Metabolism av kumarin Delexperiment 1: 1) Vad är det som orsakar fluorescensen i rören? De substanser som fluorescerar är NADPH och 7-OH-kumarin (från kumarin) 2) Vad är det som sker i rör 4? Varför lyser den mer? Vilken reaktion är det som sker? I rör 4 ökar fluorescensen med tiden pågrund av att lösningen oxideras i en fas 1 reaktion. Den lyser mer på grund av att det bildas fler 7-OH-kumarin (fas 1-metabolit) 3) Vad tror ni sker i rör 3? Det som sker i rör 3 är att NADPH fluorescerar lite grann, på grund av att den har grupper som bidrar till att fluorescensen ökar t.ex. OH-grupp och NH2. Den har också en grupp, amidgruppen, som inhiberar fluorescensen. På grund utav att NADPH är icke stabil vid rumstemperatur kommer fluorescensen att minska lite grann. Men ingen drastisk skillnad kommer ses. 4) Enligt dessa resultat, behövs NADPH? NADPH behövs för att en fas 1 reaktion ska fås. Det kan man se genom att provrör 1 och 2, som saknade NADPH inte fluorescerade, vilket visar på att det inte bildades någon 7-OH-kumarin (fas 1 metabolit). Medan de resterande provrören (3,4,5,) som innehöll NADPH fluorescerades. 5) Enligt dessa resultat, behövs enzym? Ja, enzym behövs för att man ska se någon reaktion i provrören efter 30 minuter. eftersom enzymer sänker aktiveringsenergin vilket möjliggör att reaktionen sker snabbare, om det inte hade funnits enzymer hade reaktionen tagit längre tid. Det märks tydligt i provrör 4 och 5 som har enzymer medan i provrör 3 (utan enzym) sker det ingen reaktion. Fast det går inte att endast ha enzym utan man måste även ha NADPH vilket tydligt visades i provrör 1 och 2, där det inte blev någon reaktion. f 6) Är det någon skillnad på enzymaktivitet mellan rör 4 och 5? Om detta är fallet, vad skulle en sådan skillnad kunna bero på? Det är skillnad mellan enzymaktivitet i provrör 4 och 5. För enzym Q som finns i provrör 4 har högre enzymaktivitet (vilket gör att provrör 4 ökar i fluorescens) jämfört med enzym Z. Denna skillnad skulle kunna bero på att mikrosomfragmenten, Q och Z, är framtagna från olika organismer. Det kan även vara att fragmenten är framtagna från samma organism t.ex. människor, fast på grund av polymorfism (genetiska skillnader i en population) beter enzymerna sig på olika sätt. En annan skillnad som kan påverka enzymaktiviteten kan vara att mikrosomfragmenten är från samma individ, exempelvis människa, fast framtagna från olika organ. 7) När alla dessa rör blandades ihop så tillsattes det ibland 25µl Tris-HCL. Varför då? Volymen ökar hos de provrören som man tillsätter extra buffert, dvs i provrör 1, 2 och 3. Detta gör att provrören får samma koncentration mellan mikrosom och substraten, som resten av provrören (4 och 5). Delexperiment 2 1) Med tanke på vad som tillsatts till rören och ökningen i fluorescensintensitet, är det en fas I eller fas II reaktion? Vid bildning av 7-OH-kumarin ökar fluorescensintensitet i ett provrör. Alltså vid en fas 1 reaktion. Däremot vid en fas 2 reaktion så kommer vi se en minskad fluorescensintensitet då 7-OH-kumaringlukuronid inte har denna egenskap. Eftersom vi får en ökad fluorescensintensitet i provrör 1 samt 2 betyder det att det är i båda fallen en fas 1 reaktion. 2) Ser det ut som om substans A har någon inverkan på reaktionen? Om så är fallet, hur? Provrör med substansen A för en ökad fluorescensintensitet, men ökningen är identisk med kontrollröret. Om substansen A skulle ha någon påverkan på metabolismen skulle provrör 1 avskilja sig från kontrollröret. Eftersom det inte gör det har substansen A inte haft någon inverkan på reaktionen. 3) Ser det ut som om substans B har någon inverkan på reaktionen? Om så är fallet, hur? Vi kan se att hos provrör 2 har fluorescensintensitet i jämförelse med kontrollröret minskat. Detta innebar att substansen B har haft en inverkan på reaktionen. Substansen B inhiberar till en viss grad metabolismen av Kumarin. Substansen B har en karboxylsyra bunden till sin molekyl, som inhiberar fluorescensen. 4) Eftersom att alla rör lyser mer efter 30 minuter, vilket ämne har troligtvis bildats i rören? 7-OH-Kumarin 5) I experimentet så har ni även förberett ett kontrollrör, varför inkluderas detta? Detta inkluderas för att påvisa om de okända substanserna som läggs in i provrören 1 och 2 kommer att bidra med någon effekt eller inte. Om ingen ytterligare substans skulle blandas in skulle samtliga provrör ha likvärdig reaktion. Om vi ser någon ändring i provrören jämfört med kontrollröret, har substanserna som lagts in haft en påverkan på metabolismen. Delexperiment 3 1) Vad är det som orsakar fluorescensen i rören? Eftersom alla de tre provrören innehåller 7-OH-kumarin kommer samtliga provrören att ha en intensiv fluorescens. 2) I vilket rör sker det en fas II reaktion? I provrör nummer 3. 3) Förklara vad som har hänt i röret med fas II reaktion. Vilket substrat har konsumerats? Vad har bildats? Det provrör som genomgått en fas II reaktion är provrör nummer tre. Det substratet som bildas i detta fall under en fas II reaktion är 7-OH-kumaringlukuronid, och det som konsumerats är 7-OH-kumarin 4) Enligt resultaten, behövs UDPGA för att genomföra rektionen? Hur ser du det? Ja UDPGA behövs för att fas 2 reaktionen ska genomföras. Vi ser detta i provrör 3 som innehåller båda UDPGA och co enzymet UPD-glucuronosyltransferas. Efter 30 minuter har fluoresensen minskat, som innebär att 7-OH-kumarin har omvandlats till 7-OH-kumaringlukuronid ,som inte har någon flurescens, i en fas 2 reaktion. 5) Enligt resultaten, behövs enzym för att genomföra reaktionen? Enzymer behövs för att reaktionen ska kunna ske på 30 min. Provrör 3 genomgår en fas 2 reaktion där 7-OH-kumaringlukuronid bildas. Co-enzymet UDP-glucuronosyltransferas behövs för att reaktionen ska kunna ske.
