Vad är ett virus? Jean-Yves Sgro! Virus avviker från alla andra organismer" - Fullständigt egen livsform" Obligatoriska intracellulära parasiter, som har en minimimängd gener vilka omgivs av ett skyddande skal som ger viruset dess infektionsförmåga Virus struktur och förökning" Virus kan inte föröka sig utan levande celler. Utanför värdcellen är viruset en metaboliskt inaktiv partikel. " " Viruspartikeln måste klara sig i två miljöer: både utanför och innanför cellen samt kunna upplösas i en passlig cell. " " Efter att ha trängt in i cellen tar viruset cellen i eget bruk och använder sig av dess metaboliska och syntetiska apparatur med bekostnad av cellens välbefinnande. " " Virus finns i alla livsformer, djur-, växt-, bakterie-, alg-, och svampceller. " Det finns över 10 miljoner viruspartiklar/ml vatten" " Virus består av protein och nukleinsyra, endel har även lipider och kolhydrater. " Maria Söderlund-Venermo, FD, doc." " Haartman-institutet, Virologiska avdelningen" Helsingfors universitet" VIRUS STORLEK" Vad är virus: LWOFFS KRITERIER" Egenskap " " "" Bakterier! Virus! Gen! "+ Riketsia! "± "– "–" "+ "– "+ "+ "+ "+ "– "+ "+ "+ "– "+ "– "+ "+ "– "+ "+ "– "+ "– "– "– "– "+ "+ "– "– "+" "–" "–" "–" "+" "–" "–" "–" Viruspartikelns storlek är endast 15 - 300 nm! [1000nm = 1 µm; 1000µm = 1 mm]" - Virus kan inte ”ses”, man behöver ett elektronmikroskop" " Storlek (> 500nm) " Förökning:" "delning " " "replikation " Ribosomer " " Egen energiproduktion " Egen proteinsynees " Arvsmassa: DNA " " DNA ellerRNA Infektionsduglighet " (Antibiotika känslighet) " Bakterier förökar sig genom celldelning i syntetiskt medium. " Virus förökar sig endast i levande celler: cellen fungerar som fabrik och producerar virusets beståndsdelar på skilda håll i cellen." - först efter detta går virusdelarna samman till nya viruspartiklar. " " Viruspartikeln växer inte i storlek! Bakterien växer" André Lwoff "" Ljusmikroskop elektronmikroskop röntgen NMR Upplösningsförmågan: ögat ljusmikroskop EM 0,1 mm = 100 µm 0,2 µm 0,2 - 2 nm Albumin Polio Influensa Smittkoppor Stafylokock Mänskocell storlek 5nm 28nm 100nm 250nm 1000nm 15 000nm genom (MW) - 2,6 x 106 4 x 106 160 x 106 3000 x 106 10 000 000 x 106 (1902-1994) VIROLOGINS HISTORIA" 1000-talet-> " 1796" "Edward Jenner 1881" "Louis Pasteur 1892" "Dimitri Iwanowsky 1898" "Martinus Beijerinck " " " " " " 1898" 1902" 1908" 1911 " 1916" 1923" 1930-" 1940-" 1949" 1950-" 1952" 1964" 1977 " 1983" 1983" 1986" "Variolation smittkoppor" "Smittkopsvaccin (vaccination)" "Rabies i kaniner" "TMV är mindre än andra sjukdomsalstrare" "Virus = sjukdomsalstrare, virulent" Virus ”hittades”:" Tobakens mosaikvirus (TMV) var mindre än andra sjukdomsalstrare." Kan inte filtreras bort." Nytt slags sjukdomsalstrare => smittande levande vätska "Contagium vivum fluidum”" eller ”smittande giftig vätska” ”Contagium virum fluidum” "Loeffler och Frosch "Mun och klövsjuka smittar likt TMV och förökar sig varje gång" "Walter Reed "Gula febern smittar via myggor, orsakar viremi" "Landsteiner, Popper "Barnförlamning orsakades av ett virus " "Peyton Rous "Första tumörviruset från sarkom, RSV" "Twort, d’Herelle "Bakterievirus hittades (fager)" "Theiler och Smith "Mus och hönsäggs virus isolation" "Wendell Stanley "Kristallisering av TMV:n — modellvirus" "Ernst Ruska et al. "Elektronmikroskopi" "John Enders "Cellodlingar; odling av polio" "Salk / Sabin "Poliovaccin" "Hershey & Chase "Bakteriofags genom är ensamt infektiöst" "Epstein & Barr "Första viruscancern hos människan: EBV, Burkitts lymfom" "Sista smittkoppsfallet. WHO:s program ledde till sjukdomens försvinnande" "Montagnier / Gallo "AIDS orsakande virus (HIV) isolerades" "Karry Mullis "PCR dvs DNA-amplifikation" "Första rekombinations-DNA-vaccinet (Hepatit B) togs i bruk" VIRUS SAMMANSÄTTNING" NUKLEINSYRA "1-30%" - DNA eller RNA" - 1- eller 2-strängad" - lineär eller cirkulär" - enhetlig eller segmenterad" - storlek ~4-400 x 106 d (begränsad " genetisk kapacitet)" PROTEIN "60-80%" - skyddande skal runt genomet " - oftast enbart några sorter" - immunologisk specifitet" - receptor igenkänning" - enzymfunktion (polymeras)" - Kodade av virusgenomet" KOLHYDRATER" LIPIDER "0-20%" - höljets glykoproteiner och lipider" - värdcellens enzymer ansvarar för syntesen - i höljet" - från värdcellen" - sammansättningen följer maturationsstället" - kan variera enligt värdcell" "" 1 VIRUS STRUKTUR (MORFOLOGIA)" VIRUSTERMINOLOGI" EM (1950): "Ytstrukturen är inte jämn utan består av underkomponenter" " Röntgendifraktion (1972): "Viruspartikeln är inte amorfisk" " " "- Består av regelbundet återkommande enheter" " " "- lätt att kristallisera och symmetriska" " " "- forskar redan med < 2 Å noggrannhet" " Kryo-EM + datamaskin-gjord 3D-bildrekonstruktion" Provet fryses snabbt så att inte förstörande iskristaller bildas " Mikroskopering i -160°C." " Virus former: stav, boll, ikosaheder, kula, mask... Kapsid (kapsidi, capsid)" " Strukturell enhet" " Kapsomer" " Nukleinsyra (DNA eller RNA)" " Nukleokapsid (eller RNP)" " Lipid" " Glykoprotein, spike " " Hölje (vaippa, envelope)" " Matrix-protein" " Virion: infektionsdugligt färdigt virus" " Replikation: genomets amplifikation" Transkription: bildning av mRNA" Translation: proteinsyntes" VIRUSSYMMETRI" Cytomegalovirus Paramyxovirus Helikal symmetri" HELIKAL" Proteinenheterna fördelar sig sida vid sida runt nukleinsyrasträngen formande en spiral, där varje strukturell enhet är lika till sin granne = nukleokapsid. Tobakens mosaikvirus fungerar som modellvirus–> Genomet kodar endast ett protein, men väldiga mängder av detta" Hela kapsidens längd är beroende av RNA-strängens längd " Filo: Ebola Endast en symmetriaxel, längs med centralkanalen" Virusets utseende kan ändå vara antingen rund eller långsmal Ortomyxo: Influensa A" Arenavirus TMV Rabies Paramyxo Coronavirus Rhabdo: Vesicular Stomatitis (VSV) Paramyxovirus VIRUSSYMMETRI" Parvovirus kapsid" IKOSAHEDRAL! Genomet är ”löst” inuti skalet (=kapsiden), dvs inte fast i proteinskalet likt de helikala virusen" Konstruktionen bygger på att man kan dela ytan i ett jämnsidigt triangelnät, så att varje triangel motsvaras av tre strukturella proteinenheter (20 x 3), vilka man behöver 60 av. " Parvovirusens kapsid följer T=1 ikosahedral symmetri —> ett virion består av 60 VP2-protein kopior." " Ursprungstrianglarna formar en ikosaheder så att runt vart och ett av de 12 spetsarna bildas en ring av fem enheter. " CPV: Agbandje, Parrish, Rossman Den minsta ikosahedern är T=1 (triangulationsnumret x 60 enheter)" 5-3-2-symmetri: Agbandje, Parrish, Rossman. Semin Virol 6; 1995 MVM: Agbandje-McKenna 2 Ikosahedral symmetri VIRUSSYMMETRI! Papillomvirus Herpesvirus Enterovirus The Eden Project with geodesic domes near St Austell, England. Climatron at the Missouri Botanical Garden, St. Louis, 1960 Fuller’s geodesic system consists of dividing a sphere into equal triangles; Geodesic Dome! A geodesic grid is a technique used to model the surface of a sphere (such as the Earth) with a subdivided polyhedron, usually an icosahedron: The Dymaxion map or Fuller map is a projection of a world map onto the surface of a polyhedron, which can be unfolded and flattened to two dimensions. Rotavirus Adenovirus Parvovirus VIRUS KLASSIFICERING" VIRUSSYMMETRI" Man betraktar kemiska, fysikaliska och biologiska egenskaper:" VIRION: virionets storlek, form, hölje, kapsidens symmetri" " GENOM: DNA/RNA, en/tvåsträngad, lineär/cirkulär, +/- polaritet (ambisens), segmenterad eller segmentens antal, storlek, sekvensen, etc." " PROTEIN: antal sorter, storlek, funktioner, aminosyresekvens" " REPLIKATION: strategi, transkriptionssätt, translationssätt, maturationsställe, effekt på cellen" " FYSIKALISKA: pH-tolerans, kation beroende, värme-, lösnings-, detergent- eller strålningskänslighet" " BIOLOGISKA: serologiska relationer, släktskap, värd- eller vävnadsspektrum, sjukdomsalstringsförmåga (patogenitet)" KOMPLEX " Pox-virus (smittkoppsvirus) är varken helikala eller ikosahedrala, " utan mycket komplexa stora partiklar (250 nm)" - ser ut som tegelstenar" - följer ingen symmetri!" " Finns även virus i andra former, t.ex. citron, droppe eller vinflaska..." RNA Molluscum contagiosum poxvirus Fusellovirus Acidianus bottle-shaped virus (Ampullavirus) Ikosahedral DNA Helikal RNA-VIRUS" Ikosahedral Helikal Okänd DNA-VIRUS" Papillom" Polyom Exempel: " " " " " " Rota " " " " " " IBDV Noro polio Sapo " rino " HAV " entero " " dengue rubella TBEV " sindbis gula febern HCV " " " HIV " HTLV " " " " SARS Ebola Marburg " " " " rabies VSV Hantaan Influensa Puumala Inkoo Uukuniemi " " RSV Lassa" påssjuka mässling" parainfluensa" sendai" hendra" Exemple: "" B19 papillom (egen familj) Boca polyom (egen familj) Parv4 SV40 " AAV BK, JC, " MVM KI, WU, MCV,TSV" CPV" HBV " HSV LCV " " CMV rana" " EBV " " HHV-6, 7, 8" AcMNPV " " " smittkoppor" vaccinia" molluscum contagiosum" 3 BAKTERIOFAG" Stort och litet virus" Bakterie ätare, dvs bakterievirus, dvs bakteriofager, eller fager (phage, faagi)" Anellovirus: TTV: 3,8 kbp" Mimivirus: 1,2 Mega bp Troligtvis har alla bakterier sina egna fager, vars värdspecificitet beror på receptorerna på cellytan." Olika morfologityper (A-F)" Bendinelli et al. Clin Microbiol Rev 14; 2001 T4 fag" T4 fag" Tectiviridae fag" Raoult et al. Science 306; 2004 Enterobacteria virus P2" Mimi: 400nm Circo: 20nm Inovirus, M13" VIRUS FÖRÖKNING I CELLEN" Virophage" = virusets fag! Jättevirusen har sina egna virus som gör dem sjuka Fagen heter Sputnik ~50 nm ikosahedral kapsid ~18 kbp dsDNA cirkulärt genom Innehåller 21 gener, som har homologer med olika organismdomäner (eukaryoter, arkebakterier och bakterier) 1. ADSORPTION (FASTSÄTTNING)" - virus fäster sig vid cellreseptor" 2. PENETRATION" "- virus kommer igenom cellmembranen" Infektiösa partiklar per cell" Infektiösa partiklar" i cellen" Extracellulära" viruspartiklar" 3. NUKLEINSYRESYNTES" "- genomet frigörs och replikerar" " 4. "PROTEINSYNTES" "- cellen producerar virala proteiner" 5. Different morphological aspects of mamavirus and Sputnik. La Scola et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07218 " 6. 1, 2 "3, 4 6"Tid "5 Eklips" VIRUSENS MONTERING/ ASSEMBLY (MOGNAD)" "- proteinenheterna formar kapsiden, inuti " vilken nukleinsyran packas" FRIGÖRELSE AV FÄRDIGA VIRUS" "- de färdiga virusen lämnar cellen" 1954 R Dulbecco, M Vogt Renato Dulbecco 1. ADSORPTION" CELLMEMRAN OCH RECEPTORER" Slumpmässig kollision, fysikaliskt fenomen, fordrar ej energi" "–> hög virionkoncentration, varav inte många fäster sig vid cellen" Virus känner igen en receptor på cellens yta och fastnar i den " "–> mycket specifik bindning " Virus infekterar bara några få celler " Virus kan även komma in i celler som det inte kan replikera i" Hundens parvovirus transferrinreceptor !! (C.R. Parrish 2001) ! Exempel av cellreceptorer: Integrin, heparinsulfat, sialsyra, CD21, CD4, CCR5, globosid, ICAM-1, laminin-receptor, EGF-rcseptor..." Beanpod mottle virus (växt) Chlorellavirus (alg) Endel virus behöver co-receptor för att komma in i cellen" Reseptorerna utgör oftast en viktig andel i cell-och vävnadstropismen" 4 2. PENETRATION" Virus endocytotiska transportleder" Många olika metoder hur virus tar sig in i cellen" " a) Viruset lämnar över sin nukleinsyra eller nukleokapsid direkt " till cytoplasman genom plasmamembranen" " b) Virushöljet går samman (fusionerar) med cellmembranen" " c) Virus passerar igenom cellen i cellvesikler (endocytos)" "- fusion med endosomens membran (influensa)" - Lys av endosom-membranen (adeno)" b) HI-viruset fastnar och kommer in" a) PBCV-1 virusets DNA " matas in i Chlorella algen" Marsh, Helenius: Virus entry Cell 2006 TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN" TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN" Cytoplasman är för viruset som ett stort visköst hav igenom vilket det måste ta sig för att komma till cellkärnan." Höljelösa DNA-viruset (CPV) transporteras i cellvesiklerna till nucleus:" För viruset tar 1 cm resa ca Poliovirus kapsid 16 nm Adenovirus kapsid 45 nm HSV kapsid 63 nm Cytoplasm! Clathrin-" Coated " Viruses" vesicles" Early endosome " Carrier vesicle" Late " endosome " Lysosome Nucleus! i vatten 45 d 122 d 169 d i cytoplasma 61 år 166 år 231 år Från Sodeik, Trends Microbiol 8: 465" " Många virus (rabies, influenssa, herpes, adeno, parvo) använder sig av cellens stödstrukturer, dvs mikrotubulus, " samt cellens cellkärnstransportpotein: dynein och kinesin" Nucleus" MTs" Maija Vihinen-Ranta, Jyväskylä Maija Vihinen-Ranta Jyväskylä universitet PENETRATION" TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN" Transport av virus till cellkärnan och DNA-genomets frigivning! 1) Frigivna genomets (+ protein) transport" "- genomet frigörs" " " i cytoplasman: HIV, influensa" " " i cellkärnan: herpesvirus, adenovirus, hepatit B virus" " 2) " Hela viruspartikeln transporteras till nucleus" "- genomet frigörs i nucleus " "- ex. geminivirus, parvovirus (?)" 3) Virus kommer in i kärnan under celldelningens mitos" "- simian retrovirus 1" Nukleärpor" Cellkärna" Genomets frigörelse från sitt skal uncoating " Smith, Helenius: Virus entry Science 2004 5 VIRUS TRANSPORT I CELLEN BAKTERIOFAGERS PENETRATION" ! E. coli T4-fagen sprutar in sin nukleinsyra genom cellväggen Virus transport till cellkärnan och genomets frigivning" dvs. uncoating" " " " " " Whittaker GR, Kann M, Helenius A. 2000. Viral entry into the nucleus. " Annu. Rev. Cell Dev. Biol.16:627-51." VIRUS-RNA:S PROCESSERING" 3 - 4 EKLIPS (NUKLEINSYRA- OCH PROTEINSYNTES)" Tiden då vi inte ”ser” virusen inne i cellen för viruset har upplösts." " Virus är en högt utvecklad parasit: cellens egna metoboliska verksamhet stannar nästan helt och cellen börjar producera virusdelar." " Endel virus använder cellens polymeras till sin replikation, emedan andra har eget polymeras enzym." " DNA-virus går till cellkärnan men RNA-virus går till cytoplasman." " Virus förökar sig INTE genom att integrera sig i cellens kromosomer." VIRUS TRANSKRIPTIONSKARTA" Capping: " RNA-polymeras II tillsätter efter RNA-syntesen en inverterad metylerad G -trifosfat till RNA:s 5-ända." Polyadenylering: " Alla RNA:n skärs av och polyA-polymeras tillsätter en poly A-sekvens (50-200 nt) vid ett speciellt ställe. En viktig konsensus sekvens är AAUAAA ." CAP-molekyl 7megG" Splicing: " mRNA är inte en enhetlig kopia av DNA:t, utan består av bitar som fogats samman. Många virus använder splicing för reglering av translationen samt för att få tillstånd så många protein som möjligt av ett litet genom: alternative splicing ." " pre-mRNA" mRNA" Cap och Poly A bibehålls" VIRUS REPLIKATIONSSTRATEGI" Exempel ssDNA-virus: parvovirus B19" - tai + ssDNA" (parvo, circo, anello)" Re a d i n g fr a m e 1 2 3 M ap u n i ts 0 20 Nu cl eo ti d es mR N A s : 10 0 0 p 6 40 20 0 0 60 30 0 0 80 40 0 0 10 0 50 0 0 +ssRNA" -ssDNA" +ssRNA" -ssRNA" (retrovirus)" Bär med sig reverse-transkriptas ±dsDNA" (papillom, polyom, adeno, herpes, " HBV, irido, pox)" P ro te i n s: V P 1 (8 3 kD a ) an d 7. 5 k D a p ro te i n V P 1 (8 3 kD a ) NS 1 (7 7 k D a ) V P 2 (5 8 kD a ) an d 7. 5 k D a p ro te i n V P 2 (5 8 kD a ) 7. 5 k D a p ro te i n ? 7. 5 an d 11 k D a p ro te i n s 11 kD a p ro te i n (picorna," flavi," toga," corona)" Kodar till RNA/RNA-polymeras +RNA" ±dsRNA" (reo, birna)" Bär med sig RNA/RNA-polymeras -ssRNA" (rhabdo," paramyxo," orthomyxo," arena, filo," bunya, borna)" Bär med sig RNA/RNA-polymeras 6 DNA-virus! ssDNA: Parvovirus replikation" DNA –> tidig mRNA –> tidigt protein (enzym) DNA-virus DNA replikerar sent mRNA –> sena protein (strukturella) DNA-virus går ända till cellkärnan! - små virus använder cellens polymeras och stora virus har eget polymeras ex. HSV:s transkription, translation & replikation —> MVM: Agbandje-McKenna B19: Clinical Virology, 1997 RNA-virus" Oftast ett relativt litet genom, kanske för att större genom skulle medföra för mycket mutationer i.o.m. att RNA-polymeras inte har RNAfelkorrigering" Behöver eget RNA-RNA-polymeras, ty finns inte normalt i cellen" Inga protein kan produceras utan mRNA, därför påverkar virionens RNAtyp virusets replikation:" +ssRNA: Picornavirus" Replikation: "+ssRNA —> -ssRNA —> +ssRNA => replikation" ! ! ! !enkapsidation" " " " "translation" Translation:" +ssRNA! -ssRNA! dsRNA! RNA->DNA! Genomet fungerar som mRNA protein (RNA-polymeras) +RNA-virus Syntes av komplementär RNA-sträng (-RNA) Nya virala RNA (+RNA) protein -ssRNA: Paramyxovirus! Virusgenetik" Virus förökar sig mycket snabbt" " Replikation:! -ssRNA —> +ssRNA —> -ssRNA! ! Transkription: ! -ssRNA —> 6 mRNA! En endaste viruspartikel kan producera mycket avkomma" –> quasispecies! " Transformationsmekanismerna är" Mutationer" Rekombination" Omorganisation (reassortment)" Blandning av olika fenotyper! 7 MOGNAD AV VIRUSETS HÖLJEPROTEIN! 5 - 6. MOGNAD OCH FRIGÖRELSE! Nukleinsyran och proteinerna sammanförs till nya viruspartiklar." Höljeproteinens" sekretionsrutt:" Viruskapsidens ihopmontering är programmerat i proteinens aminosyresekvens = self assembly " Proteinen sammanfogas på ett för viruset säreget sätt." 1. ER: " Höljeproteinen glykosyleras och transporteras till cellmembranen." " Vissa virus får omkring sig ett hölje bestående av lipider (och glykoprotein)." - proteinsyntes" - vikning av proteinet" - svavelbindningar" - glykosylationens början" a) " P.g.a. virusinfektionen har cellen inte kapacitet att lappa och förnya sig och virusen ”söndrar” cellen = cellen lysar och virionerna frigörs och cellen dör. " b) En virustriggad signal leder till cellens självförstörelse (apoptos)." " c) Höljebeklädda virus kan komma ut genom avknoppning ( budding ). " Viruset hamnar i de delar av cellmembranen där virusglykoproteinen lagrats. " " d) Viruspartikeln kommer ut via exocytosrutten." 2. Golgi:" " - Glykosylationen slutförs " - Transportvesikler för " proteinen till cellmembranen" VIRUS TRANSPORT UT UR CELLEN! Virusgenomets eller partikelns transport från cellkärnan till cytoplasman" BAKTERIOFAGERS UTGÅNG! Höljelösa virus lysar cellen burst Transport av RNA genom poren" - Retrovirus (HIV, SIV)" - Influensavirus" - DNA-virus som har reverese " transriptas aktivitet (RNA —>DNA)" (hepatit B virus)" " Viruspartikeln frigörs vid cell lysis" (adeno, polyom)" " Viruspartikeln går genom poren " (gemini, parvo)" " Partikeln avknoppas genom " cellmembranen " (herpes, baculo, SV40?)" Whittaker GR, & Helenius A. 1998. " Nuclear import and export of viruses " and virus genomes. Virology 246:1-23." ADSORPTION PENETRATION FRIGÖRELSE Värdcellfunktion Transkription Translation REPLIKATION VIRUS FÖRÖKNING Assembly (mognad) FRIGÖRELSE VIRIONER KÄLLOR! Virus Ultrastructure by Linda Stannard [http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/linda.html]" " All the virology on the web by David Sander [http://www.tulane.edu/~dmsander/]" " ICTV [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/index.htm]" " Molecular genetics by Ulrich Melcher OSU [http://opbs.okstate.edu/~melcher/]" " Maija Vihinen Ranta, Jyväskylän yliopisto" " Fundamental Virology, Fields and Knipe, Raven Press" " Principles of Virology, Flint et al, ASM Press" Grundvirologikurs: Fortsättningskurser: “Johdanto viruksiin” (Biotdk) “Molecular Virology”, “Molecular epidemiology of virus infections” “Clinical virology” 8