Spectroskopi

Molekylspektra
De olika färgerna
representerar olika
koncentrationer
Spectroskopi
1. Molekylspektroskopi
uv/vis
Absorptionsspektrometri
infraröd
(filterfotometri, fotospektrometri)
Nefelometri (turbidimetri)
Emissionsspektrometri
(fotoluminescens)
fluorescens
(fosforescens)
Spektroskopi
• 2. Atomspektrometri
Atomabsorption
Atomemission
Röntgenfluorescens
• 3 NMR-spektroskopi
(kärn-magnetisk resonans)
Atom - molekyl
Elektronövergång
n – s*
3p
storlek 2 - 6 eV
Vibration
2s
0,1 –0,01 eV
Rotation
C:a 0,001 eV
AtomAbsorptionsSpektrometri
(AAS)
FlamEmissionSpektrometri
(FES)
Atomspektrum
Absorption
Emission
Natrium-atom
Natrium-atom
Spektrum
våglängd
våglängd
Ljusabsorption i atom
Exitation
E1
Relaxation (de-exitation)
Exiterad
nivå
Ef = hc/l
DE = Ef
E0
E1
Exiterad
nivå
DE = Ef
Grund
nivå
E0
Strålningslös
övergång
Grund
nivå
Användningsområden för
atomspektroskopi
• Identifikation av metalljoner (Na, K,
Cu , Hg,…,
• Koncentrationsbestämningar av metalljoner
i kroppsvätskor
Alternativ metod är jon-selektiv elektrod (jmf
pH-elektrod)
Molekylabsorptionsspektrometri
UV/VIS
Absorption i molekyl
Transmittans
Absorbans (= -log T)
1
10%
Våglängd
560
560
Våglängd
Ljusabsorption i molekyl
Exitation
Relaxation (de-exitation)
E1
Strålningslös
övergång
Ef = hc/l
DE = Ef
E0
Grund
nivå
DE = Ef
Grund
nivå
Absorptionsspektroskopi
Filter
Vitt
Transmittans
ljus
Prov
100%
35%
100%
Vatten
35%
våglängd
Absorptionsspektroskopi
Transmittans
Prov
I0
I
100%
35%
(I= 0,35*I0)
100%
Absorbans
Prov
I0
a
35%
I
I = I0* 10-A
A = 0,456
våglängd
Absorptionsspektroskopi
Absorbans
Prov
I0
I
våglängd
I = I0* 10-A
scanning
Absorbans
Prov
I0
I
c
c
Samma våglängd
Absorbans - Transmittans
Absorbans - Transmittans
Konc
A
T
1,2
0,1 0,794
2
0,2 0,631
3
0,3 0,501
4
0,4 0,398
5
0,5 0,316
6
0,6 0,251
7
8
9
10
0,7
0,2
0,8 0,158
0,9 0,126
1
0,1
1
Abs/Trans
1
0,8
A
0,6
T
0,4
0,2
0
0
2
4
6
Koncentration
8
10
12
Absorptionsspektroskopi
Koncetration
Absorbans
Prov
I0
a
c1
I
A2
A1
c1
c2
a
c2
c
Absorptionsspektroskopi
Kyvettbredd
Absorbans
Prov
I0
I
b1
A2
A1
b1
b2
b2
c
Absorptionsspektroskopi
Absorptionskefficient
Absorbans
a1 (A (Max))
Prov
I0
I
a2
a1
våglängd
I = I0* 10-A
scanning
Absorbans
Prov
I0
I
a2
a1
a2
c
Mätt vid olika våglängd
Ex. på Extinktionskoeffcient/
Molar absorptionskoefficient
(a eller  )
Ämne Molär absorptivitet vid 335 nm (M-1 cm-1)
N-trans-cinnamoylimidazol 9370
α-Chymotrypsin 100
N-trans-cinnamoyl-α-chymotrypsin 520
Ex. Vilken absorbans har 1mM av (N-trans cinn….)
A = 520 * 0,001*1 = 0,520
Lambert-Beer´s lag
Höga absorbansvärden
A
C
Användningsområden av
molekylspektroskopi(UV/VIS)
• Koncentrationsbestämningar av lösningar
och gaser, tex. Hb-bestämning, proteinbestämning, (alla lösningar som absorberar
ljus i UV eller Visuella området.)
• Kinetiska studier
Kromoforer (ex)
• Dubbel och trippel-bindningar
• Aromatiska ringar
proteiner Phe, Tyr, Trp,His (280nm)
• Nukleotider C,G,A,T (260nm)
Spektrofotometri
• Filterfotometer
Spektrofotometri
• Spektrofotomer
Infraröd spektrometri
IR
Molekylens vibrations- och
rotationsnivåer
acetophenone
Vibration
0,1 –0,01 eV
Rotation
C:a 0,001 eV
Absorption inom infraröda
området
E1
DE = Ef
Ef = hc/l
Exitation
Grund
nivå
E0
DE = Ef
Relaxation
Strålningslös
övergång
Grund
nivå
>= 3000 cm-1
single bond stretch
eg. C-H, O-H, and N-H
2000 - 2500 cm-1
triple bond stretch
eg. acetylenes, carbenes
and nitriles
1500 - 2000 cm-1
double bond stretch
eg. carbonyls (C=O) or
alkenes (C=C)
"fingerprint" region
various coupled stretch
and deformation bands
Fluorescensspektrometri
Användningsområden
flourescens
• Bestämning av låga koncentrationer
• Bestämning av molekylers massa
• Immunologiska bestämningar
Luciferin-luciferas komplex
En ljusbringande substan och ett bakterie bakteriellt
enzym (NADH konc. 0,1 nM – 1pM)
Eldfluga – Luceferas system
ATP konc ner till 0,001pM
Energidiagram
Ljusemission i molekyl
Exitation
Relaxation (de-exitation)
Strålningslös övergång
E1
Ef = hc/l
DE = Ef
E0
Grund
nivå
DE = Ef
Grund
nivå
Olika typer av luminiscens
•
•
•
•
•
•
•
•
Bioluminiscens, by a living organism
Chemoluminiscens, resulting of a chemical reaction
Electrochemiluminescence, by an electrochemical reaction
Electroluminescence, in response to an electric current passed through it
Phosphorescence, delayed re-radiation
Fluorescence, where the emitted photons are of lower energy than those
absorbed
Radioluminescence, produced in a material by the bombardment of ionizing
radiation
Thermoluminescence, when absorbed light is re-emitted on heating.
Fluorimeter
Emissionspektroskopi
Prov
Transmittanas
130
Prov
våglängd
Prov
Fluorescens
130
Emissionspektroskopi
Prov
Transmittans
INGEN
FLUORESCENS
Prov
våglängd
Kromoforer (ex)
• Aromatiska ringar (Benzen)
proteiner Phe, Tyr, Trp,His (280nm)
• Nukleotider C,G,A,T (260nm) DNA, RNA
• Dubbel och trippel-bindningar
Flouroforer
Aromatiska ringar
• T. ex. Aminosyror: Tyr, 275nm – 303nm
Trp 280nm – 348 nm
Fluorokromer
Fluorescein
FluorX
495 519 389 FITC; pH sensitive
494 520 587 (AP Biotech)
BODIPY-FL 503 512
TRITC
547 572 444 TRITC
X-Rhodamine 570 576 548 XRITC
Acridine Orange
Ethidium Bromide
503 530/640
493 620 394
DNA/RNA
Flourescens colours
Fluorescein
Rep. Molekylspektroskopi
Spektrofotometri (molekylspektroskopi): ljus
absorberas i lösningen i proportion till
koncentrationen.
• UV/VIS: koncentrationsbestämningar, bestämma
hastigheten på en reaktion med färgomslag.
• IR: man kan även få fram vilket ämne det är i
lösningen.
• Fluorimetri: ljus emitteras i proportion till
koncentrationen. Mycket låga halter kan
bestämmas med hjälp av fluoriscens.
www.chemistryland.com/.../PowerPoint.html