influensae (samarb K. Riesbeck, Malmö)
Taenia solium (cysticercos, binnikemask, gris)
TBE (fästingburen hjärnhinneinflammation)
Adjuvants (immunstimulerande ämnen)
Fiskvirus
Produktionsmetoder
Immunologiska mekanismer (Göteborgs univ.)
Frystorkad
växtsubstans i
gelatinkapslar
2013-08-28
59
Bonden Elford’s ängar i Dorset, England,
där de första ”moderna”
smittkoppsvaccinationerna utfördes i
slutet av 1700-talet
2013-08-28
60
Acknowledgements
Örebro University, Sweden
Prof Åke Strid
Ingrid Lind, PhD
Irina Kalbina, PhD
Helena Sävenstrand, PhD
Nikolai Scherbak, PhD
Örebro University Hospital,
Sweden
Docent Sören Andersson
Sara Thulin-Hedberg, PhD
Kerstin Malm
Swedish Institute for
Communicable Disease Control
Andreas Bråve, PhD
David Hallengärd
Marianne Diurson
Uppsala University,
Sweden
Prof Peter Engström
Anita Wallin, PhD
Prof Anders Kvarnheden
Naeem Sattar
Göteborg University, Sweden
Prof Nils Lycke
Ellen Marks, PhD
Lotta Hansson, PhD student
Darmstadt University,
TU, Germany
Prof Heribert Warzecha
Christine Seither
Nina Lagerqvist
Linköpings University,
Sweden
Kerstin Falk
Prof Jorma Hinkula
2013-08-28
The work was funded by:
Örebro University’s Faculty for
Science and Technology
Sparbanksstiftelsen Nya
Nyckelfonden
Örebro County Council
Stiftelsen Clas Groschinsky
The Swedish International
Development Agency’s Dept of
Research Cooperation for
Financial Support
Swedish Institute / DAAD
Stiftelsen Lars Hiertas Minne
Helge Ax:son Johnsons Stiftelse
61
Tack!
2013-08-28
62
