1 Elektroporering som administrationsverktyg av DNA-vaccin mot hepatit C Kandidater: Karl Eriksson Leonardo Gomez Niclas Berggren Handledare: Margret Chen 2 Innehållsförteckning 1.0 Summary .................................................................................................. 4 1.1 Aim........................................................................................................ 4 1.2 Method ................................................................................................. 4 1.3 Results .................................................................................................. 5 1.4 Conclusion ............................................................................................ 5 2.0 Författarnas bidrag .................................................................................. 7 3.0 Inledning................................................................................................... 8 3.1 Hepatit C Virus ...................................................................................... 8 3.2 Hepatit C Genomet ............................................................................... 8 3.3 Behandling av HCV ............................................................................... 9 3.3.1 Terapival ........................................................................................ 9 3.3.2 Behandling av den vuxna patienten ............................................ 10 3.3.3 Biverkningar ................................................................................. 11 3.3.4 Biverkningar av influensavaccin mot H1N1 ................................. 16 3.4 Sjukdomens utbredning ..................................................................... 18 3.5 Smittvägar........................................................................................... 18 3.6 Hepatit C inom tandvården ................................................................ 18 3.7 Nya framsteg inom vaccinteknik ........................................................ 20 3.8 Utvecklingen av ett terapeutiskt DNA-vaccin mot HCV ..................... 23 3 3.9 Elektroporering: en ny vaccinationsteknik ......................................... 24 4.0 Syfte........................................................................................................ 26 5.0 Metod ..................................................................................................... 26 5.1 Elektroporeringens bieffekter ............................................................ 26 5.1.1 Urval och indelning av försökspersoner ...................................... 27 5.2 Enkäten ”No Pain No Gain” ................................................................ 28 5.3 Litteraturöversikt av intramuskulär elektroporering ......................... 30 6.0 Resultat .................................................................................................. 32 6.1 Elektroporeringens bieffekter ............................................................ 32 6.1.1 Lokala tecken på inflammation.................................................... 32 6.1.2 Upplevd smärta............................................................................ 35 6.2 Enkäten “No Pain No Gain” ................................................................ 39 6.2.1 Fråga 1.......................................................................................... 39 6.2.2 Fråga 2.......................................................................................... 40 6.2.3 Fråga 3.......................................................................................... 42 6.2.4 Fråga 4.......................................................................................... 45 6.3 Litteraturöversikt av intramuskulär elektroporering ......................... 46 7.0 Diskussion............................................................................................... 48 8.0 Slutsatser ................................................................................................ 50 Källförteckning ............................................................................................. 51 4 1.0 Summary 1.1 Aim DNA-vaccination against HCV requires an alternative delivery method than injection. Electroporation increases host-cell permeability for the vaccine plasmids and by doing so also increases the immune response. The aim of this study is to examine the adverse effects of this method and compare them with those related to the current therapy against HCV. Since the main adverse effect of electroporation is a short duration of sharp pain, people’s attitudes, towards pain in relation to the benefits of HCV immunization has also been investigated. 1.2 Method Nine patients with previously untreated HCV genotype-1 were chosen to receive a DNA-vaccine against HCV. This vaccine was delivered by electroporation, at four different occasions. The injection site was studied for 24 hours past the time of administration and during this time the participants also graded their perception of the pain. The result from the clinical trial was compared to the result of a literary review on the subject of intramuscular electroporation in humans. 5 In order to investigate people’s attitudes, towards pain in relation to the benefits of HCV immunization, a survey was sent out to 1583 Swedish dentists. The survey consisted of 4 questions where the participants graded the amount of pain they were ready to endure in order to be cured or vaccinated against H1N1 and HCV. 1.3 Results Apart from mild symptoms of inflammation at the injection site, no other adverse effects then sharp pain was registered. The pain varied between participants and different occasions. The medium score for pain on a scale from 1-10 was 5,22. The results from the clinical trial were comparable with those found in the literary review. Of the 1583 dentists that were asked to participate in the survey 738 answered all questions. The answers suggested towards a more lenient attitude towards pain as the benefits increased. 1.4 Conclusion The most significant adverse event associated with the use of electroporation, as a delivery method for DNA vaccine, is a sharp 6 transient pain with short duration. It seems though as if the majority of people aren´t deterred by this pain level when considering to be vaccinated against HCV. 7 2.0 Författarnas bidrag Arbetet har gjorts i en fin samarbetsanda och med stort hjälp av varandra, dock har vi fördelat vissa delar av arbetet enligt nedan: Karl Eriksson; Beskrivning av Hepatit C Viruset, sjukdomens utbredning, Hepatit C inom tandvården samt om nya framsteg inom vaccinteknik. Leonardo Gomez; Beskrivningen av Hepatit C Genomet, behandling av HCV samt biverkningar denna. Även jämförelse med biverkningar av influensavaccin mot H1N1. Niclas Berggren; Utvecklingen av ett terapeutiskt DNA-vaccin mot HCV samt om elektroporering och dess bieffekter. Även en litteraturöversikt av intramuskulär elektroporering. Tillsammans har vi gjort följande: Gått igenom vetenskapliga artiklar som har använts som underlag Sammanställt resultatet Utformat och sammanställt enkäten ”No Pain No Gain” Diskuterat och kommit fram till vår slutsats 8 3.0 Inledning 3.1 Hepatit C Virus Hepatit C Viruset (HCV) upptäcktes i slutet av åttiotalet. Den inledande fasen av infektionen är ofta asymptomatisk, men hos ungefär 20 % av patienterna utvecklas en akut infektion med gulnande hy och illamående som följd. I 10 till 30 % av fallen läker infektionen ut av sig själv medan den i övriga fall övergår i en kronisk fas. Infektionen betecknas som kronisk när en patient burit på viruset i över sex månader. De flesta patienter erfar endast en blygsam minskning av leverfunktionen medan andra drabbas av en kraftig inflammation med fibros och cirros (skrumplever) som följd (Internetmedicin 2011 http://www.internetmedicin.se/dyn_main.asp?page=159). 3.2 Hepatit C Genomet HCV genomet består av en enkelsträngad RNA-molekyl. I likhet med andra RNA-virus så saknas en rättningsfunktion i samband med replikationen vilket leder till en stor genetisk mångfald. Detta i sin tur bidrar till att viruset kan undvika kroppens immunförsvar. HCV delas in i sex olika genotyper (1-6) vilka även delas in i subtyper (a,b,c etc.) På nukleotidnivå kan det skilja upp till 30 % mellan olika genotyper (Ahlén 2007, s 5-12). 9 3.3 Behandling av HCV 3.3.1 Terapival På grund av de många biverkningarna som behandlingen medför ska denna vara individanpassad och hänsyn bör tas till faktorer såsom förväntad livslängd, hälsotillstånd, livskvalité och psykosocial situation. Inför behandlingsbeslutet görs en bedömning av det medicinska behovet, chansen till infektionsfrihet och riskerna för biverkningar. Underlaget till terapivalet utgörs av en prognosbedömning som baseras på leverns fibrosstadium och inflammationsgrad. I samband med detta fasställs också virusets genotyp och dess RNA kvantifieras. För att underlätta prognosbedömning används ett graderingssystem där fibros och inflammation värderas separat. Det är viktigt med en noggrann hälsoundersökning för att utreda förekomsten av andra infektioner och hälsotillstånd vilka kan ha en negativ inverkan på prognos samt biverkningar. Eftersom patienter med kronisk HCV riskerar att få ett förvärrat sjukdomsförlopp om de drabbas av hepatit A eller B, jämfört med patienter med tidigare frisk lever, rekommenderas vaccination mot dessa virus. 10 3.3.2 Behandling av den vuxna patienten För att förhindra att infektionen övergår i ett kroniskt tillstånd bör patienter med symtomatisk akut HCV få behandling efter tre till fyra månader om HCV RNA fortfarande är påvisbart i blod. I de fall där den akuta infektion är asymptomatisk bör behandling sättas in omedelbart då denna variant har en högre benägenhet att övergå i en kronisk fas. Förstahandsvalet i samband med den akuta infektionen är monoterapi med Peg-INF alfa under 24 veckor. Hos patienter med kronisk HCV rekommenderas kombinationsbehandling med Peg-INF och ribavirin. Behandlingen pågår då oftast i 48 veckor men kan kortas ned eller förlängas beroende på behandlingssvar. Vid kontraindikation för ribavirin rekommenderas monoterapi med Peg-INF under lika lång tid. Patienter som efter behandling har ett kvarstående virologiskt svar bör fortsätta att vara under regelbunden kontroll på grund av den förhöjda risken för hepatocellulär cancer. I de fall där patienten avstår behandling bör denne kontrolleras årligen och en förnyad leverbiopsi skall utföras inom tre till fem år (Läkemedelsverket, 2008. http://www.lakemedelsverket.se/upload/halso-ochsjukvard/behandlingsrekommendationer/REV%20HCV-rek.pdf). Under 2011 kommer en ny typ av läkemedel att introduceras för behandling av HCV, så kallade proteas-inhibitorer. Dessa kommer att leda till en bättre behandling men även fler biverkningar. 11 3.3.3 Biverkningar Biverkningar är vanligt förekommande vid kombinationsterapi med PegINF och ribavirin. Det råder likartade biverkningsprofiler mellan Peg-INF alfa-2a och 2b. I kliniska studier har det visats att upp till 15 % av patienterna avbryter sin behandling i förtid på grund av biverkningar. Behandlande läkare uppger dock att den siffran är i underkant utanför kliniska studier och frekvensen avslutade behandlingar i förtid är då betydligt högre än så. I mer än 20 % har dosjusteringar utförts. Vanligast förekommande biverkningar har varit anemi och neutropeni. Andra bieffekter kan vara allvarliga CNS-påverkan såsom depression, självmordstankar och beteendeförändringar och kan uppträda upp till sex månader efter avslutad behandling. Patienterna bör noggrant följas upp avseende symptom på psykiatrisk sjukdom. Dessa bör då komma i kontakt med psykiatriker och eventuellt ska antidepressiva medel sättas in. Det är viktigt att det finns ett multidiciplinärt team med behandlande läkare, psykiatiker, sjuksköterska, kurator och dietist för att behandlingen skall underlättas. De flesta organsystemen drabbas av biverkningar och de vanligaste är hematologiska, dermatologiska, neurologiska, immunologiska och gastrointestinala. Även luftvägarna, kardiovaskulära omloppet och ögonen kan drabbas. 12 Nyttan av behandlingen bör ställas i relation till hur stor skada levern har lidit samt risken att drabbas av komplikationer vid medicinering. Efter första injektionen med interferon drabbas många patienter av influensaliknande symptom; feber (20 – 30 %), huvudvärk (40 – 50 %) och myalgi (20 – 30 %). Besvären uppkommer inom 4 till 6 timmar efter injektionen och kan kvarstå i flera dagar. Om patienten tar NSAIDpreparat eller acetaminophen som profylax eller som behandling kan detta lindra besvären. En vanlig biverkning som rapporterats i många studier är trötthet, vilket har en incidens på 60 – 90 %. Trötthet vid ribavirin och Peg-INF behandling kan ha multipla orsaker och kan påverka effekten av behandlingen. Patienten riskerar i förlängningen att drabbas av depression, anemi och/eller hypotyreoidism. Anemi uppkommer som en följd av Peg-INF-inducerad hämning av benmärgen och ribavarin-inducerad extravaskulär hemolys. Anemin kan förvärra Peg-INF associerad trötthet. Den initiala behandlingen för att motverka anemin är att minska på ribavirindosen . Patienterna kan även drabbas utav neutropeni och trombocytopeni på grund av benmärgshämning, dock har inget samband kunnat visas mellan behandlingsinducerad neutropeni och förhöjda nivåer av allvarliga infektioner. Inte heller ökad blödningsbenägenhet på grund av trombocytopenin är vanlig. Således är den kliniska betydelsen av dessa 13 cytopenier osäker, dock antas den vara låg. Vid neutropeni och trombocytopeni är första åtgärden att sänka dosen Peg-INF. Mer än var tionde patient har Peg-INF-relaterade dermatologiska biverkningar såsom håravfall, dermatit, klåda, torr hud och reaktion vid injektionsstället. Andra mindre vanliga, men ändock frekvent förekommande biverkningar är erytematösa utslag, makulopapulösa utslag, svettningar, psoriasis, urtikaria, eksem, akne, ljuskänslighet, dermatit, furunkulos, ansikts- eller perifiera ödem, onormal hårstruktur, nagelproblem samt smärta vid injektionsstället. Vid sällsynta fall, mindre än 1 % av patienterna, kan följande åkommor drabba de behandlade: Herpes simplex virus (HSV), hudinfektion, toxisk epidermalnecrolys, Stevens-Johnsonsyndromet, erythema multiforme och nekros vid injektionsstället. Om patienten drabbas av en allvarlig hudåkomma, såsom toxisk epidermalnekrolys, StevensJohnsonsyndromet, erythema multiforme, etc, bör behandlingen avbrytas direkt. Patienter som tidigare är drabbade av psoriasis bör övervakas noggrant på grund av risken för svåra exacerbationer. Hepatit är i sig associerat till olika hudåkommor som lichen planus, porphyria cutanea tarda och vaskulit. Vid interferonbaserad behandling kan dessa besvär ibland förbättras vartefter HCV infektionen försvinner. Depression, maniska tillstånd samt akuta eller kroniska kognitiva dysfunktioner är några av de neurologiska biverkningarna av interferonbehandlingen. Patienter som sedan tidigare lider av 14 neurologiska besvär kan även de behandlas med interferon, men, de bör noggrant utvärderas för att upptäcka eventuell mental instabilitet innan behandlingen påbörjas. Under behandlingens gång är depression den vanligaste biverkningen och därför bör patienterna genomgå regelbundna kontroller, var 4 - 12e vecka, för att snabbt upptäcka symptom på depression. Ca 3 - 5 % av patienterna som står under Peg-INF och ribavirinbehandling utvecklar svåra infektioner. Neutropeni har inte visats vara orsaken bakom detta vilket tyder på att mekanismerna som ligger bakom immunosuppressionen är mer komplexa än så. Den försämrade leverfunktionen ger också ökad risk för infektion och cirrospatienter har en väldigt hög infektionsrisk. Även äldre patienter och diabetespatienter får en förhöjd infektionsrisk vid användning av Peg-INF. Det är relativt vanligt att HCV patienter har symptom relaterade till gastrointestinala trakten med det är sällan som dessa problem leder till avhopp i behandlingen. De vanligaste förekommande besvären är illamående (30 - 40 %), anorexi med eller utan viktnedgång (20 - 30 %), diarré (15 - 25 %), kräkningar (10 - 15 %), magont (10 - 15 %), dyspepsi (5 - 10 %) och förstoppning (5 %). Den vanligaste komplikationen vid INF-baserad terapi är hypotyreoidism (3 - 4 %), som oftare uppträder hos kvinnor än hos män. Hos patienter som redan har tyroideaperoxidasantikroppar är risken förhöjd med ca 15 fyra gånger för utveckling av sköldkörtelsprobelm om de medicinerar med IFN. Även hypertyroidism kan uppträda under IFN-baserad terapi. Hos 0,1 0,7 % av patienterna med HCV kan diabetes typ 1 uppträda initierat av Peg-INF behandling och detta tillstånd blir då irreversibelt. 20 % av patienterna upplever att de får hosta och/eller dyspné av PegINF och ribavirinbehandlingen. Även minskat gasutbyte, dock reversibelt, har påvisats. Vid Peg-INF och ribavirinbehandling är infektiös bronchit och lunginflammation två vanliga komplikationer. Om patienten redan lider av KOL kan denna förvärras av IFN terapi och dessa patienter därför bör hållas under noggrann uppsikt under behandlingen. Sarkoidos är en multisystemisk granulomatös sjukdom som ofta drabbar lungorna. Dess patogenes är okänd, men det har visats att Peg-INF kan trigga igång sjukdomen, även hos patienter som tidigare haft sarkoidos. Interstitiell pneumonit kan också associeras med Peg-INF-behandling. Denna komplikation kan i vissa fall vara dödlig. Om patienten misstänks ha drabbats av interstitiell pneumonit skall behandlingen omedelbart avslutas och patienten remitteras till en specialist i luftvägsjukdomar. Peg-INF och ribavarin-inducerad anemi kan orsaka myocardial ischemi hos patienter som tidigare drabbats av hjärtkärlsjukdomar. Därför bör 16 HCV-patienter undersökas och utvärderas för att se om riskfaktorer som t.ex. rökning, diabetes etc. föreligger innan behandlingen startas. Kardiovaskulära komplikationer som direkt initieras av Peg-INF är sällsynta. Allvarligare komplikationer har ej rapporterats alls, men en potentiell sådan är cardiomyopati. Det är ovanligt att Peg-INF-behandling orsakar grava synrubbningar, men blindhet har observerats hos en del patienter. Däremot kan uppemot 30 % av patienterna drabbas av subkliniska abnormaliteter i näthinnan. Denna är dock reversibel och går över när behandlingen avslutas. De patienter som löper störst risk är de som tidigare haft andra ögonsjukdomar. Dessa patienter och patienter som drabbas av synrubbningar under behandlingens gång ska undersökas av en ögonläkare för att avgöra om behandlingen skall fortgå eller avslutas (Sulkowski et al, 2011, Nature reviews. Gastroenterology & hepatology). 3.3.4 Biverkningar av influensavaccin mot H1N1 I en studie utförd på ett norskt krigsfartyg fick de 133 besättningsmännen influensavaccinet Pandemrix mot H1N1. Målet var att se vilken typ av biverkningar som drabbade de 133 vaccinerade. Vaccinet administrerades intramuskulärt i m. deltoideus. Samtidigt fick besättningsmännen ett frågeformulär där de fick beskriva intensiteten av biverkningarna. 17 75% av besättningen fick någon form av biverkning och 9 % fick så svåra symptom att de inte kunde fullgöra sina normala arbetsmoment och fick avstå minst en dags arbete. Inga av biverkningarna bedömdes dock som allvarliga av den medicinska personalen ombord. Samtliga biverkningar var av övergående karaktär (Munch et al. 2010, Int. Marit. Health). Två andra studier gjorda på fyra andra vacciner mot H1N1 visar på liknande symptombild. Lokala besvär som uppstår är ömhet, smärta, rodnad, förhårdnader, svullnader samt blåmärken. Bland de systemiska biverkningarna återfinns huvudvärk, illamående, muskelvärk, frossa, feber och kräkningar. Till skillnad från studien ovan så var den absolut vanligaste biverkningen vid dessa vaccinationer smärta vid injektionspunkten. Normalt sett följdes inte smärtan av rodnad och smärtan var över inom 72h. Ca 40 % av de behandlade fick muskelvärk vilket överensstämmer med studien av de norska besättningsmännen (Clark et al. 2009, N. Engl. J. Med.) (Greenberg et al. 2009, N. Engl. J. Med.). National Insitute for Health and Welfare (THL) I Finland rapporterade under februari 2011 att ett samband mellan ökade fall av narkolepsier bland barn och ungdomar och vaccination av Pandemrix har kunnat fastställas. Främst drabbas barn och ungdomar men även äldre har drabbats (högsta uppmätta åldern var 37 år) (National Institute for Health and welfare, Finland, 2011). 18 3.4 Sjukdomens utbredning Tre procent av världens befolkning är infekterad med hepatit C vilket gör den till en av de vanligaste virussjukdomarna. Störst utbredning har viruset i Nildeltat där prevalensen ligger runt tjugo procent. Anledningen till den höga prevalensen i detta område beror på att kontaminerade sprutor användes under en massvaccinering på åttio-talet. I Västeuropa beräknas 5 miljoner individer bära på HCV medan det i Sverige finns cirka 40 000 smittade. Siffrorna anses vara en undervärdering då mörkertalet är stort (Söderholm 2006, s 4). 3.5 Smittvägar HCV är en blodsmitta som främst sprids via blodtransfusioner och användningen av kontaminerade sprutor. Sistnämnda smittväg är idag den absolut vanligaste. HCV kan även smitta genom sexuell kontakt, vertikalt från mor till foster, vid tatuering, bodypiercing och organtransplantationer (Ahlén 2007, s 3). 3.6 Hepatit C inom tandvården När en grupp Japanska forskare undersökte närvaron av HCV i saliven hos kroniskt sjuka hepatit C patienter fann de att förekomsten av HCV i saliven kunde bekräftas i samtliga fall där den sjuke inte stod under 19 behandling. Däremot gick det inte att finna viruset i saliven hos patienter som behandlades för hepatit C (Komiyama et al. 1991, Lancet). I början av nittiotalet gjordes en studie där forskare jämförde förekomsten av HCV hos 456 tandläkare i New York med en kontrollgrupp på 723 personer. De fann då att tandläkare löpte en större risk än befolkningen i övrigt att drabbas av denna sjukdom. (Klein et al. 1991, Lancet). 1999 gjordes en liknande studie i Israel som pekade på att tandläkare som utövade en korrekt utförd infektionskontroll inte löpte större risk att drabbas av HCV än befolkningen i övrigt (Ashkenazi et al. 1999, Community Dent Health). I Sverige finns sedan år 2000 endast fyra bekräftade, yrkesrelaterade fall i vården. Det finns inga data på hur många av dessa som tillhör tandvården (Smittskyddsinstitutet, 2009 http://www.smittskyddsinstitutet.se/statistik/hepatitc/?t=com&p=17553#statistics-nav). Den svenska socialstyrelsen anser att oanvända handskar skyddar väl mot överföring av smitta men skyddet minskar med användningen. Detta då de handskar som används inom tandvården är så pass tunna att de lätt går sönder. I de fall där den kända smittrisken är hög rekommenderas därför dubbla handskar. Byte av handskar och handtvätt mellan varje patient är av största nödvändighet för en effektiv infektionskontroll inom tandvården. Användningen av handskar inom 20 svensk tandvård varierar mellan 60-80% (Socialstyrelsen, 2007 http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2007/2007-123-43). 3.7 Nya framsteg inom vaccinteknik Ett vaccin är ett ämne som stimulerar kroppens immunförsvar till att angripa en sjukdomsalstrande mikroorganism. Genom vaccinering utsätts immunförsvaret för en svag retning. Denna retning skapar i sin tur en beredskap som gör att nästa gång kroppen utsätts för sjukdomen är immunförsvarets celler beredda att försvara sig på ett snabbt och effektivt sätt (Britannica, 2011 http://www.britannica.com/EBchecked/topic/621274/vaccine). Den som redan år 1796 upptäckte och förklarade mekanismerna bakom vaccinering var Edward Jenner. Han lade då märke till att mjölkerskor inte drabbades av smittkoppor i samma utsträckning som andra. Han drog därför slutsatsen att personer som smittats av, den för människor harmlösa sjukdomen, kokoppor i och med detta också blev immuna mot smittkoppor. Jenner framställde därför ett vaccin som bestod av de mikroorganismer som orsakade kokoppor (Roitt 1994, s 23). Trots att Jenner anses vara immunologins fader så var han inte den förste som använde sig av immunisering för att förhindra sjukdom. Det var istället läkare i Asien som var först. De matade barn med skorporna av uttorkade smittkoppor vilket gjorde att barnen blev immuna mot sjukdomen. 21 Tack vare immunologin och vaccinens utveckling har de smittsamma sjukdomarnas utbredning reducerats kraftigt. Bland annat har smittkoppor utrotats och sjukdomar som polio och cholera har blivit allt mer ovanliga (Britannica, 2011 http://www.britannica.com/EBchecked/topic/621274/vaccine). Inom den moderna immunologin används flera olika metoder för att skapa en immunisering. De vacciner som tas fram kan bestå av levande men försvagade mikrorganismer eller avdödade sådana. Det är även vanligt att de består av en komponent som är specifik för den sjukdomsalstrande mikroorganismen, en så kallad antigen. Ett exempel på en sådan antigen är ett gift där den skadliga delen tagits bort medan den del som immunförsvaret uppfattar som farlig finns kvar. De flesta vacciner innehåller också ett eller flera ämnen som förstärker deras aktiva egenskaper. Dessa ämnen kallas adjuvanser och aluminiumsalt är ett exempel på en vanlig sådan (Nationalencyklopedin, 2011 http://www.ne.se/lang/vaccin). Under början av nittiotalet inleddes utvecklingen av de första dnavaccinerna. Eftersom ett DNA-vaccin kan uppnå både en cellulär och en humoral immunitet fästes stora förhoppningar till metoden. DNAvaccinerna ansågs också vara både säkrare och billigare att framställa än traditionella vacciner. 22 Grunden i ett DNA-vaccin består av en plasmid vari det finns infogat en kodad sekvens för ett antigen. När kroppens celler tar upp plasmiden så stimulerar den cellen till transkription och produktion av det antigen som den kodar för. Dessa antigener utsöndras av cellen och fångas senare upp på MHC 2 proteiner på antigenpresenterande celler (APC). Om den antigenproducerande cellen också är en APC så fästs en del av de egenproducerade antigenerna till MHC 1 proteinet på cellens utsida. De antigenpresenterande cellerna för antigenen till en lymfknuta där den presenteras för specifika mördar T-celler vilka snabbt delar på sig och ökar i antal. Detsamma händer när antigenerna presenteras för Thjälpare celler vilka aktiverar, B-cellerna och deras produktion av antikroppar. Till skillnad från ett traditionellt vaccin så skapar dnavaccinet alltså både ett humoralt och ett cellulärt immunsvar (Kutzler et al. 2008, Nat Rev Genet). Trots att DNA-vaccinerna till en början verkade lovande så har framgångarna dröjt. Fram till dagens datum har endast fyra DNA vacciner nått marknaden vilka samtliga är ämnade för djur. Något färdigutvecklat vaccin för människor finns ännu inte på marknaden. Anledningen till detta är att det varit betydligt svårare att framkalla ett immunsvar hos människor och icke mänskliga primater än hos andra djur. Det pågår därför ett intensivt forskande i hur DNA-vaccinen ska kunna optimeras. Exempel på lösningar som forskarna hoppas på är tillsättning av adjuvansmedel, kodonoptimisering och plasmidoptimering (Kutzler et al. 2008, Nat Rev Genet). 23 Det som många anser vara det största problemet är att kroppens celler har svårt att ta upp vaccinet då det administrerats via en traditionell injektion. På grund av detta är mycket av den nuvarande forskningen inriktad på att utveckla ett effektivare administrationsverktyg. Bland de administrationsverktyg som tagits fram vid sidan av elektroporering, som kommer att diskuteras mer ingående i ett senare skedde, finns Biojector som är en nålfri lösning med vilken man kan leverera medicin såväl subkutant som intramuskulärt. Biojectorn avfyrar en koncentrerad stråle av medicinen som penetrerar vävnaden. Än så länge är de resultat som uppnåtts med Biojectorn vid administrering av DNA-vaccin motsägelsefulla och tillräcklig forskning saknas på området. Ett annat verktyg som provats är gene gun som utvecklades för att korsa gener hos plantor. Det var vid användningen av gene gun som forskare för första gången kunde påvisa immunisering via dna-vaccin (Frelin et al. 2010, Drug News & Perspectives). 3.8 Utvecklingen av ett terapeutiskt DNA-vaccin mot HCV En forskargrupp på Karolinska Institutet håller på att utveckla ett terapeutiskt vaccin mot HCV. Eftersom det som karaktäriserar HCVviruset är att det hela tiden muteras så har forskarna letat efter de delar av genomet som inte muteras för att kunna rikta in vaccinet mot dessa. De har då funnit att det icke strukturella (NS)3 proteinet är en region i arvsmassan med låg variabilitet. Detta protein är ovckså nödvändigt för virusets replikation. Utöver detta hindrar NS3 proteinet också värdcellen 24 från att försvara sig. Att NS3 reglerar dessa för viruset så nödvändiga funktioner anses vara anledningen till proteinets höga genetiska stabilitet. Det har visat sig att det räcker med en enstaka mutation hos en epitop i NS3 för att HCV:s replikationsförmåga ska slåss ut. De har därför utvecklat ett genetiskt vaccin som består av NS3/4A genen från en HCV genotyp 1 virusvariant (Ahlén 2007). Eftersom människor inte tar upp dna-vaccin lika effektivt som möss har forskarna valt att använda sig av elektroporering för att på så sätt förbättra upptaget. Studien är för tillfället en avslutad fas 1 studie och några resultat har ännu inte publicerats. 3.9 Elektroporering: en ny vaccinationsteknik Elektroporering av en cell innebär att permeabiliteten och konduktiviteten av cellens membran ökar markant genom tillförande av ett elektriskt fält från en extern källa. Det, idag, huvudsakliga användningsområdet för elektroporering är då molekyler, eller en annan exogen substans, inte kan passera in i en målcell på grund av sin storlek, laddning, sammansättning eller annan egenskap som inte kan förändras. Då kan elektroporering förverkliga transporten av dessa substanser över cellens membran. 25 Elektroporering kommer från grundläggande forskning om elektriska fält och dess påverkan på cellmembran. Sale et al. visade 1968 att cellmembranets isolerande effekt bröts ned och celldöd inträffade då odlade celler utsattes för ett elektriskt fält. Genom modulering av det elektriska fältets egenskaper kan samma effekt uppnås temporärt utan att celldöd inträffar vilket Zimmerman et al. publicerade en studie om 1976 (Escoffre et al. 2009, Mol Biotechnol). Innan försök gjordes på elektroporering och DNA-upptag i en cell gjordes försök där cellens upptag av små molekyler i samband med elektroporering studerades. De små molekylerna migrerar över cellens membran via diffusion medierad av det elektriska fältet (Gehl 2003, Acta Physiol Scand). Det finns ännu ingen bevisad teori om hur cellens upptag av DNA faciliteras av elektroporering, men ett flertal processer är involverade i migreringen av DNA över cellmembranet. I dagsläget har man sett att aggregering av DNA sker innan migreringen och både porer och elektrofores tros ligga bakom den lyckade resan över membranet (Escoffre et al. 2010, Biochim Biophys Acta; Golzio et al. 2002, Proc Natl Acad Sci U S A). En nyligen publicerad studie visar att förändringar sker i cellväggens cytoskelett och fläckar av koncentrerat aktinfilament uppstår på samma lokaler som DNA-aggregaten (Rosazza et al. 2011, Mol Ther). Sammanfattningsvis kan det sägas att migrationen av DNA är 26 mycket mer komplicerad än migrationen av små molekyler och fler studier behövs innan en fullständig teori kan publiceras. 4.0 Syfte Syftet med denna studie är att undersöka de lokala biverkningarna av elektroporering med hjälp av resultat från en klinisk samt en översiktlig litteraturstudie på området. Vi har även studerat människors attityder till dessa biverkningar för att undersöka om de är acceptabla i samband med en vaccinering mot HCV. 5.0 Metod 5.1 Elektroporeringens bieffekter Försökspersonerna fick komma till infektionskliniken på Karolinska Sjukhuset Huddinge vid fyra olika tillfällen för injektion och elektroporering. De kom till kliniken på morgonen, mottog injektionen och stannade sedan över natten. Injiceringen ägde rum i höger m. deltoideus och elektroporeringen följde inom en minut på samma ställe. Vid varje enskilt fall kontrollerades det att m. deltoideus verkligen nåddes samt att det skedde två kontraktioner av muskeln under elektroporeringsfasen. Eventuellt avvikande observeringar noterades 27 vid injektionsstället både före och efter varje vaccination. Strax efter detta ombads deltagarna att svara på ett formulär där de graderade den upplevda smärtan av de två olika momenten med hjälp av en Visuell Analog Skala. VAS (Visuell Analog Skala) är en skala som används i frågeformulär där deltagaren anger hur mycket de håller med ett visst påstående eller uttalande genom att markera ett värde på en skala mellan två punkter. I samband med detta registrerades även rodnad, svullnad, förhårdnad, klåda och utslag hos deltagarna. Mätningarna utfördes åter med intervallerna 0.5, 2, 6, 24h efter administrationstillfället. Försöken upprepades enligt samma procedur vid fyra separata tillfällen med fyra veckors mellanrum. Elektroporering utfördes med Inovios MedPulser®. 5.1.1 Urval och indelning av försökspersoner Nio personer valdes ut för att delta i studien. Deltagarna kvalificerade sig genom att ha ett BMI som var lägre en 30 samt en obehandlad HCV infektion där HCV var av genotyp I och mängden HCV RNA fick inte vara högre än 800 000 IU / ml. Gruppen av försökspersoner som kom att väljas ut bestod sex män och tre kvinnor. Åldern varierade mellan tjugonio till femtiofem år. 28 Deltagarna delades in i tre grupper om tre personer vardera. Den första gruppen (Grupp 1) fick 167 µg av den aktiva dosen medan den andra (Grupp 2) och tredje gruppen (Grupp 3) fick 500 µg respektive 1500 µg. Studien hade prövats och godkänts av etiska kommittén innan försöken påbörjades. 5.2 Enkäten ”No Pain No Gain” Inför enkätundersökningen valdes det webbaserade verktyget Textalk Websurvey för att utföra enkäten och sammanställa resultatet. Verktyget hanterade även massutskicket av email samt påminnelser. Ett mail skickades ut till 2184 emailadresser som tillhörde medlemmar i tjänstetandläkarna. Mailet innehöll en kort presentation av syftet, information om att enkäten var frivillig och att alla svar var anonyma samt en HTML-länk till den webbaserade enkäten. De tillfrågade fick två veckor på sig att svara och efter den första veckan skickades en påminnelse ut till de som inte svarat. Enkäten inleddes med en kort introduktion om HCV, dess följder, smittvägar och tillgänglig behandling. Det gavs också en beskrivning av VAS-skalan och personerna ombads föreställa sig en injektion i m. deltoideus. 29 Enkäten bestod av fyra flervalsfrågor där deltagarna bads gradera hur mycket smärta de upplevde eller var beredda att acceptera vid olika fiktiva scenarier. Graderingen utgick från den tio-gradiga VAS-skalan. Då två veckor hade gått avslutades studien. Resultatet sammanställdes och analyserades med hjälp av ett statistikverktyg i Textalk Websurvey. Frågorna som ingick i enkäten löd enligt följande Fråga 1: Om du tänker dig en injektion hur skulle du gradera den smärtan på VAS-skalan? Fråga 2: Om ett preventivt vaccin mot svininfluensan erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot svininfluensan? Fråga 3: Om ett preventivt vaccin mot Hepatit C erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot Hepatit C? Fråga 4: Om du tänker dig att du blivit smittad av Hepatit C, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att tillfriskna helt? Enkäten utfördes för att skapa ett material som kunde ställas i relation till bieffekterna vid elektroporering. Den första frågan ställdes för att skapa ett indexvärde i förhållande till smärtupplevelsen. I och med 2010 30 års pandemi av svininfluensan och massvaccineringen i samband med denna valdes sjukdomen ut som grund för jämförelse med HCV. Syftet med de sista två frågorna var att ta reda på hur mycket smärta deltagarna var beredda att acceptera för att bli vaccinerade med ett terapeutiskt alternativt preventivt vaccin mot HCV. Beroende på hur deltagarna svarade på fråga 1 i enkäten har de delats in i två grupper. 633 personer angav ett svar på 5 eller lägre och delades in i Grupp A. Resterande, de som istället svarade 6 eller högre på samma fråga, 105 deltagare delades in i Grupp B. 5.3 Litteraturöversikt av intramuskulär elektroporering I syfte att kunna jämföra fynden av lokala biverkningar i samband med elektroporering har vi valt att utföra en litteraturöversikt på samma område. En sökning på PubMed med nyckelordet "electroporation" resulterade i över 7000 träffar. En genomgång av samtliga träffar ansågs dock inte praktiskt genomförbart, istället bestämdes inklusionskriterier och utifrån dessa kunde en söksträng formuleras för sökning på PubMed. De studier som valdes ut för att inkluderas i litteraturstudien uppfyllde följande kriterier; de skulle vara utförda på människor, använda sig av intramuskulär elektroporering samt redovisa deltagarnas subjektiva 31 smärta, eller objektiva lokala symptom, i samband med elektroporeringen. För att filtrera ut de studier som var relevanta för jämförelse användes söksträngen "electropor* AND (adverse OR "side effect*" OR tolera* OR pain)". Resultatet av sökningen granskades manuellt och de studier som inte uppfyllde inklusionskriterierna exkluderades. Utöver dessa studier valde vi även att inkludera testresultat från Inovio:s egna försök. 32 6.0 Resultat 6.1 Elektroporeringens bieffekter 6.1.1 Lokala tecken på inflammation 6.1.1.1 Rodnad Grupp 1 (167 µg) Vid en sammanslagning av datan från de fyra försöken uppträdde rodnad direkt efter administreringen vid 41,26 % av mätningarna. Vid nästa kontroll, trettio minuter senare, fanns en rodnad i 91,5 % av fallen. Vid kontrollen efter två timmar var siffran 49,5 %. I samband med kontrollen sex timmar senare var samma siffra 16,5 %. Efter tjugofyra timmar var rodnaden 24,75%. Grupp 2 (500 µg) Rodnad uppträdde direkt efter administreringen vid 16,5 % av mätningarna. Vid nästa kontroll, trettio minuter senare, fanns en rodnad i 74,75 % av fallen. Vid kontrollen efter två timmar var siffran 49,5 %. I samband med kontrollen sex timmar senare var samma siffra 33,33 % och efter tjugofyra timmar var rodnaden fortfarande densamma. 33 Grupp 3 (1500 µg) Rodnad uppträdde direkt efter administreringen vid 24,75 % av mätningarna. Vid nästa kontroll, trettio minuter senare, fanns en rodnad i 66,25 % av fallen. Vid kontrollen efter två timmar var siffran 33 %. I samband med kontrollen sex timmar senare var samma siffra 8,25 %. Efter tjugofyra timmar var rodnaden också 8,25 %. Vecka 0 Vecka 4 Vecka 8 Vecka 12 h 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 0 2 1 0 1 0 2 2 0 1 0 1 0 0,5 3 1 2 3 2 1 3 3 3 2 3 2 2 2 0 1 2 2 0 1 2 1 1 2 2 6 1 0 0 1 1 0 0 2 0 0 1 1 24 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 2 1 Tabell 1. Rodnad hos försökspersonerna, grupperade veckovis efter dos och tid (n=9). 6.1.1.2 Svullnad Svullnad uppträdde sporadiskt men minst en gång hos minst en deltagare under loppet av tjugofyra timmar vid varje administrationstillfälle. Vecka 0 Vecka 4 Vecka 8 Vecka 12 h 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 0 1 0 1 0 0 0 2 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 6 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 24 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Tabell 2. Svullnad hos försökspersonerna, grupperade veckovis efter dos och tid (n=9). 34 6.1.1.3 Värme Förhöjd temperatur registrerades endast hos en av deltagarna i Grupp 1 vid administrationstillfälle två och tre och varade inte längre än trettio minuter. Vecka 0 Vecka 4 Vecka 8 Vecka 12 h 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0,5 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tabell 3. Värme hos försökspersonerna, grupperade veckovis efter dos och tid (n=9). 6.1.1.4 Blåmärke Blåmärke uppträdde endast vid ett tillfälle hos en av deltagarna. Denna deltagare tillhörde Grupp 1. Märket kunde observeras först efter 6 timmar och kvarstod vid kontrollen ett dygn senare. Vecka 0 Vecka 4 Vecka 8 Vecka 12 h 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 Tabell 4. Blåmärke hos försökspersonerna, grupperade veckovis efter dos och tid (n=9). 35 6.1.1.5 Förhårdnad Förhårdnad kunde observeras vid ett flertal tillfällen men inte hos mer än en deltagare åt gången förutom vid andra administreringstilfället då två deltagare ur Grupp 3 uppvisade symptom. Observationerna var av övergående karaktär och endast vid två tillfällen kunde förhårdnad fortfarande mätas vid kontrollen efter tjugofyra timmar. Inga skillnader mellan grupperna kunde observeras. Vecka 0 Vecka 4 Vecka 8 Vecka 12 h 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 167 500 1500 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0,5 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 1 0 1 0 6 0 1 0 0 0 2 0 0 1 0 1 1 24 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Tabell 5. Förhårdnad hos försökspersonerna, grupperade veckovis efter dos och tid (n=9). 6.1.2 Upplevd smärta 6.1.2.1 Upplevd smärta i samband med injiceringen När deltagarna ombads att gradera, den upplevda smärta vid injiceringen i m. deltoideus varierade svaren mellan noll till fem på VASskalan. Medelvärdet låg på 1,27. Hos en del av försökspersonerna varierade den upplevda smärtan mellan de olika försökstillfällena 36 medan den hos andra var konstant. En person upplevde ingen smärta vid något av tillfällena. Det gick inte att dra några slutsatser om skillnaden i upplevd smärta mellan de olika grupperna. Inte heller gick det att observera någon trend i smärtupplevelsen hos de olika deltagarna. Figur 1. Smärta hos försökspersonerna i samband med injicering, indelade per deltagare och vecka (n=9). 6.1.2.2 Upplevd smärta i samband med elektroporeringen Smärtan vid elektroporeringen var mycket kraftigare än vid injiceringen. Den upplevda smärtan varierade mellan två och åtta på VAS-skalan. Alla 37 deltagare upplevde smärta i samband med elektroporeringen vid samtliga tillfällen. I genomsnitt svarade deltagarna att smärtan från elektroporeringen graderades till 5,22 på VAS-skalan, vilket är ett värde strax över medianen på 5. Någon tydlig skillnad i svaren från de olika grupperna kunde inte ses. Inte heller kunde det observeras någon tendens till att smärtan skulle lindras eller förvärras vartefter studien fortskred. Figur 2. Smärta hos försökspersonerna i samband med elektroporering, indelade per deltagare och vecka (n=9). 38 6.1.2.3 Skillnaden mellan injicering och elektroporering Den genomsnittliga skillnaden av den upplevda smärtan för samtliga deltagare var 3,92 enheter högre, på VAS-skalan, vid elektroporeringen än vid injiceringen. Median för samma värde var fyra. Den individuella skillnaden var dock stor, och varierade mellan två och sju enheter. Det gick inte att se någon tydlig skillnad mellan grupperna. Figur 3. Skillnaden i smärtupplevelse mellan injicering och elektroporering, indelade per deltagare och vecka (n=9). I samtliga fall nåddes m. deltoideus under vaccinationen och två kontraktioner av muskeln kunde noteras i samband med elektroporeringen. Inga avvikande observationer gjordes i anslutning till 39 injektionsstället varken före eller efter administreringen. Samtliga försökspersoner slutförde studien. 6.2 Enkäten “No Pain No Gain” Av de 2184 skickade förfrågningarna, om att frivilligt delta i enkäten “No Pain No Gain”’, studsade 601, av dessa var 395 hårda samt 206 mjuka studsade. Totalt fick 1583 personer mailet leverat till sin epostadress. Av dessa klickade 956 personer på länken till enkäten och 738 gick vidare och svarade på frågorna. Samtliga 738 deltagare svarade på alla frågor i enkäten. Fördelningen av deltagarnas svar på de enskilda frågorna redovisas nedan. Beroende på hur deltagarna svarade på fråga 1 i enkäten har de delats in i två grupper. 633 personer angav ett svar på 5 eller lägre och delades in i Grupp A. Resterande, de som istället svarade 6 eller högre på samma fråga, 105 deltagare delades in i Grupp B. 6.2.1 Fråga 1 Om du tänker dig en injektion hur skulle du gradera den smärtan på VAS-skalan? 40 Figur 4. Deltagarnas svar till fråga 1 ”Om du tänker dig en injektion hur skulle du gradera den smärtan på VAS-skalan?” (n=633). Deltagarnas svar på denna fråga varierade mellan noll och tio. Det var sju deltagare (0,9%) som angav att de inte upplevde någon smärta alls medan tio personer (1,4%) graderade upplevelsen till tio. Den största andelen svarade att de upplevde en injektion som tre på VAS-skalan. Medeltalet var 3,45 medan medianen låg på 3. 105 (14,2 %) av deltagarna angav ett svar som låg på grad sex eller högre. 6.2.2 Fråga 2 Om ett preventivt vaccin mot svininfluensan erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot svininfluensan? 41 Figur 5. Deltagarnas svar till fråga 2 ”Om ett preventivt vaccin mot svininfluensan erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot svininfluensan?” (n=633). Spridningen av svaren låg mellan noll och tio. Det var elva personer ( 1,5% ) som svarade att de inte var beredda att acceptera någon smärta alls medan 90 (12,2%) personer angav ett svar på tio. Det vanligaste svaret var fem vilket 152 personer (20,6%) svarade. Medeltalet låg på 6,28 och och medianen på 6. 42 Figur 6. Deltagarnas svar till fråga 2 ”Om ett preventivt vaccin mot svininfluensan erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot svininfluensan?”, indelade efter Grupp A och Grupp B (n=633). De svar som Grupp A angivit varierade mellan 1 och 10. Medeltalet låg på 6,08 och medianen var 6. Grupp B hade också en spridning mellan 1 och 10. Medeltalet var 7,1 medan medianen låg på 7. 6.2.3 Fråga 3 Om ett preventivt vaccin mot Hepatit C erbjuds, hur stor smärta på VASskalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot Hepatit C? 43 Figur 7. Deltagarnas svar till fråga 3 ”Om ett preventivt vaccin mot Hepatit C erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot Hepatit C?” (n=633). Svaren på denna fråga varierade mellan 1 och 10. Av de som svarade kunde alltså samtliga tänka sig någon form av smärta i samband med vaccineringen. 3 (0,4%) personer kunde endast tänka sig en smärta på 1 medan 189 av deltagarna kunde tänka sig att tolerera en smärta på 10, detta var också det vanligaste svaret. 63 (8,5%) av deltagarna angav 5 eller lägre som högsta tolererbara smärta. Medeltalet var 7,47 och medianen 8. 44 Figur 8. Deltagarnas svar till fråga 3 ”Om ett preventivt vaccin mot Hepatit C erbjuds, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att få ett fullgott skydd mot Hepatit C?”, indelade efter Grupp A och Grupp B (n=633). På denna fråga har Grupp A angivit svar som varierade mellan 1 och 10. Medeltalet för gruppen låg på 7,34 och medianen var 8. Spridningen hos Grupp B låg mellan 4 och 10. Medeltalet för samma grupp var 8,26 medan medianen låg på 8. 45 6.2.4 Fråga 4 Om du tänker dig att du blivit smittad av Hepatit C, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att tillfriskna helt? Figur 9. Deltagarnas svar till fråga 4 ” Om du tänker dig att du blivit smittad av Hepatit C, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att tillfriskna helt?” (n=633). På denna fråga varierade svaren mellan 0 och 10. 1 av deltagarna(0,1%) var ej beredd att ta någon smärta alls medan lejonparten, 468 personer (63,4%), var villiga att uthärda en smärta på 10. 28 personer (3,79%) angav 5 eller lägre som högsta tänkbara smärta. Medeltalet var 9,17 och medianen låg på 10. 46 Figur 10. Deltagarnas svar till fråga 4 ” Om du tänker dig att du blivit smittad av Hepatit C, hur stor smärta på VAS-skalan skulle du tolerera för att tillfriskna helt?”, indelade efter Grupp A och Grupp B (n=633). De svar som Grupp A angivit varierade mellan 1 och 10. Medeltalet låg på 9, 12 och medianen var 10. Svaren på denna fråga för Grupp B låg spridna mellan 0 och 10. Medelvärdet låg på 9,47 medan medianen var 10. 6.3 Litteraturöversikt av intramuskulär elektroporering Sökningen på PubMed resulterade i 297 träffar. Utav dessa var det endast tre studier som uppfyllde inklusionskriterierna. 2009 studerades effekten av elektroporering vid administrering av ett DNA-vaccin mot prostatacancer hos 20 försökspersoner. Inga lokala bieffekter förutom smärta vid injektionsstället noterades. Genomsnittet 47 av försökspersonernas upplevda smärta var 4,38 och medianen låg på 4. Försökspersonerna graderade även smärtan vid en traditionell injicering och medelvärdet för denna data var 1,08. (Low et al. 2009, Human Gene Therapy). Wallace et al. utförde 2008 en klinisk studie där elektroporeringsmaskinen MedPulser® användes. Lokala och systemiska bieffekter registrerades på de 24 friska deltagarna. Utav dessa fullföljde 20 studien vilken bestod av två administreringstillfällen och en uppföljningskontroll. Två av försökspersonerna lämnade studien efter det första administreringstillfället. I det ena fallet berodde detta på en förlängd men mild smärtupplevelse som varade i fem dagar vid injektionsstället medan den andra personen svimmade i samband med elektroporeringen. Två andra personer valde att lämna studien av okända skäl. Utöver tidigare nämnda systemiska biverkningar noterades ytterligare två fall som bestod av en övergående huvudvärk i samband med elektroporeringen. Även lokala bieffekter och tecken på inflammation (se tabell) registrerades vid varje administrering. Den vanligaste bieffekten var smärta, vilken varierade mellan ett och åtta på VAS-skalan. Det sammanslagna medelvärdet för samtliga deltagare vid båda försöken var 5,45. 48 Andra vanliga biverkningar var rodnad, 62.5% av deltagarna, och svullnad, 45.8 % av deltagarna (Wallace et al. 2008, The American Society of Gene Therapy). Vid företaget Inovios egna försök med intramuskulär elektroporering deltog tio personer. I samband med elektroporeringen fick de gradera sin smärta med hjälp av VAS-skalan. Medelvärdet var 6,28 och svaren varierade mellan 3,5 och 9,3. 7.0 Diskussion HCV är en av de vanligaste virussjukdomarna och på grund av dess allvarliga följder för individen finns ett stort behov för en effektiv behandling. Dagens antivirala terapi är dyr, dras med många bieffekter, och är långt ifrån hundraprocentig. En ny behandlingsmetod med mindre bieffekter och bättre lyckandefrekvens är därför önskvärd. Det terapeutiska vaccin som håller på att utvecklas på KI kan förhoppningsvis vara en del av lösningen. För att detta vaccin ska nå sin fulla potential krävs dock att administreringen sker med hjälp av elektroporering. Det är samtidigt viktigt att detta inte görs på allt för stor bekostnad av patientens välbefinnande. Syftet med denna studie har varit att undersöka de lokala bieffekterna av administreringen med hjälp av elektroporering. Data från de första försöken på människor har analyserats och jämförts med data från en 49 översiktlig litteraturstudie av lokala bieffekter vid elektroporering. Med hjälp av en enkätundersökning har vi studerat människors attityder till dessa bieffekter. Resultaten från den avslutade kliniska fas 1 studien ”Phase I/IIa Dose Ranging CHRONVAC-C ® Study in Chronic HCV Patients” visar på milda lokala biverkningar och en varierande men påtaglig smärta i samband med elektroporering. Medelvärdet för smärtan vid elektroporeringen var 5,22 på VAS-skalan medan samma värde vid injicering var 1,27. Den genomsnittliga skillnaden var alltså 3,92 enheter högre för elektroporering. Dessa resultat stämmer väl överens med de symptom som beskrivs i annan tillgänglig forskning. Wallace et al. fick fram ett medelvärde på 5,45 vid elektroporering och Low et al. fick fram ett medelvärde på 4,38 medan företaget Inovio landade på 6,28. Endast Low et al. tog fram ett medelvärde för smärtan vid injicering och detta låg på 1,08, vilket var 3,3 enheter lägre än det för elektroporering vilket överensstämmer med värdena (3,92) från studien av Chronvac-C. I enkätundersökningen ”No Pain No Gain” angavs ett genomsnittligt värde på 3,45 vilket alltså var betydligt högre än värdena från de kliniska försöken. Hänsyn bör dock tas till att dessa personer ej svarade i nära anknytning till en verklig injektion och ej heller kunde ställa den i relation till den betydligt kraftigare smärtan som en elektroporering innebär. Medelvärdet på svaren om hur mycket smärta enkätdeltagarna 50 kunde tänkas acceptera i preventivt och terapeutiskt syfte, avseende HCV, var 7,47 respektive 9,17. På samma fråga avseende ett preventivt vaccin mot svininfluensan var medelvärdet 6,28. 8.0 Slutsatser Smärtan är den enda egentliga biverkning som kan tänkas påverka patienternas villighet att slutföra en behandling som innefattar elektroporering. Det genomsnittliga värdet som enkätdeltagarna var beredda att acceptera var dock högre än det uppmätta värdet i denna och andra befintliga studier. Vi ser därför inga hinder till varför elektroporering som administrationsverktyg vid vaccinering skulle innebära något större hinder för människors beredvillighet att delta i behandlingen. 51 Källförteckning I. Gustaf Ahlén, (2007) Development of a Therapeutic Vaccine Against the Hepatitis C Virus II. Ola Weiland (2011-02-04) Hepatit C – Akut och kronisk http://www.internetmedicin.se/dyn_main.asp?page=159 III. Kazuo Komiyamaa, Itaru Moroa, Yukiko Mastudaa, SyedA. Morshedb, Mikio Nishiokab, Nakanobu Hayashic & Toshio Shikatac, (1991) HCV in saliva of chronic hepatitis patients having dental treatment IV. Klein RS, Freeman K, Taylor PE & Stevens CE, (1991) Occupational risk for hepatitis C virus infection among New York City dentists V. Smittskydsinstitutet (2009) Statistik för hepatit C http://www.smittskyddsinstitutet.se/statistik/hepatitc/?t=com&p=17553#statistics-nav VI. Socialstyrelsen (2007) Handskar i tandvården http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2007/2007-123-43 VII. Britannica (2011) Vaccine http://www.britannica.com/EBchecked/topic/621274/vaccine VIII. IX. Ivan Roitt, (1994) Essential Immunology Eighth Edition Nationalencyklopedin (2011) Vaccin http://www.ne.se/lang/vaccin X. Kutzler MA & Weiner DB, (2008) DNA vaccines: ready for prime time? 52 XI. Lars Frelin, Anette Braß, Gustaf Ahlén, Erwin Daniel Brenndörfer, Margaret Chen & Matti Sällberg, (2010) Electroporation: a Promising Method for the Nonviral Delivery of DNA Vaccines in Humans? XII. Jonas Söderholm, (2006) The hepatitis C Virus and Immune escape: Relation between sequence variations and the in vivo and in vivo functionality of the non-structural 3/4A complex XIII. Lindsey Low, Ann Mander, Katy McCann, David Dearnaley, Torunn Tjelle, Iacob Mathiesen Freda Stevenson & Christian H. Ottensmeier (2009) DNA Vaccination with Electroporation Induces Increased Antibody Responses in Patients with Prostate Cancer XIV. Mark Wallace, Barbara Evans, Sandra Woods, Robin Mogg, Lei Zhang, Adam C Finnefrock, Dietmar Rabussay, Michael Fon, John Mallen, Devan Mehrotra Florian Schödel & Luwy Musey (2008) Tolerability of Two Sequential Electroporation Treatments Using MedPulser DNA Delivery System (DDS) in Healthy Adult XV. Läkemedlsverket (2008) Läkemedelsbehandling av kronisk hepatit C hos vuxna och barn http://www.lakemedelsverket.se/upload/halso-ochsjukvard/behandlingsrekommendationer/REV%20HCV-rek.pdf XVI. Mark S. Sulkowski, Curtis Cooper, Bela Hunyady, Jidong Jia, Pavel Ogurtsov, Markus Peck-Radosavljevic, Mitchell L. Shiffman, Cihan Yurdaydin & Olav Dalgard, (2011) Management of adverse effects of Peg-INF and ribavirin therapy for hepatitis C. 53 XVII. Rosazza C, Escoffre JM, Zumbusch A & Rols MP, (2011) The Actin Cytoskeleton Has an Active Role in the Electrotransfer of Plasmid DNA in Mammalian Cells XVIII. Gehl J, (2003) Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research XIX. Escoffre JM, Portet T, Wasungu L, Teissié J, Dean D & Rols MP, (2009) What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues XX. Golzio M, Teissie J & Rols MP, (2002) Direct visualization at the single-cell level of electrically mediated gene delivery XXI. Escoffre JM, Portet T, Favard C, Teissié J, Dean DS & Rols MP, (2010) Electromediated formation of DNA complexes with cell membranes and its consequences for gene delivery XXII. Johan Storm Munch, Bjørn Helge Johnsen, Ingelin Birkeland, Morten Finne, Torun Utkilen, Tommy Bøe, Gry Mjølhus & Jan Sommerfelt-Pettersen, (2010) A study of the side effects of Pandemrix® influenza (H1N1) vaccine after whole-crew vaccination on board a Norwegian naval vessel. XXIII. Tristan W. Clark, Manish Pareek, Katja Hoschler, Helen Dillon, Karl G. Nicholson, Nicola Groth & Iain Stephenson, (2009) Trial of 2009 influenza A (H1N1) monovalent MF59-adjuvanted vaccine. XXIV. Michael E. Greenberg, Michael H. Lai, Gunter F. Hartel, Christine H. Wichems, Charmaine Gittleson, Jillian Bennet, Gail Dawson, Wilson Hu, Connie Leggio, Diane Washington, & Russell L. Basser, 54 (2009) Response to a monovalent 2009 influenza A (H1N1) vaccine. XXV. National Narcolepsy Task Force Interim Report http://www.thl.fi/thl-client/pdfs/dce182fb-651e-48a1-b0183f774d6d1875