Institutionen för medicinsk
biokemi och mikrobiologi
BMC, Uppsala
Akademiska laboratoriet
Klinisk kemi och farmakologi
Uppsala
Magisterexamen 30hp
Hösten 2008
IRINOTECANTOXICITY RELATED TO GILBERT´S SYNDROME
- COMPARISON OF THREE METHODS FOR GENOTYPING OF UGT1A1 (TA)n
Lena Fredriksson
Biomedicinsk analytiker
Handledare
Mia Wadelius, Läkare, Docent
Gunilla Frenne, Laboratorieingenjör
Akademiska laboratoriet Klinisk kemi och farmakologi Uppsala
SUMMARY
Gilbert’s syndrome (GS) occurs in approximately 10% of the European population. The most
common cause is homozygosity for UGT1A1*28, which is a TA repeat expansion in the
promoter of UGT1A1. It is characterised by intermittent hyperbilirubinemia due to reduced
hepatic activity of the enzyme UDP-glucuronosyl-transferase 1A1(UGT1A1). GS also
alteres the pharmacokinetics of some drugs and increases the risk of drug toxicity. Irinotecan
(Camptosar®, Campto®) is used in metastatic colorectal cancer and the active metabolite is
inactivated by UGT1A1. Studies have shown that GS can be a risk factor for toxicity during
irinotecan therapy.
Three different methods for genotyping of UGT1A1*28 have been tested.
PCR with electrophoresis used for size separation, melting temperature analysis and
fluorescent PCR followed by fragment analysis on a capillary sequencer.
The last method was found to be superior. This method was used for genotyping of patients
with colorectal cancer treated with irinotecan and 5-fluorouracil in the Nordic VI study. A
significant association between UGT1A1 genotype and plasma bilirubin level before the start
of irinotecan treatment was seen (ANOVA p<0.0001). Patients with GS had an overall
increased risk of adverse drug reactions (Fishers Exact test p=0.02).
Gilbert’s syndrome can be diagnosed by genotyping UGT1A1*28 with a
fragment analysis method. Genotyping of UGT1A1*28 can be used to identify patients with
an increased risk of adverse reactions to irinotecan.
NYCKELORD
Fragment analysis, genetic analysis, Gilbert´s syndrome, irinotecan, TATA box,
UDP Glucuronosyl-transferase 1A1, UGT1A1 *28
1
SAMMANFATTNING
Gilberts syndrom (GS) drabbar upp till 10% av befolkningen i Västeuropa. GS beror på
nedsatt aktivitet av enzymet UDP-glukuronosyltransferas 1A1 (UGT1A1) i levern. Den
vanligaste orsaken är att individen är homozygot för en insertion av två baser i promotorn för
genen UGT1A1. Denna genvariant kallas (TA)7TAA eller UGT1A1*28. GS leder till
intermittent stegring av bilirubin vid infektioner, men bilirubinstegring kan förekomma även
utan utlösande agens. GS kan också leda till bilirubinstegring vid viss läkemedelsbehandling.
Irinotekan (Campto®) används vid metastaserande colorektal cancer och dess aktiva
metabolit inaktiveras av UGT1A1. Det finns rapporter om att GS ger ökad risk för toxiska
biverkningar av irinotekan.
Tre metoder för att bestämma UGT1A1 har jämförts: PCR med elfores, PCR
med smältpunktsanalys och PCR med fragmentanalys på sekvensator. Den sista metoden var
bäst och användes för att genotypa UGT1A1 hos patienter med colorektal cancer från Nordic
VI-studien. De behandlades med irinotekan i kombination med bolusinjektion eller infusion
av 5-fluorouracil. Vi fann att patienter med GS hade signifikant högre S-bilirubin före
behandling jämfört med övriga patienter. De hade även ökad frekvens biverkningar av
irinotekan (Fishers exakta test p=0,02).
Genotypning av UGT1A1 kan således användas för att diagnostisera Gilberts
syndrom hos patienter med oförklarad bilirubinstegring. Det kan även användas för att
identifiera patienter med ökad risk för biverkningar av irinotekan.
2
Förkortningar
Bp
baspar
BSA
Bovine serum albumin
FDA
Food and Drug Administration
GS
Gilberts syndrom
PAD
patologisk anatomisk diagnos
PharmGKB Pharmacogenomics knowledge base
SLS
sample loading solution
SN-38
Ethyl-10-hydroxycamptothecin
TBP
TATA-bindande protein
UGT
uridine diphosphate-glucuronosyltransferas
3
1. INTRODUKTION
Gilberts syndrom är en autosomalt recessiv sjukdom som yttrar sig som en lätt till måttlig
stegring av okonjugerat bilirubin utan samtidig leverskada eller hemolys.(1) Typiskt är den
intermittenta stegringen av bilirubin, särskilt efter fasta och infektion. Gilberts syndrom
orsakar också sämre förmåga att bryta ned en del läkemedel som glukuronideras av enzymet
UDP-glukuronosyltransferas 1A1 (UGT1A1), exempelvis östrogen, statiner, buprenorfin och
irinotekan (2-4).
Gilberts syndrom förekommer hos ca 10% av den ursprungliga västeuropeiska
befolkningen och beror på nedsatt aktivitet hos enzymet UGT1A1.(5) Den vanligaste orsaken
är att två baser lagts till i en repetitiv DNA-sekvens i promotorn för UGT1A1 (6). Sekvensen
består av sex TA i repetition (TATA-boxen) och är oftast belägen ca 30 baser uppströms om
transkriptionsstart se fig.1 (7). Insertion av ytterligare ett TA leder till sju TA samt en svans av
TAA, vilket skrivs (TA)7TAA.
Modifierat från Ensembl human genome database (www.ensembl.org).
Fig. 1 TA-insertion i TATA-boxen i promotorn för UGT1A1, som kallas (TA)7TAA eller UGT1A1*28.
4
TATA-boxen är viktig eftersom det TATA-bindande proteinet (TBP) binds dit vid
transkription av genen (7). TBP-komplexet binds bäst till UGT1A1 promotorn om TATAboxen innehåller sex TA (8). En insertion som ger sju TA leder till sämre transkription (9) och
lägre enzymnivåer av UGT1A1 (10) .
Irinotekan (Campto®, Pfizer AB, Sollentuna) är ett cytostatikum som bryts ned via
UGT1A1, se fig. 2 (11). Irinotekan tillhör gruppen topoisomeras-hämmare och används
kombinerat med 5-fluorouracil för behandling av avancerad colorektal cancer (12). När
topoisomeras I hämmas kan cellerna inte replikeras och cancercellerna förhindras därför från
celldelning och tillväxt (13).
Irinotekan verkar framför allt genom den aktiva metaboliten SN-38, som är mer än
hundra gånger mera potent än modersubstansen (11). SN-38 bildas när irinotekan hydrolyseras
av karboxylesteras (11). SN-38 inaktiveras huvudsakligen genom glukuronidering av
UGT1A1, se fig.2 (14). Därefter utsöndras metaboliten i galla och njure.
Modifierat från PharmGKB (www.pharmgkb.org).
Fig.2. Irinotekan metaboliseras till den aktiva metaboliten SN-38, en hämmare av topoisomeras I.
5
Nedsatt UGT1A1-aktivitet medför reducerad kapacitet för glukuronidering och
därmed ökad koncentration av SN-38 (14). De vanligaste koncentrationsberoende
biverkningarna till irinotekan är påverkan på blodbilden och gastrointestinal toxicitet (15).
Några studier har visat att patienter med nedsatt aktivitet av enzymet UGT1A1 löper ökad risk
att drabbas av biverkningar såsom neutropeni och diarré (15-20).
I Nordic VI-studien, som leddes av Prof. Bengt Glimelius vid enheten för Onkologi i
Uppsala, sågs grav toxicitet såsom neutropeni, diarré, illamående och kräkning hos cirka 30%
av de 567 patienter som behandlades med irinotekan och 5-fluorouracil mot avancerad
colorektalcancer (17). Vi fick tillgång till prover från 98 patienter som inkluderades i Nordic
VI-studien i Uppsala och Stockholm. Dessa prover analyserades med avseende på genetisk
variation i promotorregionen för UGT1A1 genen.
Under arbetet med uppsättning av UGT1A1-genotypning testades tre olika metoder:
PCR med elfores, PCR med smältpunktsanalys och PCR med fragmentanalys på sekvensator.
När den bästa metoden valts och satts upp för kliniskt bruk, användes den för att genotypa
UGT1A1 hos cancerpatienter i Nordic VI-studien.
6
2. MATERIAL
De 98 patienterna som analyserades kommer från Nordic VI-studien som pågick från juni
2001 till mars 2004 (21). Information om patienterna såsom ålder, kön, vikt,
läkemedelsbehandling, laboratorievärden för plasma-bilirubin och blodstatus samt uppgift om
biverkningar fanns registrerade i studien.
DNA extraherades från helblod eller om blod inte var tillgängligt från
paraffininbäddade colonbiopsier, som tagits för PAD. För DNA-extraktion från helblod
användes QIA-amp® DNA Blood Mini Kit 250 (QIAGEN GmbH, Tyskland) och för biopsier
användes ”boiling method” enligt Cao et al. (22). Biopsierna var betydligt svårare att extrahera
fram DNA ifrån än blodproverna. Som kontroll för DNA-analysen användes ett prov med
känd genotyp: homozygot för allelen UGT1A1 (TA)7 TAA.
7
3. METODER
3.1 PCR med elfores.
Ett genfragment mångfaldigades med hjälp av PCR. Ett fragment på 98 eller 100 baspar (bp)
amplifierades enligt Monaghan et al. beroende på vilken allel som detekterades (6). Sekvens
för forward primern var (5´-GTC ACG TGA CAC AGT CAA AC-3´) och för reverse primern
(5´- TTT GCT CCT GCC AGA GGTT-3´). Dock användes inte radioaktiv inmärkning, vilket
ingick i ursprungsmetoden. PCR-mastermix innehöll 1X PCR buffert, 1,5 mmol/L MgCl2, 0,2
mmol/L av respektive nukleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,25 µmol/L av respektive
primer (DNA technology A/S, Danmark), 1 U Taq polymeras (Promega, CA, USA) och cirka
150 ng DNA till totalmängd 50 µL. Amplifieringen gjordes på PCR-instrumentet PTC 2000
(M.J. Research, MN, USA) med betingelserna 95oC 5 min, 30 x (95oC 30 s, 58oC 40 s, 72oC
40 s) 72 oC 10 min, 8ºC 10 min.
Fragmenten separerades efter storlek med elektrofores på en 11,6 % polyakryamidgel
enligt Raijmakers et al. (10). Gelen bestod av (38:2 acrylamid/ bisakrylamid) i 1 x TBE och
storleksmarkör var en DNA-stege på 123 bp (Invitrogen, CA, USA). DNA separerades på
gelen (20 x 16 x 0,75mm) vid 280V i 3 timmar i instrumentet PROTEAN II xi Cell (Bio-Rad,
CA, USA) och färgades med etidiumbromid (0,5mg/L) i ca 30 minuter. Gelen fotograferades
med Fluor-S™ Multimager Max (Bio-Rad, CA, USA).
3.2 PCR med smältpunktsanalys
Som utgångspunkt användes en publicerad metod för genotypning av UGT1A1 på
instrumentet GeneAMP 5700 Sequence Detection System (PE Biosystems, CA, USA) (23).
Denna metod är baserad på PCR med smältpunktsanalys. Smältpunkt (Tm) för ett
dubbelsträngat DNA beror på produktens längd och GC- innehåll. För detektion användes en
8
fluorescerande färg, SYBR®Green (Applied Biosystems, CA, USA), som binder till
dubbelsträngat DNA. Fluorescensen mättes kontinuerligt. Efter den sista PCR-cykeln sänktes
temperaturen sakta från 95ºC till 60ºC under 20 minuter. Då enkelsträngat DNA blir
dubbelsträngat ökar fluorescensen och mjukvaran omvandlar fluorescensen till en omvänd
smältpunktskurva.
Metoden för genotypning av UGT1A1 (23) modifierades för att anpassas till
instrumentet PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems, CA, USA). I den nya metoden mättes
dissociation, dvs verklig smältpunkt, eftersom instrumentet har en mjukvara för
dissociationskurvsanalys. Temperaturen höjdes från 60ºC till 95ºC under 20 minuter så att
DNA blev enkelsträngat och fluorescensen minskade.
Sekvensen för forward primer var (5´- ATT AAC TTG GTG TAT CGA TTG GTT
T–3´) och för reverse primer (5´-CAG CAG GCC CAG GAC AA-3´) (23). Mastermixen
innehöll SYBR®Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems, CA, USA): 1 x
SYBR®Green Buffert (Molecular Probes, Invitrogen, CA, USA) och 5,5 mmol/L MgCl2, 5U
AmpliTaq GoldDNA polymerase (Applied Biosystems, CA, USA), 1U amp Erase UNG, 0,3
mmol/L av vardera dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), 50 nmol/L forward primer och 300
nmol/L reverse primer. Mastermix pipetterades i en 96-hålsplatta och 50 ng DNA tillsattes.
PCR betingelserna var 50 °C 2 min, 95°C 10 min, 40 x (94°C 15 s, 60°C 1s). Efter PCR
markerades ”Dissociation Curve” på resultatpanelen och smältpunkts-profilerna visades.
9
3.3 PCR med fragmentanalys I
Denna analys utfördes på sekvensator ABI PRISM®3700 DNA Analyzer (Applied
Biosystems, CA, USA). PCR-metoden utgick från Monaghans publicerade metod (6), men
med tillägg av en fluorescens-märkt primer, BSA (Invitrogen, CA, USA) och optimerad
MgCl2 - koncentration och temperatur. Forward primern var fluorescens-märkt med Hexmarkör (5´Hex- GTC ACG TGA CAC AGT CAA AC-3´) (Thermo Electron Corporation,
MA, USA). Reverse primer sekvensen var (5´-TTT GCT CCT GCC AGA GGT T-3 ) (DNA
technology A/S, Danmark). Slutgiltig PCR-mastermix innehöll 1 x PCR buffert, 2,5 mmol/L
MgCl2, 4 x 0,2 mmol/l dNTP, 0,12 g/L BSA, 0,25 µmol/L av respektive primer, 0,4U Taq
DNA polymeras (Promega, CA, USA) och 50 ng DNA till totalmängd 20 µL.
Amplifiering gjordes på PCR-instrumentet PTC 2000 (M.J. Research, MN, USA)
med betingelserna 95ºC 5 min 30 x (95ºC 30 s, 58ºC 40 s, 72ºC 40 s), 72ºC 10 min, 8ºC 10
min. Analys av PCR-produkten utfördes på Uppsala Genome Center, Rudbecklaboratoriet,
Uppsala. PCR-produkten blandades med storleksstandarden GeneScan-500 Rox spädd i HiDi
Formamide (Applied Biosystems, CA, USA) och proverna denaturerades i 95º C.
Fluorescerande PCR-produkt separerades på en ABI PRISM®3700 DNA Analyzer med
kapillärelektrofores (24). Fragmenten analyserades med mjukvaran GeneScan®v.3.5.
3.4 PCR med fragmentanalys II
Fragmentanalysen flyttades sedan till sekvensatorn CEQ 8000 Genetic Analysis System
(Beckman Coulter, CA, USA) på avdelningen för klinisk kemi och farmakologi, Akademiska
sjukhuset. PCR utfördes enligt Monaghan et al. (6) men med följande ändringar: fluorescensmärkt forward primer med D4 well red (DNA technology A/S, Danmark), BSA (Invitrogen,
CA, USA) och optimerad MgCl2-koncentration. Primer sekvens forward var (5´ D4 - GTC
10
ACG TGA CAC AGT CAA AC-3´) och primer sekvens reverse (5´-TTT GCT CCT GCC
AGA GGT T-3´) (DNA technology A/S, Danmark). PCR-mastermix innehöll 1X PCR
buffert, 2,5 mmol/L MgCl2, 0,2 mmol/L av respektive nukleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
0,12 g/L BSA, 50 nmol/L av respektive primer, 0,4 U Taq polymeras, Go Taq® (Promega,
CA, USA) och 50 ng DNA till totalmängd 20 µL.
Amplifiering gjordes på PCR instrumentet PTC 2000 (M.J. Research, MN, USA)
med program 95ºC 5 min, 30 x (95ºC 30 min, 58ºC 40 s, 72ºC 40 s), 72ºC 10 min, 8ºC 10
min. Amplifierad PCR- produkt separerades därefter efter basparsstorlek med
kapillärelektrofores. Vid separationen användes en mastermix med 40 µL SLS (sample
loading solution) och 0,5 µL DNA size standard 400 bp (GenomeLab™, Beckman Coulter,
CA, USA). Av detta sattes 40 µL i en 96-håls provplatta tillsammans med 2 µL PCR produkt
samt en droppe olja. I 96-håls buffertplatta sattes Separation buffer (GenomeLab™, Beckman
Coulter, CA, USA). En storleksmarkör med annan färg användes. Provplatta och buffertplatta
placerades enligt instruktion för storleksbestämning i CEQ 8000 instrumentet. Efter
separation detekterades fragmenten och bearbetades sedan med fragmentanalysprogram
modifierat för metoden.
3.5 Statistik
Chi2 test for Hardy – Weinberg jämvikt användes för att se om detekterade genotyper hade
förväntad spridning i studien. Vid p > 0,05 ansågs att genotyperna var i balans relaterat till
allelfrekvensen. Variansanalys (ANOVA) användes för att jämföra bilirubinvärden mellan
olika grupper av genotyper. LS means användes för att förklara var skillnaden låg. Fisher’s
exact test användes för att jämföra frekvensen biverkningar mellan genotypgrupper.
11
4. RESULTAT
Nomenklaturen för UGT1A1 genotyp är hädanefter: 6/6 för homozygot (TA)6TAA allel, 7/7
för homozygot (TA)7TAA allel och 6/7 då båda allelerna är representerade, dvs heterozygot
för (TA)6TAA och (TA)7TAA.
4.1 PCR med elfores
PCR reaktion användes för att amplifiera fragment av 98 -100bp. För att separera fragmenten
gjordes elfores på en 11,6% polyakrylamidgel och infärgning med EtBr. Se fig.3.
P1
P2
P3
P4
P5
K2
K1
K3
stege 123 bp
Fig. 3.Resultat av genotyp UGT1A på polyakrylamidgel. Kända kontroller för genotypen 6/6, 6/7 och 7/7 och 5 patientprover är
analyserade. P1-P5 är patientprov (blod) och K1-K3 är kontroller. Längst till höger ses en storleksmarkör
De separerade fragmenten med 98 bp tydde på genotyp 6/6 medan genotyp 7/7 hade en
produkt på 100 bp. Det var dock svårt att särskilja fragment med endast 2 bp.
12
4.2 PCR med smältpunktsanalys
Amplifiering gjordes med fluorescerande färg SYBR®Green, som binder till dubbelsträngat
DNA. Fluorescensen mättes som funktion av temperaturen. DNA blev enkelsträngat när
temperaturen höjdes varvid fluorescensen minskade. När negativa derivatan av fluorescensen
plottades mot temperaturen syntes sekvenser med olika smälttemperaturer som toppar i
diagrammet. Endast DNA från blodprover testades i detta system. Resultaten visas i fig. 4.
•
Genotyp 6/6
•
Genotyp 6/7
•
Genotyp 7/7
(UGT1A1*28)
Fig.4.Resultat av genotyp UGT1A1 med smältpunktsanalys på PRISM 7000. Temperaturen avläses på x-axeln och derivatan på y-axeln.
Smältpunkten(Tm) för genotypen 6/6 (98 bp) var i medeltal 85,8 ºC och för genotypen 6/7
(98/100bp) i medeltal 86,1 ºC. Homozygot 7/7 (100bp) smälte vid i medeltal 86,3 ºC.
Temperaturskillnaden var alltför liten för att analysen skulle vara tillförlitlig. I ett försök att
öka temperaturskillnaden designades nya primers med annealing temperatur nära 60°C i
Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA).Deras specificitet testades i Ensembl
BLAST View. Deras specificitet testades i Ensembl BLAST View. Men deras specificitet var
sämre än de ursprungliga primers och testades därför inte i PCR-analysen.
13
Deleted: ¶
4.3 PCR med fragmentanalys I
PCR gjordes med ena primern fluorescentmärkt. En storleksmarkör med annan fluorescent
färg blandades med PCR-produkten, som separerades med kapillärelektrofores på ABI
PRISM 3700 och storleksbestämdes med fragmentanalys se fig.5.
Fig.5 Kromatomgrammen visar exempel på storleksseparation av baspar med kapillärelektrofores på ABI PRISM 3700. Siffrorna till höger
om topphöjderna visar fluorescenssignalen.
Nittiotre av 98 prov kunde genotypas med denna metod. Genotyper från alla 41
EDTA–blod och 52 av 57 biopsier detekterades. Genotyp UGT1A1 6/6 resulterade i ett
fragment av storleken 96 bp i detta system och 98bp motsvarade genotyp 7/7. Det var dock
svårt att få en bra signal när DNA från biopsiproverna användes.
4.4 PCR med fragmentanalys II
Med kapillärelektrofores på CEQ 8000 Genetic Analysis System separerades PCR-produkten
med avseende på fragmentstorlek. De fluorecensmärkta fragmenten detekteras med
14
fluorecensdetektor och bearbetades med ett fragmentanalysprogram modifierat för UGT1A1
genotyp, se fig. 6.
Fig.6. Resultat från CEQ 8000 Genetic Analysis System av UGT1A1 genotyp. På y-axeln visas fluorescenssignalen och x-axeln visar antal
bp. Den rödmarkerade topphöjden är storleks-markör och den blå är prov med fragment av storleken 98 bp eller 100bp. Kromatogram med
en stor blå topp indikerar homozygot genotyp 6/6 (98bp) eller 7/7 (100bp) och med två toppar ses heterozygot genotyp 6/7.
15
Med hjälp av denna fragmentanalys på CEQ 8000 Genetic Analysis System kunde alla 41
blodprov och 54 utav 57 biopsier genotypas, se fig.7. Chi2 test for Hardy – Weinbergjämvikt
gav p~ 0,55 och anger att genotyperna är i balans, dvs. att man hade en förväntad fördelning
av allelerna i detta material från Nordic VI studien.
60
50
5 2%
4 2%
Antal
40
30
20
10
6%
0
6/6.
6/7.
7/7.
U G T 1A 1 (T A )n T A A
Fig.7. Y-axeln visar antal individer och x-axeln genotyp UGT1A1 (TA)n.
Sex av 95 patienter var homozygota för UGT1A1*28 (7/7). De hade således anlag för Gilberts
syndrom. Fyrtio patienter hade genotypen 6/7 och 49 hade genotypen 6/6.
16
Genotyper av UGT1A1 sammanställdes med Nordic VI-patienternas bilirubinvärden före
behandling. Ett signifikant samband mellan UGT1A1- genotyp och bilirubinvärde visades, se
fig. 8. Skillnaden berodde på att gruppen med 7/7 hade högre bilirubinvärden jämfört med 6/6
och 6/7 (LS means p< 0.0001 respektive p= 0.0001).
S-Bilirubin µmol/L ( 95% CI )
2
2
1
1
5
0
6/6
6/7
7/7
UGT1A1 (TA)nTAA
Fig 8. S-bilirubinvärde är plottat mot genotyperna UGT1A1(TA) n på x-axeln. Y-felstaplar visar det 95%-iga konfidensintervallet för
bilirubinvärdena. S-Bilirubin skiljer sig signifikant mellan genotyperna (ANOVA p<0.0001).
Det fanns även ett samband mellan UGT1A1-genotyp och risk för biverkningar av
behandlingen. Frekvensen biverkningar skiljde sig signifikant mellan de olika genotyperna
(Fishers exakta test p=0.0176). Tabell 1 visar att flera biverkningar förekom hos patienter
med minst en 7-allel (Fishers exakta test p=0.0076). Inget samband mellan genotyp och diarré
eller blodbiverkningar sågs dock (Fishers exakta test p=0,4204 respektive p=0,4052).
Tabell 1
Genotyp UGT1A1
6/6
6/7
7/7
Biverkan, antal individer
17 (35%)
25 (63%)
4 (67%)
Ej biverkan, antal individer
32 (65%)
15 (37%)
2 (33%)
Totalt antal individer
49 (100%)
40 (100%)
6 (100%)
17
5. DISKUSSION
För att detektera bärare av Gilberts syndrom måste man kunna särskilja fragment med två
baspars skillnad i en repetitiv sekvens. Detta var svårt och gav tillfälle till att testa flera PCRmetoder. Jag ska här diskutera metodernas för- och nackdelar i den ordning som de testades.
Den första metoden som testades var PCR med elfores på polyakrylamidgel (6). I ursprungsmetoden av Monaghan et al. (6) användes radioaktivt märkta primers, vilket
möjliggjorde separation av PCR-fragment med två baspars skillnad. Vi saknar utrustning för
avläsning av radioaktivitet på avdelningen för klinisk kemi och farmakologi varför metoden
prövades utan radioaktivitet. PCR-metoden optimerades med avseende på koncentrationer av
polyakrylamidgel- , spänning samt tider för elfores. Vid avläsning i UV-ljus blev dock
separationen av PCR-fragmenten otillräcklig och resultaten blev ej tillförlitliga.
Den andra metoden som testades var PCR med smältpunktsanalys (Tm) då det redan
fanns en PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems, CA, USA) på laboratoriet. Enligt en
tidigare publikation av Marziliano et al. är detta en snabb och mycket enkel metod (23). Jag
fann emellertid att skillnaden i smältpunkt mellan de olika genotyperna var för liten och
reproducerbarheten var ej acceptabel för att användas som metod i kliniskt bruk. Metoden
optimerades med avseende på mängden DNA, mastermix och primers. Jag försökte även
designa nya bättre primers, men trots detta var det omöjligt att ange rätt genotyp på ett
pålitligt sätt. Våra antaganden om att denna metod inte kunde användas som rutinanalys i
kliniskt bruk stärktes sedermera av en artikel skriven av von Ahsen et al. (25), där de säger
“Variation in the purity or amount of DNA in the assay can lead to different amounts of DNA
after a constant number of PCR cycles. In the described assay (23) this will add to the total
error and will cause variation in the (Tm) with the risk of wrong genotyping results. This is not
acceptable for a genotyping assay, and we recommend the use of more specific methods for
allele assignment” (25).
18
Den tredje metoden, PCR med fragmentanalys, utgick från Monaghans primers (6),
men PCR-fragmenten detekterades på en DNA-sekvensator (24). Till att börja med utfördes
PCR på vår avdelning, medan storleksbestämning utfördes på en ABI-sekvensator på
Rudbecklaboratoriet. Vi kunde genotypa de flesta proverna med denna metod och
reproducerbarheten var god. Signalerna var dock ganska svaga och kurvorna ej lättolkade.
Trots detta var fragmentanalys på ABI-sekvensatorn den bästa metoden hittills.
På avdelningen för klinisk kemi och farmakologi har vi tillgång till en Beckman
Coulter-sekvensator. Under arbetets gång blev instrumentet uppgraderat med ny mjukvara för
att kunna analysera skillnader i fragmentstorlek. När metoden satts upp, optimerats och
anpassats för våra fragmentstorlekar gav den mycket tydliga toppar med god
reproducerbarhet. Detta var utan tvivel den tillförlitligaste metoden för analys av UGT1A1
och den användes för att analysera prov från Nordic VI studien. För knappt hälften av
patienterna hade vi tillgång till blodprover som gav DNA av bra kvalité. Samtliga dessa
patienter kunde analyseras med vår metod. För resten av patienterna hade vi endast tillgång
till paraffininbäddade colonbiopsier. Vi använde en ”boiling method” för DNA extraktion av
dem (22). Det var emellertid svårt att få fram tillräckligt långa DNA-fragment från det
degraderade DNAt i de paraffin-inbäddade biopsierna. Efter mycket arbete med att optimera
PCR-metoden kunde till slut 54 av 57 colonbiopsier genotypas.
I Nordic VI studien var frekvensen bärare av Gilberts syndrom (6%) lägre än i en
studie av 248 friska svenskar (10%) (26). Detta kan förklaras av att patienter med höga
bilirubinvärden hade exkluderats från deltagande i Nordic VI studien. Det låga antalet 7/7
gjorde att de statistiska beräkningarna blev mer osäkra. Ett signifikant samband mellan 7/7
och höga bilirubinvärden sågs dock. Bärare av 7-allelen hade även ökad frekvens
biverkningar av behandlingen. För att få bättre statistiska beräkningar har vi samlat in
ytterligare 48 prov från den norska delen av Nordic VI-studien, som kommer att analyseras.
19
Det finns ett antal studier som antyder att individer med Gilberts syndrom har ökad
risk för toxiska reaktioner av läkemedel som metaboliseras via UGT1A1, ex. östrogener,
statiner, buprenorfen, irinotekan och även atazanavir (27-28). På grund av denna risk för ökad
toxicitet bör individer med Gilberts syndrom inte delta i tidiga studier av läkemedel.
Diagnosen GS brukar vara baserad på förhöjt bilirubin och samtidigt normalt antal leukocyter
och retikulocyter. En svensk publikation visar att förhöjt bilirubin kan vara tillräckligt för att
ställa diagnosen Gilberts syndrom hos män, men att kvinnor som genetiskt har Gilberts
syndrom kan ha normalt bilirubin (26). Detta tyder på att man bör framförallt genotypa
kvinnor för att ställa diagnosen Gilberts syndrom och att det har betydelse för design och
urval av försökspersoner vid läkemedelsstudier.
År 2005 ändrades rekommendationen för irinotekanbehandling från den
Amerikanska kontrollmyndigheten (FDA) (29). Innan insättning av irinotekan rekommenderas
nu i USA att patienter genotypas för UGT1A1*28 och att man bör överväga sänkt dos hos
patienter med GS (30-31). Rekommendation om sänkt dos hos patienter med GS har ännu inte
genomförts i Sverige, men skulle sannolikt medföra vinster i form av färre biverkningar och
lägre kostnader för sjukvården.
Sedan hösten 2006 finns UGT1A1 *28, genotyp som rutinanalys på Akademiska
Laboratoriet, Klinisk kemi och farmakologi ” Ny analys för Gilberts syndrom – UGT1A1*28”
(32).
20
6. REFERENSER
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Hirschfield GM, Alexander GJ. Gilbert's syndrome: an overview for clinical biochemists. Ann Clin
Biochem. Sep 2006;43(Pt 5):340-343.
Fisher MB, Paine MF, Strelevitz TJ, Wrighton SA. The role of hepatic and extrahepatic UDPglucuronosyltransferases in human drug metabolism. Drug Metab Rev. Aug-Nov 2001;33(3-4):273297.
Kuehl GE,Lampe JV, Potter JD, et al. Glucuronidation of nonsteroidal anti-inflammatory drugs:
identifying the enzymes responsible in human liver microsomes. Drug Metab Dispos. 2002;33:10271035
Prueksaritanont T, Subramanian R, Fang X, et al. Glucuronidation of statins in animals and humans: a
novel mechanism of statin lactonization. Drug Metab Dispos. May 2002;30(5):505-512.
Burchell B, Hume R. Molecular genetic basis of Gilbert's syndrome. J Gastroenterol Hepatol. Oct
1999;14(10):960-966.
Monaghan G, Ryan M, Seddon R, Hume R, Burchell B. Genetic variation in bilirubin UPDglucuronosyltransferase gene promoter and Gilbert's syndrome. Lancet. Mar 2 1996;347(9001):578581.
Griffiths AJF, Wessler SR, Lewontin RC, Gelbart WM, Suzuki DT, Miller JH. An introduction to
genetic analysis. 8th ed. New York: Freeman; 2004.
Hsieh TY, Shiu TY, Huang SM, et al. Molecular pathogenesis of Gilbert's syndrome: decreased TATAbinding protein binding affinity of UGT1A1 gene promoter. Pharmacogenet Genomics. Apr
2007;17(4):229-236.
Bosma PJ, Chowdhury JR, Bakker C, et al. The genetic basis of the reduced expression of bilirubin
UDP-glucuronosyltransferase 1 in Gilbert's syndrome. N Engl J Med. Nov 2 1995;333(18):1171-1175.
Raijmakers MT, Jansen PL, Steegers EA, Peters WH. Association of human liver bilirubin UDPglucuronyltransferase activity with a polymorphism in the promoter region of the UGT1A1 gene. J
Hepatol. Sep 2000;33(3):348-351.
Iyer L, King CD, Whitington PF, et al. Genetic predisposition to the metabolism of irinotecan (CPT11). Role of uridine diphosphate glucuronosyltransferase isoform 1A1 in the glucuronidation of its
active metabolite (SN-38) in human liver microsomes. J Clin Invest. Feb 15 1998;101(4):847-854.
Glimelius B. Benefit-risk assessment of irinotecan in advanced colorectal cancer. Drug Saf.
2005;28(5):417-433.
Slichenmyer WJ, Von Hoff DD. New natural products in cancer chemotherapy. J Clin Pharmacol. Sep
1990;30(9):770-788.
Iyer L, Hall D, Das S, et al. Phenotype-genotype correlation of in vitro SN-38 (active metabolite of
irinotecan) and bilirubin glucuronidation in human liver tissue with UGT1A1 promoter polymorphism.
Clin Pharmacol Ther. May 1999;65(5):576-582.
Iyer L, Das S, Janisch L, et al. UGT1A1*28 polymorphism as a determinant of irinotecan disposition
and toxicity. Pharmacogenomics J. 2002;2(1):43-47.
Ando Y, Saka H, Ando M, et al. Polymorphisms of UDP-glucuronosyltransferase gene and irinotecan
toxicity: a pharmacogenetic analysis. Cancer Res. Dec 15 2000;60(24):6921-6926.
Glimelius B., Sørbye H., Balteskard L., Byström P., Pfeiffer P., Tveit K., Heikkilä R., Keldsen N.,
Albertsson M., Starkhammar H., Garmo H.,Å. Berglund
A randomized phase III multicenter trial comparing irinotecan in combination with the Nordic bolus 5FU and folinic acid schedule or the bolus/infused de Gramont schedule (Lv5FU2) in patients with
metastatic colorectal cancer. Annals of Oncology Advance Access published January 21, 2008
18.
19 .
20.
21.
22.
Marcuello E, Altes A, Menoyo A, Del Rio E, Gomez-Pardo M, Baiget M. UGT1A1 gene variations and
irinotecan treatment in patients with metastatic colorectal cancer. Br J Cancer. Aug 16 2004;91(4):678682
Toffoli G, Cecchin E, Corona G, et al. The role of UGT1A1*28 polymorphism in the
pharmacodynamics and pharmacokinetics of irinotecan in patients with metastatic colorectal cancer. J
Clin Oncol. Jul 1 2006;24(19):3061-3068.
Innocenti F, Undevia SD, Iyer L, et al. Genetic variants in the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 gene
predict the risk of severe neutropenia of irinotecan. J Clin Oncol. Apr 15 2004;22(8):1382-1388.
Glimelius B, Ristamaki R, Kjaer M, et al. Irinotecan combined with bolus 5-fluorouracil and folinic
acid Nordic schedule as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Ann Oncol. Dec
2002;13(12):1868-1873
Cao W, Hashibe M, Rao JY, Morgenstern H, Zhang ZF. Comparison of methods for DNA extraction
from paraffin-embedded tissues and buccal cells. Cancer Detect Prev. 2003;27(5):397-404.
21
23.
24.
25.
26.
27.
Marziliano N, Pelo E, Minuti B, Passerini I, Torricelli F, Da Prato L. Melting temperature assay for a
UGT1A gene variant in Gilbert syndrome. Clin Chem. Mar 2000;46(3):423-425.
Liu M-S, Chen Albert F-T, Rapid analysis of amplified double-stranded DNA by capillary
electrophoresis with laser-induced fluorescence detection Clin Chem. 1996 ;42(7):1106-.
von Ahsen N, Oellerich M, Schutz E. Limitations of genotyping based on amplicon melting
temperature. Clin Chem. 2001;47(7):1331-1332.
Mercke Odeberg J, Andrade J, Holmberg K, Hoglund P, Malmqvist U, Odeberg J. UGT1A
polymorphisms in a Swedish cohort and a human diversity panel, and the relation to bilirubin plasma
levels in males and females. Eur J Clin Pharmacol. Aug 15 2006.
Rotger M, Taffé P,Bleiber G et al. Gilbert Syndrome and the development of Antiretroviral TherapyAssociated Hyperbilirubinemia. JID. Oct 2005:192 1381-6
28.
Srassburg P C, Pharmacogenetics of Gilbert Syndrome. Pharmacogenomics J. 2008 ;
9(6):703-715.
29.
30.
http://www.fda.gov/cder/foi/label/2005/020571s024,027,028lbl.pdf
Perera A M, Innocenti F, et al. Pharmacogenetic testing for Uridine Diphosphate
Glucuronosyltransferase 1A1 poolymorphismism: Are we there yet? Pharmacotherapy 2008;28(6)755768.
Hoskins M J, Goldberg M R, et al. UGT1A1*28 Genotype and Irinotecaninduced neutropenia: Dose matters. J Natl. Cancer Inst.2007;99:1290”Nytt från Klinisk kemi och farmakologi, Akademiska laboratoriet, Uppsala Nr. 11/06 2006-10-24.
31.
32.
22
TACK
Jag tackar mina handledare Mia Wadelius som fick mig att påbörja och även avsluta detta
arbete och för mycket noggrann vägledning och stor kunnighet och Gunilla Frenne för alla
kloka och praktiska inlägg under upparbetning av metoden och som alltid såg en lösning på
problemen.
Jag tackar för ekonomiskt anslag från Lions cancerforskningsfond och även
Programkommitén för Biomedicinska analytikerprogrammet ”medel för vetenskaplig
kompitensutveckling av Biomedicinska analytiker 2005-2006”.
Bengt Glimelius, Åke Berglund OTM – divisionen Akademiska sjukhuset Uppsala och Per
Byström Radiumhemmet Karolinska Universitets sjukhuset Stockholm för tillgång till
patientmaterial och kliniska data. Mattias Berglund Onkologi, Instutitionen för ORKI,
Rudbecklaboratoriet, Uppsala och Hugo Kohnke Klinisk kemi och farmakologi, Akademiska
Laboratoriet, Akademiska sjukhuset Uppsala för framtagning av DNA från biopsier och
kloka inlägg under arbetets gång. Uppsala Genome Center, Rudbecklaboratoriet, Uppsala för
teknisk hjälp.
Niclas Eriksson – Regional Onkologiskt Center Uppsala för statistiska beräkningar. Agneta
Trulson Medicinska vetenskapen och Klinisk kemi och farmakologi, Akademiska
Laboratoriet, Akademiska sjukhuset Uppsala för all tillgänglighet med att bolla idéer. Sist
men inte minst vill jag tacka Lars-Olof Hansson ,Klinisk kemi och farmakologi, Akademiska
Laboratoriet, Akademiska sjukhuset Uppsala, som gav mig möjlighet att under en period
jobba med detta arbete.
23
