Molekylspektra
De olika färgerna
representerar olika
koncentrationer
Analys av blod
Analyser som kan utförat på
kemiska laboratoriet i Huddinge
http://provtagningsanvisningar.karolinska.se/templates/Provanvisningsindex.aspx?id=57402#provanvisningsindexstart
Spectroskopi
1. Molekylspektroskopi
uv/vis
Absorptionsspektrometri
infraröd
(filterfotometri, spektrofotometri)
Nefelometri (turbidimetri)
Emissionsspektrometri
(fotoluminescens)
fluorescens
(fosforescens)
Spektroskopi
• 2. Atomspektrometri
Atomabsorption
Atomemission
Röntgenfluorescens
• 3 NMR-spektroskopi
(kärn-magnetisk resonans)
elektronskal
Atom
elektronorbital
3p
3s
kärna
Atomspektrum
Absorption
Emission
Natrium-atom
Natrium-atom
Spektrum
våglängd
våglängd
Na-spektrum
Energinivåer i
elektronhöljet
Na-spektrum
Ljusabsorption i atom
Exitation
E1
Relaxation (de-exitation)
Exiterad
nivå
Ef = hc/l
DE = Ef
E0
E1
Exiterad
nivå
DE = Ef
Grund
nivå
E0
Strålningslös
övergång
Grund
nivå
Användningsområden för
atomspektroskopi
• Identifikation av metalljoner (Na, K,
Cu , Hg,…,
• Koncentrationsbestämningar av metalljoner
i kroppsvätskor
Alternativ metod är jon-selektiv elektrod (jmf
pH-elektrod)
Användningsområden av
molekylspektroskopi(UV/VIS)
• Koncentrationsbestämningar av alla
lösningar som absorberar ljus i UV eller
Visuella området, tex. Hb-bestämning , kan
även användas för gaser
• Kinetiska studier
Molekyl
Elektronövergång
(n – s*)
storlek 2 - 6 eV
Vibration
0,1 –0,01 eV
Rotation
C:a 0,001 eV
Absorption i molekyl
Transmittans
Absorbans (= -log T)
1
10%
Våglängd
560
560
Våglängd
Ljusabsorption i molekyl
Exitation
Relaxation (de-exitation)
E1
Strålningslös
övergång
Ef = hc/l
DE = Ef
E0
Grund
nivå
DE = Ef
Grund
nivå
Absorptionsspektroskopi
Transmittans
Filter
Vitt
100%
ljus
35%
Prov
Transmittans
35%
100%
Vatten
100%
35%
våglängd
Absorptionsspektroskopi
Transmittans = I/I0
Prov
I0
I
100%
35%
100%
35%
våglängd
Absorbans
Prov
I0
I = I0* 10-A
I
A = -log T
Absorptionsspektroskopi
Absorbans
Prov
I0
I
våglängd
I = I0* 10-A
Absorbans A = a . b . c
Prov
I0
a
c
b
I
a = ämneskonstant
c = koncentration
c
Principen för en fotometer
Absorptionsspektroskopi
Absorbans
Prov
I0
a
I
c1
1
0,5
c1
c2
a
c2
c2 = 8mg/ml
c
Kromoforer (ex)
• Aromatiska ringar (Benzen)
proteiner Phe, Tyr, Trp,His (280nm)
• Nukleotider C,G,A,T (260nm) DNA, RNA
• Dubbel och trippel-bindningar
Användningsområden av
molekylspektroskopi (infraröd)
Bygger på ”ljusabsorption” i vibrationsnivåer
• Identifikation av molekyler
• Kontroll av renhet
• Bestämmning av molekylstruktur
Absorption inom infraröda
området
E1
DE = Ef
Ef = hc/l
Exitation
Grund
nivå
E0
DE = Ef
Relaxation
Strålningslös
övergång
Grund
nivå
Molekylens vibrations- och
rotationsnivåer
acetophenone
Vibration
0,1 –0,01 eV
Rotation
C:a 0,001 eV
Användningsområden
flourescens
• Bestämning av låga koncentrationer
• Bestämning av molekylers massa
• Immunologiska bestämningar
Emissionspektroskopi
Prov
Transmittanas
130
Prov
våglängd
Prov
Fluorescens
130
Emissionspektroskopi
Prov
Transmittans
INGEN
FLUORESCENS
Prov
våglängd
Ljusemission i molekyl
Exitation
Relaxation (de-exitation)
Strålningslös övergång
E1
Ef = hc/l
DE = Ef
E0
Grund
nivå
DE = Ef
Grund
nivå
Flouroforer
Aromatiska ringar
• T. ex. Aminosyror: Tyr, 275nm – 303nm
Trp 280nm – 348 nm
Fluorokromer
Fluorescein
FluorX
495 519 389 FITC; pH sensitive
494 520 587 (AP Biotech)
BODIPY-FL 503 512
TRITC
547 572 444 TRITC
X-Rhodamine 570 576 548 XRITC
Acridine Orange
Ethidium Bromide
503 530/640
493 620 394
DNA/RNA
