Inst för ekologi, miljö och geovetenskap
Svampkunskap III, 7,5 hp
Något om molekylära metoder inom
svampsystematiken
Projektarbete av
Elin Grahn
Svampkunskap III
Umeå, Skövde, ht-10
Handledare: Elisabeth Wiklund
1
Innehållsförteckning
Sammanfattning
sid 3
Inledning
sid 3
Syfte
sid 4
Material och Metod
sid 4
Några taggsvampar
sid 4
Molekylära metoder
sid 6
Ribosomala gener
sid 8
ITS
sid 9
Proteingener
sid 9
Diskussion
sid 9
Käll- och litteraturförteckning
sid 10
Försättsbladets bild är tänkt att symbolisera en möjligen vilsen svamp som inte vet riktigt om den
hamnat helt rätt och var den hör hemma – sådana verkar det finnas gott om inom svampsystematiken.
Foto denna bild samt bilden i Figur 1: E. Grahn.
2
Sammanfattning
Mycket av den svampforskning som bedrivs idag handlar om att korrekt föra in svamparter i
den systematiska indelningen av levande organismer. Senare års utveckling av metoder inom
molekylärbiologin har gett helt nya möjligheter att utreda släktskap mellan olika arter och i
detta arbete beskrivs översiktligt vad dessa molekylära metoder baseras på och vad för
molekyler det är som jämförs då man pratar om LSU, SSU, ITS och RPB2. Som ett exempel
på hur stora skillnader de nya metoderna medfört för indelningen av svampar har några
taggsvampar studerats. Dessa var i en tidig svampbok indelade i samma släkte, men tillhör nu
inte bara olika släkten utan även olika ordningar.
Inledning
Med biologisk systematik avses indelandet av olika arter för att visa hur de är besläktade med
varandra. Carl von Linné var en av de första som under 1700-talet på allvar började inordna
levande organismer på ett systematiskt sätt samt att vetenskapligt namnge olika arter efter hur
de passade in i systemet. Linné tittade dock främst på växter och djur och baserade indelning
på yttre likheter mellan olika arter. Under 1800-talet föreslog Charles Darwin att alla levande
arter utvecklats ur ett gemensamt ursprung genom evolution och gradvisa förändringar över
långa tidsperioder. Den biologiska systematiken ska därför inte längre visa hur lika olika arter
är varandra, utan snarare hur olika arter är besläktade med varandra och hur de utvecklats från
gemensamma anfäder.
Det finns för närvarande ca 100000 kända svamparter. Dessa tillhör alla domänen Eukarya
vilket betyder att de har en cellkärna som innehåller cellens genetiska material och att
cellkärnan avgränsas från resten av cellen med ett membran. De andra två domänerna som
finns är Eubacteria och Archaea. Inom domänen Eukarya har svamparna placerats i ett eget
rike – Fungi och medlemmarna av detta rike är närmare släkt med djur än med växter. Riket
Fungi delas i sin tur in i sju olika fyla (Hibbett m.fl. 2007). Chytridiomycotas medlemmar
lever ofta i vatten som parasiter och kan förflytta sig med hjälp av flageller.
Neocallimastigomycota innehåller anaeroba mikrosvampar som finns i matspjälkningssystemet hos vissa djur där de bidrar med enzymer som kan bryta ner bl.a. cellulosa. Fylum
Blastocladiomycota innehåller svampar som har egenskapen att de växer bipolärt, d.v.s. från
två ändar av cellen samtidigt. Microsporidia är ett fylum som innehåller encelliga parasiter av
enkel uppbyggnad som på ett virusliknande sätt invaderar och övertar sin värdcell.
Glomeromycota är ett ekologiskt viktigt fyla då dess medlemmar lever i symbios med de
flesta växter. (Wiklund, 2009). Fylum Ascomycota och fylum Basidiomycota utgör dessutom
tillsammans subriket Dikarya och skiljs åt genom att Ascomycota bildar sporer i sporsäckar
medan Basidiomycota bildar sporer på basidier. Bland de egenskaper som utmärker samtliga
medlemmar av riket Fungi kan nämnas att de har en cellvägg på samma sätt som växter, men
cellväggen består av kitin i stället för cellulosa, att de är heterotrofa till skillnad från växter
d.v.s. de får den energi de behöver från andra organismer i likhet med djur samt att de sprids
med hjälp av sporer.
Dagens svampforskning verkar till stor del handla om att indela svamparter på ett
systematiskt korrekt sätt. Det som Linné gjorde för 250 år sedan för växter och djur görs nu
alltså för svampar. Under de senaste årtiondena har molekylärbiologiska metoder och
kunskaper utvecklats och genom att ta hjälp av dessa kan biologisk systematik ske inte bara
3
utefter yttre synliga egenskaper (makroskopiska eller mikroskopiska) utan även på molekylär
nivå genom att jämföra de kemiska molekyler som bygger upp organismen (Høiland 2007,
Hibbett m.fl. 2007).
Syfte
Huvudsyftet med detta arbete var att försöka ta reda på lite mer om de molekylära metoder
som används inom svampsystematiken. Stora förändringar av svampars systematik har ägt
rum under senare år som en följd av att de molekylära metoderna utvecklats. Trots det
beskrivs ofta inte de metoder som använts, åtminstone inte i den litteratur jag haft tillgång till.
Utan att fördjupa mig alltför mycket i de tekniska detaljerna har jag velat försöka förstå lite
mer om vad det egentligen är för molekyler man analyserar och varför man studerar just dessa
molekyler inom svampsystematiken.
Material och Metod
Detta arbete är en litteraturstudie som baserats på kurslitteratur till kursen Svampkunskap III
samt annan litteratur som är tillgänglig via bibliotek eller internet.
Några taggsvampar
I ”D:r M. A. Lindblads svampbok” från år 1901 (Romell och Sandberg) delas hattsvamparna
(Hymenomyceter) in i fyra familjer: skivsvampar, rörsvampar, taggsvampar och hudsvampar.
Gemensamt för dessa är att sporerna (”fröstoftet”) bildas på utsidan och det som skiljer
familjerna åt är hur den yta där sporerna bildas ser ut.
Jag har tittat lite mer på familjen taggsvampar (Hydnéer) där sex olika arter tas upp i den över
hundra år gamla svampboken. Dessa sex arter ansågs alla tillhöra samma släkte, Hydnum och
det som beskrivs som det gemensamma för taggsvamparna är att ”fröstoftet alstras på utsidan
af syllika piggar eller taggar, som nedhänga från hattens undersida”. De sex arterna är enligt
Romell och Sandberg: fjällig taggsvamp, (Hydnum imbricatum) slät taggsvamp (H.
lævigatum), blek taggsvamp (H. repandum), gyttrad taggsvamp (H. corrugatum),
koralltaggsvamp (H. coralloides) samt gelétaggsvamp (H. gelatinosum) (Figur 1).
Figur 1. Gelétaggsvamp.
Då jag letade efter dessa sex svamparter i modernare svamplitteratur är det bara en som
fortfarande har kvar samma vetenskapliga namn – Hydnum repandum, blek taggsvamp. De
övriga fem har fått nya namn, antingen bara släktnamnet eller både släktnamn och artepitet.
De frågeställningar som då uppstod var dels var någonstans i det fylogenetiska släktträdet
arterna hamnar idag och dels vilka metoder man använt för att komma fram till de resultaten.
4
För att få reda på vilka vetenskapliga namn de sex svamparterna har idag (Tabell 1) beslutade
jag mig för att använda Index Fungorum (websida 2010) efter att ha upptäckt att olika namn
används på olika ställen. Alla arter tillhör fylum Basidiomycota, subfylum Agaricomycotina
och klass Agaricomycetes, men ordningen varierar. För P. gelatinosum verkar en viss
osäkerhet råda angående familjetillhörighet eftersom familj anges som ”incertae sedis”.
Incertae sedis betyder osäker placering på latin och osäkerhet när det gäller att placera in arter
i ett fylogenetiskt släktträd kan bero på flera olika faktorer som t.ex. att arten är dåligt
beskriven, att molekylära data saknas (gäller speciellt för sällsynta arter som det kan vara
svårt att få tag på), att data från olika studier visar på olika resultat (Moncalvo m.fl. 2006)
eller att det råder kontrovers bland forskare om hur arten ska placeras. (Websida 2010).
Tabell 1. Indelning av taggsvamparna enligt modern svampsystematik. Efter uppgifter i Index
Fungorum (websida 2010).
Klass
Ordning
Familj
Art
Svenskt
namn
Agaricomycetes
Auriculariales
Incertae sedis
Pseudohydnum gelatinosum
Gelétaggsvamp
Agaricomycetes
Cantharellales
Hydnaceae
Hydnum repandum
Blek taggsvamp
Agaricomycetes
Thelephorales
Bankeraceae
Sarcodon leucopus
Slät taggsvamp
Agaricomycetes
Thelephorales
Bankeraceae
Sarcodon imbricatus
Fjällig taggsvamp
Agaricomycetes
Russulales
Hericiaceae
Crelophus cirrhatus
Gyttrad taggsvamp
Agaricomycetes
Russulales
Hericiaceae
Hericum coralloides
Koralltaggsvamp
Figur 2. Fylogenetiskt träd över Basidiomycota hämtad från Hibbett m.fl. (2007), de ordningar som
innefattar taggsvamparna som beskrivs i detta arbete är markerade med en blå *.
5
De fyra olika ordningar de sex taggsvampsarterna tillhör är utspridda inom klassen
Agaricomycetes (Figur 2). Gelétaggsvamp tillhör ordningen Auriculariales tillsammans med
t.ex. judasöra (Auricularia auricula-judae). Blek taggsvamp placeras i ordningen
Cantharellales dit även kantareller och fingersvampar hör. Slät taggsvamp och fjällig
taggsvamp tillhör fordningen Thelephorales som är nära släkt med Polyporales dit många
tickor hör. Slutligen tillhör både gyttrad taggsvamp och koralltaggsvamp ordningen
Russulales tillsammans med t.ex. kremlor och riskor.
Att de sex arterna av taggsvamp alla tillhör fylum Basidiomycota innebär att de har samma
typ av livscykel. Ett sätt att beskriva en svamps livscykel är att börja med en spor som
innehåller en cellkärna (monokaryot) med en enkel genuppsättning (haploid, n) hamnar i en
gynnsam miljö där den kan börja gro. De långsmala utskott som bildas kallas hyfer och varje
hyfcell kommer att ha en cellkärna identisk med den som fanns i den ursprungliga sporen. Om
hyferna sammanträffar med hyfer från en annan organism av samma art och av kompatibel
parningstyp kan de förenas i en process som kallas plasmogami. Mycelet som då fortsätter att
växa kommer att innehålla två olika cellkärnor (dikaryot) per hyfcell och kallas
parkärnsmycel (n+n). Då för svampen lämpliga miljömässiga betingelser äger rum kan en
fruktkropp bildas vilken även den är uppbyggd av dikaryota celler. I de sporbildande organen
(basidiet) kommer de två olika cellkärnorna att smälta samman (karyogami) till en cell med
dubbel genuppsättning (diploid, 2n). Senare delas cellen genom reduktionsdelning (meios)
och halva genuppsättningen hamnar i varje dottercell som åter är haploid och i sin tur
utvecklas till nya sporer. (Deacon 2006). Störst möjlighet för genetisk variation att uppstå och
kunna föras vidare till nästa generation är under meiosen. Den ovan beskrivna sexuella
cellcykeln ger upphov till en ny kombination av gener efter meiosen, så de nya sporerna som
bildas inte behöver vara genetiskt helt identiska med någon av de tidigare genrationerna.
Även asexuell reproduktion kan förekomma hos Basidiomycota, antingen genom sporbildning
eller genom fragmentering. Vid fragmentering kan en del av mycelet som lossnar ge upphov
till en ny organism som har samma genuppsättning som den ursprungliga. Vid asexuell
sporbildning kan bildas sporer utan någon genetisk variation jämfört med
ursprungsorganismen.
År 1901 var de sex taggsvampsarterna placerade i samma släkte, men nu drygt hundra år
senare tillhör de inte bara olika släkten men dessutom fyra olika ordningar. Frågan jag ställde
mig är hur man gått till väga för att komma fram till dessa resultat och det är naturligtvis en
kombination av flera olika metoder som använts i de olika fallen, så ett enkelt svar på frågan
finns inte, men jag har försökt att förstå lite om de metoder som vanligen används.
Molekylära metoder
I de studier jag läst om där man använder molekylära metoder för att kartlägga släktskap
mellan olika arter är det främst DNA-molekyler (DNA är en förkortning för engelskans
deoxyribonucleic acid, deoxiribonuklinsyra på svenska) som studeras. Sekvensen för DNAmolekylerna från de arter man är intresserad av bestäms och jämförs sedan med varandra. Det
som skiljer olika metoder åt är vilka DNA-molekylers sekvenser man väljer att studera. I ett
fåtal fall jämförs även proteinsekvenser efter att sekvenserna i de studerade DNAmolekylerna översatts till aminosyrasekvensen i motsvarande protein.
DNA är de molekyler som lagrar den genetiska informationen inuti en cell. En DNA-molekyl
är en polymer d.v.s. en molekyl som är uppbyggd av många repeterade enheter av samma
slag; byggbitarna i DNA kallas nukleotider. Det finns fyra olika nukleotider och det som
skiljer dem åt är vilken av fyra olika kvävebaser som ingår: adenin (A), cytosin (C), guanin
(G) eller tymin (T). En DNA-molekyl är dessutom dubbelsträngad och består av två halvor
6
som är komplementära till varandra vilket betyder att för en viss sträng finns det bara ett sätt
för den andra strängen att se ut på så att de två halvorna passar ihop.
I eukaryota celler finns DNA:t lagrat i cellkärnan (nucleus på engelska, varför beteckningen
nDNA används för DNA från cellkärnan) samt i de organeller som kallas mitokondrier (och
beteckningen mtDNA används för DNA från mitokondrierna). I växtceller finns dessutom
DNA i kloroplasterna, d.v.s. de organeller där fotosyntesen sker.
En bit av en DNA-molekyl som kodar för ett protein (eller mer sällan en bit funktionell RNAmolekyl) kallas för en gen. Varje cell innehåller en uppsättning av organismens samtliga
gener. För att få fram tillräckligt mycket av den bit DNA man bestämt sig för att studera
används tekniken PCR (polymerase chain reaction eller polymeraskedjereaktion).
Figur 3. Schematisk bild som visar hur en bit DNA kopieras med PCR, bilden är tagen från Wikipedia
(websida 2010). I steg 1 upphettas den ursprungliga DNA-molekylen (blå) så att de två strängarna
skiljs från varandra. I steg 2 sänks åter temperaturen och de två primrarna (röda) binder till varsin
sträng. I steg 3 kan enzymet DNA-polymeras (grön markerad med ”P”) bygga upp nya strängar
(gröna) med primrarna som start som blir komplementära med de ursprungliga (blå). De nya
strängarna består av de tillsatta nukleotiderna. I steg 4 har den första cykeln avslutats och man har fått
dubbelt så många DNA-molekyler jämfört med vad som fanns från början. Längst ned visas antalet
molekyler då processen upprepats två respektive tre gånger. Vanligtvis upprepas processen 25-30
gånger.
PCR är en metod som används för att masskopiera ett visst avsnitt av en DNA-molekyl så att
man får tillräckligt stor mängd av just den bit av DNA-molekylen man är intresserad av för att
kunna genomföra olika studier, t.ex. bestämma sekvensen av DNA-avsnittet. För att tekniken
ska fungera behövs förutom DNA-molekylen som ska studeras även två korta speciellt
7
tillverkade DNA-molekyler som kallas primrar. Dessa binder till varsin sträng av DNAmolekylen i ändarna av det DNA-avsnitt man är intresserad av. Vidare behövs ett överskott av
nukleotider, d.v.s. de byggstenar som bygger upp DNA samt även enzymet DNA-polymeras
som bygger upp nya komplementära DNA-strängar med den gamla som mall. En schematisk
bild över metoden visas i Figur 3.
För att välja ut lämpliga molekyler att studera då man vill klargöra släktskap behövs
molekyler som finns i samtliga arter som ska undersökas och som dessutom skiljer sig lagom
mycket från varandra.
Ribosomala gener
Ribosomer är stora komplex i cellerna vars funktion är att översätta den kod som finns i en
mRNA-molekyl och är ett slags avskrift av DNA-genen inuti cellkärnan till ett protein som
ska syntetiseras av rätt följd av aminosyror. I alla levande organismer har ribosomerna en
central roll och i alla organismer är de uppbyggda på samma sätt: av en stor och en liten
subenhet. Var och en av dessa subenheter är i sin tur uppbyggda av både ribosomalt RNA
(rRNA) och flera stycken olika proteiner. Generna som kodar för rRNA delen i den lilla
subenheten (SSU, small subunit) respektive den längsta biten av rRNA i den stora subenheten
(LSU, large subunit) är de som verkar vanligast att studera då man vill kartlägga släktskapet
hos levande organismer (Figur 4). Även motsvarande gener från mitokondrierna ingår i vissa
studier och kallas då mt-LSU och mt-SSU samt ibland även en mindre bit rRNA från den
stora subenheten (5.8S). I samtliga dessa fall är det dock DNA-molekylernas sekvenser man
jämför med varandra, d.v.s. DNA-sekvensen i genen som kodar för en RNA-molekyl. (Weiss
och Oberwinkler 2001).
Figur 4. Schematisk bild av de delar som ingår i pre-rRNA och hur de efter processning och klyvning
inuti cellkärnan exporteras till cytosolen där de sätts samman till ribosomens lilla (SSU) och stora
(LSU) enhet. Bilden omarbetad från Nelson & Cox (2008).
8
ITS
Förkortningen ITS betyder internal transcribed spacer, på svenska kanske ”internt
transkriberat (omskrivet?) mellanrum”. I ett svampgenom är ITS de två områden som sitter
emellan delarna som kodar för SSU och 5.8S respektive 5.8S och LSU (Figur 4). Vid
transkriptionen (omskrivningen från DNA till RNA, som fungerar som en slags kopia) skrivs
hela genen med SSU-ITS-5.8S-ITS-LSU om till en lång RNA molekyl (pre-rRNA) som
modifieras och klyvs (för att bli av med de två ITS bitarna) innan den färdiga ribosomen kan
bildas.
ITS-regionerna varierar mer än de delar som ska ingå i den slutgiltiga ribosomen. Mutationer
här har under evolutionen inte varit lika känsliga eftersom de inte påverkar ribosomens
viktiga funktion på ett lika direkt sätt. På grund av detta lämpar sig studier av ITS-regionerna
bättre då man vill systematisera på artnivå (Abarenkov m.fl. 2010) där skillnaderna är mycket
mindre än då man vill kartlägga släktskapet på en högre nivå (då LSU och SSU är lämpligare
att använda).
I databaser finns nu över 100.000 ITS-sekvenser från svamp och speciella PCR-primers har
tagits fram som bara känner igen ITS-sekvenser från just svamp. Detta gör att ITS metoden är
användbar inte bara för att bestämma släktskap mellan olika arter, utan även om man i t.ex. ett
markprov vill ta reda på vilka svamparter som har sitt mycel i provet utan att behöva
analysera DNA från andra organismer som också finns provet. (Bellemain m.fl. 2010, Kendall
och Rygiewicz 2005).
Proteingener
De allra flesta gener i en organism kodar dock för ett protein, inte för rRNA och det är
proteinerna som i sin tur styr de flesta mekanismer i cellerna i form av enzymer. Studier av
gener som kodar för proteiner används också inom svampsystematiken även om det inte
verkar lika vanligt som att studera de ribosomala subenheterna eller ITS-regionerna.
En av de proteingener som studerats i svampsystematiken är genen RPB2 som kodar för den
nästa största proteinkomponenten som ingår i komplexet RNA polymeras II vars funktion är
att översätta en bit DNA till motsvarande bit RNA (Malkus m.fl. 2006). Fördelen med att
jämföra proteinsekvenser i stället för att jämföra DNA-sekvenser är att alla mutationer i
DNA:t inte behöver påverka proteinet och det är proteinet som har den biologiska funktionen
i cellen och därmed kan bidra till evolutionen.
Diskussion
Att bara titta på yttre karaktärer för att systematisera olika arter är uppenbarligen inte en
tillräcklig metod. I svampboken från år 1901 (Romell och Sandberg) baserades indelning på
det makroskopiska utseendet hos de sporbildande organen (hymeniet). I fallet med
taggsvamparna har denna gamla indelning vid moderna analyser av släktskapsförhållandena
visat sig vara alldeles otillräcklig. I en nyare svampbok (t.ex. Ryman och Holmåsen 2006)
återfinns taggsvamparna på flera olika ställen. Jag har dock en känsla av att de flesta läsare av
svampböcker är hobbysvampplockare som vill kunna känna igen olika arter och skilja dem
från möjliga förväxlingsarter (samt få svar på frågan om svampen går att äta och hur den ska
tillagas). För dessa användare av svampböcker känns den gamla indelningen med
taggsvampar för sig som en mer logisk indelning och om taggsvamparna i själva verket inte är
nära släkt med varandra spelar kanske en mindre roll?
9
Att en yttre, väldigt tydlig karaktär som att ha taggar i stället för sporer eller skivor ändå inte
visar på ett släktskapsförhållande mellan arter som har denna egenskap tyder på att taggarna
har utvecklats flera gånger oberoende av varandra under evolutionens gång vilket är ett
exempel på konvergent evolution. Kanske ger det taggsvamparna en fördel i och med att
hymeniets yta ökar vilket skulle kunna medföra att det blir lättare att sprida sina sporer och
kanske är det inte en så stor genetisk förändring som behövs för att bilda taggar i stället för
t.ex. skivor?
Trots att molekylärbiologiska metoder används för att systematisera svampsläktet finns
fortfarande mycket som ännu är oklart vilket tyder på att metoderna inte är helt och hållet
tillräckliga. Problemet kan kanske ligga att man oftast bara analyserar en gen i taget (vilket
blir lite som att bara analysera en egenskap) – skulle hela genomen vara kända och finnas
tillgängliga skulle säkert betydligt bättre resultat erhållas, men det återstår mycket arbete
(alternativt metodutveckling) innan forskningen nått så långt.
Käll- och litteraturförteckning
Böcker
Deacon J. (2006) Fungal Biology. Blackwell publishing.
Nelson D.L. och Cox M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemsitry. Freeman.
Romell L. Och Sandberg H. (1901) D:r M. A. Lindblads svampbok.
Rymann S. och Holmåsen I. (2006) Svampar. En fälthandbok. Interpublishing.
Wiklund E. (2009) Svampar. Det du behöver veta om svamp … och lite till…..
Artiklar
Abarenkov K. m.fl. (2010) The UNITE database for molecular identification of fungi – recent
updates and future perspectives. New Phytologist. 186:281-285.
Bellemain E. m.fl. (2010) ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico
approach reveals poteintial PCR biases. BMC Microbiology. 10:189.
Hibbett D.S. m.fl. (2007) A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycol. Res.
111, 509-547.
Høiland K. (2007) Stilksporesoppenes nye system. Agarica. 27, 18-44.
Kendall J.M. och Rygiewicz P.T. (2005) Fungal-specific PCR primers developed for analysis
of the ITS region of envirinmental DNA extracts. BMC Microbiology. 5:28.
Malkus A. m.fl. (2006) RNA-ploymerase II gene (RPB2) encoding the second largest protein
subunit in Phaeospharia nodorum and P. Avenaria. Mycol. Res. 110, 1152-1164.
Mancalvo J.M. m.fl. (2006). The cantharelloid clade: dealing with incongurent gene trees and
phylogenetic reconstruction methods. Mycologica 98, 937-948.
Weiss M. och Oberwinkler F. (2001) Phylogenetic relationships in Auriculariales and related
groups – hypotheses derived from nuclear ribosomal DNA sequenceing. Mycol Res. 105,
403-415.
Internet
Index fungorum (http://www.indexfungorum.org) 101117
Wikipedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Incertae_sedis) 101116
Wikipedia (http://sv.wikipedia.org/wiki/Polymeraskedjereaktion) 101123
10
