PLASMID-

PLASMIDPREPARATION
(”Plasmidlab”)
Laborationshandledning
Läkarprogrammet T1
Apotekarprogrammet T2
Biovetenskapliga läkemedelsprogrammet T2
Tandläkarprogrammet T2
Rev. 2004-02-17
INTRODUKTION
Dagens genteknologi fick sitt genombrott på 1970-talet och har kommit att
revolutionera den biomedicinska forskningen. Genom att utnyttja bakteriella system
har man lärt sig att ”klona” gener; man kan numera isolera masskopierade främmande
DNA-sekvenser ur bakteriekulturer. Kloningsteknologin har redan inneburit stora
praktiska medicinska framsteg. Ett av de främsta exemplen är humant insulin
producerat av bakterier. Två slags bakteriella ”verktyg” är avgörande vid genkloning:
plasmider och restriktionsenzymer.
Plasmider
Plasmider förekommer naturligt och kan ses som extra ”minikromosomer” i bakterier.
Ofta innehåller ”vilda” plasmider gener för antibiotikaresistens, vilket utnyttjas i de
plasmidvektorer, modifierade plasmider, som används som DNA-bärare vid kloning.
Främmande DNA sätts då in i plasmidvektorn som sedan förs in i (”transformation”)
och odlas i bakterier. Antibiotikaresistensen fungerar som selektionsmarkör: Genom
att den gen som ska klonas sätts in i en vektor som också uttrycker t ex ampicillinresistens kan man vara säker på att endast de bakterier som tagit upp plasmidvektorer
överlever då de odlas med ampicillin (”negativ selektion”, icke transformerade celler
väljs bort).
Plasmidvektorn pTZ19R innehåller betalaktamasgenen, ”bla”, som ger resistens mot ampicillin.
Vektorn är en ”phagemid” som kan förökas i bakterier som plasmid eller bakteriofag (virus)
med replikationsstart från ”rep(pMB1)”- respektive ”f1(IG)”-sekvenserna. Främmande DNA
kan ligeras i polylinkern ”MCS” (Multiple Cloning Site) som infogats i lacZ-genen, vilket
möjliggör ”blue/white screening” (se text). Plasmidkartan visar också unika restriktionssites
utanför polylinkern.
2
En av de första kommersiella plasmidvektorerna var pBR322 som innehåller gener för
resistens mot ampicillin och tetracyklin. I denna laboration ska vi arbeta med vektorn
pTZ19R som utvecklats ur pBR322 men endast bär ampicillinresistensgenen. I likhet
med de flesta plasmidvektorer har pTZ19R en ”polylinker” där främmande DNA som
ska klonas kan ligeras in. Polylinkern består av en uppsättning unika restriktionssites,
igenkänningssekvenser för olika restriktionsenzymer. ”Unik” avser här att sekvensen
bara finns på ett ställe i plasmiden.
Polylinkersekvensen i pTZ19R. I en av de plasmider som används vid laborationen har DNA
klonats i BamHI-sitet.
Restriktionsenzymer
Vilda bakterier uttrycker restriktionsenzymer, vilkas funktion är att bryta ner
främmande DNA, t ex virus, som tagit sig in i cellen. Restriktionsenzymerna är
proteiner som känner igen och klyver båda DNA-strängarna vid specifika sekvenser.
Bakteriens eget DNA kan skyddas antingen genom att restriktionsenzymernas
igenkänningssekvenser maskeras kemiskt, genom metylering, eller genom att igenkänningssekvenser helt enkelt saknas i bakteriens arvsmassa. Laboratoriestammar av
kolibakterier (Escherichia coli) som används vid genkloning saknar egna restriktionsenzymer så att de inte kan bryta ner det främmande DNA man vill klona.
Vid genkloning öppnas en plasmidvektor i polylinkern med hjälp av restriktionsenzym som väljs så att vektorns ändar blir förenliga med ändarna på det DNAfragment man vill klona. Vissa enzymer klyver så att DNA-ändarna blir jämna (”blunt
ends”) medan andra lämnar ett överhäng av enkelsträngat DNA (”sticky ends”).
Om man använder två restriktionsenzymer som ger olika DNA-ändar efter klyvning
kan man också bestämma åt vilket håll DNA-fragmentet ska sitta i vektorn (”forced
cloning”). Vektor och fragment fogas samman kovalent med hjälp av ett annat
enzym, DNA ligas, varefter det ligerade DNA:t kan användas för transformation av
bakterier. Det är enklare att ligera ”sticky ends” eftersom de fäster ihop genom
basparning (vätebindningar) redan innan man tillsätter DNA-ligas.
SELEKTION VID PLASMIDKLONING
Då främmande DNA ligeras med plasmidvektorer bildas inte bara den önskade
produkten utan också oönskade biprodukter, t ex återförslutna tomma vektorer och
linjära multimerer. Vid transformationen tas alla slags ligeringsprodukter upp av
bakterier men bara cirkulariserade plasmider kan replikeras och uttrycka sin
3
antibiotikaresistens. Bakterier som bara tagit upp lösa DNA-fragment kommer därför
inte att överleva då man tillsätter antibiotika i odlingsmediet (”negativ selektion”).
-GATAAGAGCTCGGTACCCGGGATCCTGACT-CTATTCTCGAGCCATGGGCCCTAGGACTGA-
polylinker
SacI
pTZ19R
BamHI
restriktionsklyvning
-GATAAGAGCT
-CTATTC
GATCCTGACTGACTGACGGTACCCGG
TCGAGCCATGGGCCCTAG
-GATAAGAGCT
-CTATTC
GATCCTGACTGACTGACGG-gensekvens->-CGG
TCGAGCC--------------GCCCTAG
DNA fragment med
kompatibla ändar
T4 DNA ligas
ligering
SacI
-GATAAGAGCTCGG-gensekvens->-CGGGATCCTGACT-CTATTCTCGAGCC--------------GCCCTAGGACTGAInligerad gen
pTZ19R
BamHI
Exempel på ”forced cloning”. Genom att använda två olika
restriktionsenzymer kan man bestämma åt vilket håll ett DNAfragment med förenliga ändar kommer att ligeras med vektorn.
Blue/white-screening
Tack vare antibiotikaresistensen överlever bakterier som tagit upp cirkulära
plasmidvektorer vid odling med antibiotika. Det gäller oavsett om plasmiderna är
rekombinanta (plasmid + främmande DNA) eller tomma (polylinkern återligerad
utan ”insert”). För att hitta de bakteriekolonier som innehåller rekombinanta vektorer
använder man sig ofta av ”blue/white screening” som positiv selektion. Man utnyttjar
då bakterier med ett defekt β-galaktosidas, det enzym som normalt bryter ned laktos
(mjölksocker). Vektorn bär genen lacZ’ som kodar för α-domänen av β-galaktosidas.
Uttrycket av lacZ’ kontrolleras av sekvenser från lac-operonet som sitter uppströms i
4
vektorn. I närvaro av laktos aktiveras genen och den uttryckta proteindomänen ger
värdbakterien ett funktionellt β-galaktosidas. Detta kallas α-komplementering.
I praktiken används inte laktos utan laktosanalogen IPTG (isopropyltiogalaktosid)
som inte kan brytas ned av β -galaktosidas och därför ger en bestående aktivering av
lacZ’. För att man dessutom ska kunna se galaktosidasaktiviteten i bakterierna tillsätts
ytterligare en laktosanalog, X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-α-D-galaktopyranosid)
som bryts ned av β -galaktosidas till ett blått färgämne (5-brom-4-klor-3-indol).
Bakterier som uttrycker aktivt β-galaktosidas kommer därför, i närvaro av X-gal, att
färgas blå.
Metoden gör det möjligt att se vilka bakteriekolonier som innehåller rekombinanta
vektorer eftersom polylinkern, där främmande DNA ligeras i vektorn, sitter i början
av lacZ’-genens kodande sekvens. I rekombinanta vektorer skiljs lacZ’-sekvensen
från sin promoter av det införda främmande DNA:t och kan därför inte längre
uttryckas. Därmed förhindras α –komplementering; bakterier med rekombinanta
plasmider kan inte bryta ner X-gal utan förblir vita. Från tomma vektorer uttrycks
lacZ’ obehindrat, X-gal kan brytas ner och bakteriekolonier färgas blå.
GELELEKTROFORES
Vid gelelektrofores separeras molkyler av olika storlek genom att de olika lätt tar sig
igenom en porös gel i ett elektriskt fält. För elektrofores av DNA brukar man tillverka
en gel av polysackariden agaros som ”smälts” genom uppvärmning i en buffertlösning
och sedan stelnar till en gel då den svalnar. För elektroforesen placeras sedan gelen i
ett bad av samma buffert, som ju leder ström eftersom den är en jonlösning. Bufferten
ska vara lätt basisk så att fosfatryggraden i DNA deprotoneras. Allt DNA som sätts på
gelen kommer då att hållas negativt laddat och vandra genom gelen mot den positiva
polen. För att man ska kunna se hur DNA:t separerats tillsätts också etidiumbromid i
buffertlösningen. Etidiumbromid kilar in sig mellan baserna i DNA och eftersom
ämnet fluorescerar i UV-ljus kommer man att kunna visa var på gelen det finns DNA.
Då man elektroforerar plasmid-DNA är det inte bara storleken i baspar räknat som
avgör hur DNA vandrar i gelen. Bakterier packar sitt DNA, även plasmider, genom
supercoiling, vilket ger en kompakt ”ihopsnodd” struktur. Vid plasmidpreparationen
kommer vanligen en mindre del av plasmiderna att få slumpmässiga mekaniska enkeloch dubbelsträngsbrott. Vid enkelsträngsbrott ”lossnar” supercoilingen då DNAsträngarna vid brottpunkten kan röra sig runt varandra. Man får en ”relaxad” cirkulär
plasmid. Vid dubbelsträngsbrott lineariseras plasmiden, men till skillnad från en
restriktionsklyvning kan brottet sitta var som helst i sekvensen. Relaxat och linjärt
DNA upptar en större volym än supercoilat och kommer därför att röra sig
långsammare vid elektrofores.
5
Elektronmikrografier av mitokondriellt DNA. Överst en
relaxad cirkulär form. Frånvaron av supercoiling kan
ha orsakats av enkelsträngsbrott. Därunder en mer
kompakt, supercoilad form. Bakterier packar sitt DNA,
såväl kromosom som plasmider, på samma sätt.
6
LABORATIONENS UPPLÄGGNING
Ni kommer att få en blandning av två olika plasmider, dels den tomma vektorn
pTZ19R och dels samma vektor med ett klonat 1500 bp DNA-fragment i polylinkerns
BamHI-site. (Blandningen kan tänkas motsvara resultatet av en ligeringsreaktion.)
Plasmidmixen används för att transformera kolibakterier, som sedan får växa på
agarplattor innehållande ampicillin, IPTG och X-gal. Varje grupp ska plocka två blå
och två vita bakteriekolonier för att preparera plasmiderna ur dessa. Prover av
plasmiderna ska sedan klyvas med BamHI och analyseras med agarosgelelektrofores
för att kontrollera vektorns och det klonade fragmentets storlekar.
UTFÖRANDE
Dag 1: Transformering av E.coli med plasmid-DNA.
1. Sätt 100µl tinad cellsuspension till röret med 10µl plasmidblandning. Blanda
försiktigt med hjälp av pipett.
2. Inkubera på is i 25-30 minuter.
3. Värmebehandla cellerna (”heat shock”) på värmeblock, 37°C, i exakt tre
minuter.
4. Kyl cellerna på is i någon minut.
5. Tillsätt 1 ml LB-medium.
6. Märk en LB-agarplatta och sprid ut cellblandningen på den. (Luta plattan åt
olika håll så cellerna sprids så bra som möjligt.)
7. Plattan inkuberas i värmeskåp, 37°C, över natt.
Dag 2: Plockning av bakteriekolonier och odling av bakterier.
1. Hämta agarplattan från dag 1 samt fyra 50 ml Falconrör med 5ml LB-medium
(ampicillin, 100 µg/ml).
2. Plocka två vita och två blå kolonier från agarplattan. Använd tandpetare som
hålls med en steriliserad pincett. (Det räcker att nudda kolonin med
tandpetaren.) Släpp ner tandpetarna i varsitt Falconrör och skruva åt locken
ordentligt. Märk rören.
3. Rören inkuberas i skak, 37°C, över natt.
7
Dag 3: Plasmidpreparation, restriktionsklyvning och agarosgelelektrofores.
PLASMIDPREPARATION
1. Skörda buljongkulturerna genom att pipettera över 1,5 ml från varje Falconrör
till varsitt mikrofugrör (”Eppendorfrör”). Centrifugera fem minuter i
bordscentrifug. OBS! Balans i centrifugen!
2. Tag av supernatanterna och fyll upp mikrofugrören med mer bakteriebuljong
för att få en större bakteriepellet. Centrifugera igen.
3. Tag av supernatanterna. Fyll på mer bakterier om det behövs. (Fråga
assistent!)
4. Resuspendera bakteriepelletarna i 250 µl buffert G1. Suspensionen ska vara
homogen (inga klumpar kvar).
5. Lysera cellerna genom att tillsätta 250 µl av lösning G2. Blanda noga, men
försiktigt, genom att vända mikrofugrören flera gånger. Låt rören stå fem
minuter.
6. Neutralisera proverna genom att tillsätta 350µl av lösning G3. Blanda åter
noga men försiktigt. (Proverna ska nu ”skära sig”.) Centrifugera tio minuter.
7. Pipettera över supernatanterna till spinnkolonnerna. Centrifugera en minut för
att ladda proverna på kolonnerna. Häll bort ”flowthrough:n”.
8. Tvätta kolonnerna med 500 µl av lösning G4. Centrifugera en minut.
9. Häll bort tvättlösningen och centrifugera kolonnerna igen för att få dem helt
torra.
10. Flytta över kolonnerna till nya mikrofugrör. Tillsätt 75 µl dH2O (destillerat
vatten) i varje kolonn. Pipettera direkt mot kolonnens kiselmatrix men undvik
att komma åt det med pipettspetsen. Eluera kolonnerna genom att centrifugera
i två minuter.
Solution G1 (Cell Suspension)
Store at 4°C
50 mM Tris/Cl (pH 8.0); 10 mM EDTA; 100 µg/ml RNase A
Solution G2 (Cell Lysis)
Store at RT
200 mM NaOH; 1% SDS (w/v)
Solution G3 (Neutralization/Binding)
Store at RT
Contains acetate and guanidine hydrochloride
Solution G4 (Wash, reconstituted)
Contains ethanol, NaCl, EDTA, and Tris/HCl
Store at RT
Vi använder ”JETquick
Plasmid Miniprep Spin
Kit” från GENOMED.
Detta är lösningarnas
sammansättning som
tillverkaren deklarerat
dem.
8
RESTRIKTIONSKLYVNING
1. Gör en arbetslösning av restriktionsenzymet BamHI. Blanda först 10 µl ”10X
BamHI-buffert” med 38 µl ddH2O i ett mikrofugrör och tillsätt sedan 2 µl
BamHI-enzym (totalt 50 µl). Enzymet måste förvaras kallt hela tiden.
Blanda arbetslösningen noga och centrifugera ner ev droppar.
2. För över 10 µl av varje plasmidpreparation till nya märkta mikrofugrör och
tillsätt 10µl av BamHI-arbetslösningen till varje rör.
3. Inkubera rören vid 37°C i minst 45 minuter.
4. Blanda oklyvda kontrollprover genom att blanda 10 µl av varje
plasmidpreparation med 2 µl ”6X gel-loading buffer” i märkta mikrofugrör.
5. Sätt 4µl ”6X gel-loading buffer” till de klyvda proverna.
AGAROSGELELEKTROFORES
1.
2.
3.
4.
Väg upp 1 g agaros i en 200 ml E-kolv. Tillsätt 100 ml TAE-buffertlösning.
Smält agarosen i mikrovågsugn. (Kör tills det kokar.)
Låt agarossmältan svalna tills man nästan inte bränner sig på kolven längre .
Tillsätt en droppe etidiumbromidlösning. OBS! Etidiumbromid är
mutagent. Använd handskar. Gäller även vid hantering av gelen!
5. Häll agarosen i gelinsatsen och placera ut kammar för brunnarna.
6. Låt gelen stelna (ca 30 minuter).
7. Ta bort kammarna (försiktigt så inte brunnarna skadas).
8. Vänd gelinsatsen i elektroforesapparaten och häll i TAE-buffert så att det
täcker gelen.
9. Ladda klyvda prover och oklyvda kontrollprover, 10 µl av varje prov. Håll
pipettspetsen rakt ovanför brunnen och låt provet sjunka genom TAEbufferten. Ladda även storleksmarkör i en brunn. Notera i vilken ordning
proverna laddas.
10. Sätt spänningen på 120V och låt elektroforesen gå i 60 minuter.
11. Fotografera gelen under UV-ljus. (Etidiumbromiden interkalerar, ”kilar in
sig”, mellan kvävebaserna i DNA och ger upphov till fluorescens vid UVbelysning.)
9