Bestäm koncentrationen av ett ämne
med UV/Vis-spektrofotometri
Niklas Dahrén
UV/Vis-spektrofotometri
ü
ü
ü
ü
Sy$et med spektrofotometri är a% mäta koncentra-onen av e% ämne i en lösning. Det sker genom a% vi bestrålar lösningen med ultraviole% eller visuellt ljus (beroende på vilken typ av ljus ämnet kan absorbera) och får ut e% ”absorbansvärde”. Desto mer ljus koncentra-on finns det av ämnet. som absorberas av lösningen desto högre UV= Ultraviole% ljus (korta våglängder som våra ögon ej kan uppfa%a). Vis= Visuellt ljus (medellånga våglängder som våra ögon kan uppfa%a). UV/Vis-­‐spektrofotometri u6örs med en UV/Vis-­‐spektrofotometer. UV/Vis-spektrofotometerns uppbyggnad
Ljuskälla Monokromator Kyve: (med provet som ska undersökas) Detektor Principen bakom UV/Vis-spektrofotometri
ü En ljuskälla skickar ut ljus mot kyve:en där provlösningen med ämnet finns. Ämnets molekyler absorberar en stor del av det ljus som åker in i kyve%en. Desto fler molekyler (högre koncentra-on av ämnet) desto mer ljus absorberas. Kyve% med provlösning 0,38 Detektor ü Detektorn registrerar transmi:ansen vilket är den andel ljus som tar sig igenom och träffar detektorn. Detektorn kan sedan u-från transmi%ansen beräkna absorbansen. Från detektorn får vi ett absorbansvärde
och räknar 1. Detektorn registrerar det ljus som träffar detektorn sedan ut transmi%ansen med följande formel: I1: Den mängd ljus som tar sig igenom kyve%en och träffar detektorn. I0: Den mängd ljus som skickades in i kyve%en. I0 2. Detektorn räknar sedan ut absorbansen med följande formel: Kyve% med provlösning 0,38 I1 Detektor Vårt exempel: T: 3/7= 0,42= 42 % -­‐log(0,42)= 0,38 T = 0,42 %T = 42 % A = 0,38 Monokromatorns funktion
ü En monokromator innehåller e: vridbart prisma och en spalt: Prismat delar upp det vita ljuset, Spalten gör a% bara en enda våglängd passerar som kommer från ljuskällan, i alla dess våglängder. ut ur monokromatorn. När vi ställer in spektrofotometern på en viss våglängd så vrider vi prismat så a% rä% våglängd ”slinker” ut genom spalten! ü
Vi ställer in monokromatorn på den våglängd a v ljuset som ämnet är bäst på a% absorbera. Varje ämne har en specifik våglängd som ämnet absorberar bäst. ü Monokromatorn filtrerar alltså bort de oönskade våglängderna och släpper enbart igenom den våglängd vi har ställt in den på. Absorbansvärdet är proportionerligt mot
koncentrationen
Absorbans KoncentraWon En högre koncentration av ämnet ger ett högre
absorbansvärde
Kyve% med provlösning Uträkning av absorbansvärdet: T: 1/7= 0,14= 14 % -­‐log(0,14)= 0,85 0,85 Detektor T = 0,14 %T = 14 % A = 0,85 Men hur vet vi den exakta koncentrationen? ü När vi mä:e vårt ämne fick vi absorbansvärdet 0,38. Men vad innebär e% absorbansvärde på 0,38 i koncentra-on? Vi vet bara a% e% högt absorbansvärde innebär en hög koncentra-on och tvärtom. Vi vet däremot inte den exakta koncentra-onen. För a% ta reda på det måste vi jämföra med absorbansen från prover med kända koncentra-oner. ü Vi blandar därför Wll e: antal, ca 4-­‐6 st, ”standardlösningar” Standard-­‐ KoncentraWon: (eller kalibreringslösningar) med kända koncentra-oner av ämnet lösningar: (kallas o_a för en ”standardserie”). Koncentra-onerna av dessa Prov 1 0,625 % bör ligga inom e% rimligt intervall. Prov 2 1,25 % Om en Prov 3 2,5 % ü Vi mäter sedan absorbansen av dessa kända prover. standardlösning med känd koncentra-on också h ar Prov 4 5 % absorbansvärdet 0,38 så borde vårt prov ha samma koncentra-on som denna standardlösning! Vi jämför vårt erhållna absorbansvärde med
absorbansvärdet från standardlösningarna vi fick när vi mä%e våra standardlösningar ü Nedanstående tabell visar de absorbansvärdena med kända koncentra-oner (vår standardserie). Lösningarnas uppmä:a absorbansvärden: Prov 1 0,625 % 0,11 Prov 2 1,25 % 0,21 Prov 3 2,5 % 0,38 Prov 4 5 % 0,79 ü Fråga: Vilken är koncentra-onen av vårt okända prov om absorbansen av provet var 0,38? Standard-­‐
lösningar: KoncentraWon: ü Lösning: Genom a% jämföra vårt prov med dessa värden kan vi lista ut den okända koncentra-onen. Tabellen visar a% absorbansvärdet 0,38 motsvarar koncentra-onen 2,5 %. Men vad gör vi om absorbansvärdet inte
matchar? ü
ü
ü
Vad gör vi om vårt uppmä:a absorbansvärde inte exakt matchar absorbansvärdet från något av våra kända prover. Exempel: Om absorbansvärdet från vårt prov är 0,30. Vad gör vi då? Lösning: Vi gör en standardkurva som baseras på våra standardlösningar med kända koncentra-oner! Vi gör en ”standardkurva” med värdena från
standardlösningarna
Absorbans 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 1 % 2 % 3 % Proverna: KoncentraWon: Absorbans: Prov 1 0,625 % 0,11 Prov 2 1,25 % 0,21 Prov 3 2,5 % 0,38 Prov 4 5 % 0,79 4 % 5 % KoncentraWon Vi använder standardkurvan för att ta reda på
den okända koncentrationen
Absorbans 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 1 % 2 % Tillvägagångssä:: 1. Läs av det uppmä%a absorbansvärdet på y-­‐axeln. 2. Dra e% streck från y-­‐axeln -ll standardkurvan. 3. Dra e% streck från standardkurvan rakt ner -ll x-­‐axeln. 4. Läs av koncentra-onen. 3 % 4 % 5 % Svar: 2 % KoncentraWon ”Lambert-Beers lag” visar sambandet mellan
absorbans och koncentration
Om exWnkWonskoefficienten är känd kan ”Lambert-­‐Beers lag” användas för a% beräkna oncentra-onen för a% A = λ cl Ak=
− logistället T
10
göra en standardkurva (i prak-ken föredrar man dock o_ast a% göra en standardkurva). A = Absorbansen. ε= ”Molära ex-nk-onskoefficienten”, den är specifik för det ämne som undersöks och är e% värde på hur bra ämnet är på a% absorbera ljus vid en viss specifik våglängd. c= Koncentra-onen av ämnet i kyve%en. ε
l= Kyve%ens längd, o_ast 1 cm (den sträcka ljusets färdas genom kyve%en). Se gärna fler filmer av Niklas Dahrén: h:p://www.youtube.com/KemilekWoner h:p://www.youtube.com/MedicinlekWoner
