MALMÖ HÖGSKOLA
Teknik och samhälle
Basåret Kemi III
1(4)
Laboration 3
BESTÄMNING AV PROTEINKONCENTRATION I OKÄNT PROV
Bakgrund
Biuretmetoden bygger på att kopparjoner i alkalisk lösning ger ett blåviolett komplex med
kväveatomerna i proteinernas peptidbindningar.
Genom att mäta absorbansen av peptidkomplexet kan man bestämma proteinkoncentrationen.
Princip för absorbansmätning
Ett metallkomplex absorberar ljus vid specifika våglängder. Detta kan utnyttjas vid koncentrationsbestämningar. Om våglängden för mätningen inte är angiven tas först ett spektrum upp för att
bestämma våglängden för komplexets absorbansmaximum. Därefter mäts absorbansen för
lösningar med kända proteinkoncentrationer vid denna våglängd och sedan ritas en
kalibreringskurva. Genom att mäta absorbansen för prov med okänd koncentration kan
koncentrationen bestämmas ur kalibreringskurvan.
Se appendix.
Lösningsberedning
Biuretreagens:
0,15 g CuSO4.5H2O
(Finns färdig)
0,6 g natriumkaliumtartrat
löses i 50 ml destillerat vatten
30 ml nyberedd 10 % NaOH tillsätts
späd till 100 ml med destillerat vatten.
Proteinstamlösning: Proteinlösning med koncentrationen 80 mg protein/cm3 (finns färdig).
Utförande
Bered med hjälp av proteinstamlösningen och 0,10 % NaCl-lösning fyra kalibreringslösningar
som innehåller 2,0 - 4,0 - 6,0 och 8,0 mg protein/ml. Använd 20 eller 25 cm3 mätkolvar vid
spädningen. Samtliga lösningar späds från stamlösningen, 80 mg/ml.
Dessa 4 lösningar tillsammans med ett 0-prov (se nedan) används för att ta upp en
kalibreringskurva.
Provberedning för kalibreringslösningarna och okänt prov utföres samtidigt enligt beskrivning
nedan:
0,5 cm3 av vardera proteinlösningen (4 st.), 0-provet (= 0,5 cm3 0,10 % NaCl) och 0,5 cm3
lösning av okänt prov, som beretts på samma sätt som kalibreringslösningarna sätts till vardera
två märkta provrör (dubbelprov). Tillsätt 3 cm3 Biuretreagens till varje provrör (totalt 12 st.
provrör). Blanda väl. Låt färdigblandad lösning stå i minst 15 min före absorbansmätningen.
För att nollställa spektrofotometern används destillerat vatten. Detta kallas för blank.
Labhandledaren demonstrerar handhavandet av spektrofotometern.
Mät absorbansen för samtliga lösningar vid 540 nm, även det okända provet.
Beräkningar
Subtrahera 0-provets absorbans från var och en av proteinlösningarnas absorbanser. Rita upp en
kalibreringskurva genom att i ett diagram avsätta de på detta sätt beräknade absorbanserna för
kalibreringslösningarna mot dess halter. Avläs det okända provets halt ur kalibreringskurvan.
1
MALMÖ HÖGSKOLA
Teknik och samhälle
Basåret Kemi III
2(4)
Laboration 3
APPENDIX
Spektrofotometrisk mätning
En lösnings färgintensitet beror på arten och koncentrationen av det färgade partikelslaget samt
på tjockleken av lösningsskiktet. Med ögats hjälp kan man göra en uppskattning av en färgad
lösnings koncentration genom att jämföra den med en lösning vars koncentration är känd. Om
man i stället for ögat använder en fotocell som objektivt registrerar färgintensiteter, får man ett
mycket noggrannare resultat.
Metoden grundar sig på mätning av lösningars absorption av ljus. Instrumentet som används
kallas en spektrofotometer. Spektrofotometern kan konstrueras så att den kan användas utanför
det synliga våglängdsområdet. Man får då möjlighet att analysera ofärgade ämnen som
absorberar strålning i det ultravioletta eller infraröda våglängdsområdet. Våglängden anges
vanligen i nanometer (1 nm = 10-9 m). Synligt ljus har våglängder mellan 400 nm och 750 nm.
Man arbetar ofta inom ett smalt våglängdsområde, monokromatiskt ljus. När monokromatiskt
ljus passerar en lösning absorberas en del av strålningen. Om intensiteten for det infallande ljuset
är I0 och intensiteten för det utträdande ljuset är I gäller Lambert-Beers lag:
A = log(I0/I) = .c.l (se härledning nedan)
Formler
Beteckningar:
I0
I
l
c
T
A
E
intensitet hos det infallande ljuset
intensitet hos det utgående ljuset
den sträcka ljusstrålen går genom lösningen (cm)
lösningens koncentration (M)
transmittans (ev. %)
absorbans (absorbansenheter, Abs.)
molara absorptiviteten (M-lcm-l)
ljusets våglängd (nm)
Figur 1. Transmittans.
Transmittansen, T, är förhållandet mellan det utgående och det infallande ljusets intensitet:
T = (I/I0)
(Vill man uttrycka transmittansen i procent får man multiplicera kvoten (I/I0) med 100.)
Absorbans är den mest använda storheten vid spektrofotometriska mätningar. Anledningen är att
absorbansen är direkt proportionell mot koncentrationen, vilket leder till en rät linje när man ritar
absorbansen som funktion av koncentrationen. För att få absorbansen skall man logaritmera det
inverterade värdet av transmittansen: A = log(1/T) = log(I0/I)
För absorbansen gäller Lambert-Beers lag:
A = .C.l, där konstanten = molära absorptiviteten och C ges i mil/dm3. Används annan enhet på
koncentrationen anges konstanten a som den specifika absorptiviteten. (A = a·C·l)
2
MALMÖ HÖGSKOLA
Teknik och samhälle
Basåret Kemi III
3(4)
Laboration 3
Ljusets sträcka, l, genom lösningen är oftast lika med 1 cm i en vanlig kyvett. , den molara
absorptiviteten är konstant förutsatt att ljusets våglängd, lösningsmedlets art eller lösningens
temperatur inte ändras. Absorbansen är ett relativt tal och saknar enhet. Spektrofotometern kan
ge mätresultat både i absorbans- och transmittansenheter. Vid höga absorbanser (> 1 ungefär)
absorberas nästan allt ljus. Endast en liten del når fram till detektorn och mätningarna blir osäkra
dvs. Lambert-Beers lag slutar att gälla.
Absorptionsspektrum
I metodbeskrivningar är oftast den våglängd man skall mäta vid angiven. Skulle det inte vara så
kan man bestämma en lämplig våglängd genom att variera våglängden och mäta absorbansen för
den lösning man är intresserad av att analysera. Rita sedan absorbansen som funktion av
våglängden i ett diagram.
Figur 2. Absorptionsspektrum.
Lämplig våglängd for mätningarna är den våglängd som motsvarar absorptionsmaximum på
kurvan.
Kalibreringskurva
Man kan bestämma lösningens koncentration genom att jämföra lösningens absorbans med
absorbansen hos några lösningar med kända koncentrationer, standardlösningar.
Standardlösningar med kända koncentrationer bereds och absorbansen mäts vid en bestämd
våglängd. Absorbansen för standardlösningarna avsätts mot koncentrationen för respektive
lösning i ett diagram. Detta diagram kallas standardkurva eller kalibreringskurva. Nedan finns en
schematisk kalibreringskurva där punkterna för standardlösningarna inte är utsatta.
3
MALMÖ HÖGSKOLA
Teknik och samhälle
Basåret Kemi III
4(4)
Laboration 3
Figur 3. Kalibreringskurva.
Punkterna bör ligga på en rät linje genom origo vars riktningskoefficient är den molara
absorptiviteten, . Att linjen går igenom origo beror på att 0-provets absorbans subtraheras från
samtliga prov inklusive det med koncentrationen 0 dvs. 0-provet. För ett okänt prov ger
kalibreringskurvan koncentrationen genom att man avläser koncentrationen för den absorbans
provet har visat vid analysen.
Kyvetter
Kyvetter används som behållare för vätskan när denna ska
analyseras i spektrofotometern. De är precisionstillverkade och
därför relativt dyra. De är känsliga för repor och fett. Rör aldrig
vid de polerade ytorna utan ta alltid i övre delen av kyvetten.
Kyvetter kan vara tillverkade i olika material t.ex. glas, kvarts
eller plats. Olika material krävs vid mätningar vid olika
våglängder p.g.a. materialet i kyvetterna absorberar ljus vid olika
våglängder. För mätningar med UV-ljus användes kvartskyvetter
vilka är cirka 5 gånger dyrare än glaskyvetter. Vis betyder visible
(synligt) och står på glaskyvetter.
Kyvetter med tjockare glas eller mindre volym användes om man endast har tillgång till en
mindre provvolym. Strålens väg genom lösningen blir lika lång eftersom det är sidoväggarna
som är tjockare eller mindre breda.
Diskning sker normalt med destillerat vatten. Krävs noggrannare diskning kan man koka
kyvetterna (glas och kvarts) i koncentrerad salpetersyra varefter de sköljs i destillerat vatten och
etanol. Diskningen är speciellt viktig vid UV-mätningar.
Matchning av kyvetter kan man göra om man behöver använda flera olika kyvetter i samma
mätserie och vill arbeta mycket noggrant. Man nollställer spektrofotometern med en kyvett i
strålgången. Sedan byter man ut denna och kontrollerar att apparaten visar noll även med de
andra kyvetterna. På så sätt kan man välja ut kyvetter som stämmer överens, matchar varandra.
4
