tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcg

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCG
TTACAACTTACGGTAAATGGCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA
ATATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTGACATTGACGTCAATGGGTGGAG
+1
-35
TATAATACGGTAAACAGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCC
-10
CTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCGCCTGGCATTATGCCCAGTCATGACTTATGGGAC
TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCTTGGAGGTCAGT
S.D.
CATGINVITROMUTAGENESLABKURSMOLEKYLÄRBIOTEKNIKKTH2007TAATAGGATA
START
STOP
GCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATTTTGGCACTGTTC
AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGT
AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTGATACGGGCGTGCAGTGCTTCAG
CCGCTACCCCGACCACATGAAGCATTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTC
AGATCTGCCACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGCGGTGCCC
ATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCATGGTGCCGCCGGCAGCCAT
ATGGGTACCCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCC
ACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGG
TCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGAT
GCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGG
CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACAT
GAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAATTCTACGTCCAGGAGCGCACCATCT
Eco RI
TCTTCAAGGACGACGGCACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGG
TGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAA
GCTGGAGTACAACTACAACAGCCTCAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAACTT
GACAAGCAGAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATTACCGAAAGAAGT
CGAGGACAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCAGCAGAGCTGGGTACA
CGCGATCACATGGTCCTGCAGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGCTTCGAATTCTGCAGTCGATA
Pst I
GGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTGATCATAATTTC
CAGCCATACCGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTCTAGTAGTACA
GAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAAGT
CTATATAATTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTATCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGC
AGTCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACCGATATA
CCGGACTCAGATCTGCCACCATGGGCGCCATCATCACATCATCACAGCAGCGGCCCCGATTA
TGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTACCCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGAGC
CGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGCTTGAGGAGCTGTCC
Hin dIII
TCGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAAACAGCCAGC
GCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTAC
Assistenter HT 2007:
GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGGT
v. 46
v. 47
v. 48
v. 49
George Kostallas
Carl Hamsten
Johan Rockberg
George Kostallas
Carl Hamsten
Mattias Oskarsson
Emma Lundberg
Mattias Oskarsson
TGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCCGACTTCTTCAAGTCCGCCATTT
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
2
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
IN VITRO-MUTAGENES
Laboration i Molekylär Bioteknik
vid Skolan för Bioteknologi, KTH, Stockholm
LABORATIONSHANDLEDNING
Vers. 2007
Utarbetad av:
OLOF NORD
HENRIK ASPEBORG
ANDERS ANDERSSON
ERIK FORSÉN
ANNA GUSTAFSSON
NINA BANDMANN
MARIA SIEVERTZON
PER-ÅKE
VALTTERI WIRTA
MAX KÄLLER
CECILIA LAURELL
CARL HAMSTEN
JOHAN ROCKBERG
GEORGE KOSTALLAS
JOHN LÖFBLOM
NYGREN
_________________________________________________________
Omslag: DNA-sekvensen döljer en dold gen med ett relevant budskap.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
3
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Innehåll
Introduktion
In vitro-mutagenes enl. Kunkel
Översiktlig beskrivning av laborationen
Dagsplanering
Labmanual
Dag 1
Dag 2
Dag 3
Dag 4
Riktlinjer för rapportskrivning
Bilagor 1-10
Bilaga 1: Plasmidkarta för målplasmiden pZ-STOP-EGFP
Bilaga 2: DNA-sekvens innehållande målsekvensen för mutagenesen (2 ex)
Bilaga 3: Oligonukleotider som används i laborationen
Bilaga 4: Genetiska koden
Bilaga 5: Aminosyrasammansättning för fusionsproteinet Z-EGFP
Bilaga 6: Formel för beräkning av ett proteins extinktionskoefficient
Bilaga 7: Molekylvikter hos proteiner i markörmixen (SDS-PAGE)
Bilaga 8: Längder hos DNA-fragment i markörmixen "GeneRuler"
Bilaga 9: Beskrivn. av konc.-bestämningsmarkören "Low DNA Mass Ladder"
Bilaga 10: Beskrivning av plasmidpreparering från E. coli-celler
enligt kit från Qiagen
4
5
9
14
15-23
15
18
20
24
25
26
27
29
30
31
32
33
34
35
36-41
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
4
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
OBS! Läs igenom laborationshandledningen ordentligt före laborationsstarten
eftersom det kan förekomma förhör.
Introduktion
M
olekylär bioteknik är ett vitt begrepp som innefattar en mängd
verksamhetsområden som har gemensamt att de behandlar biologiska och
biotekniska frågeställningar från ett molekylärt perspektiv.
En rad av tekniska landvinningar har gjort att det idag är möjligt att på molekylnivå
studera, analysera och påverka de beståndsdelar som utgör livets kemi. Dessa
innefattar metoder för att isolera, sekvensbestämma och producera nukleinsyror (RNA
och DNA) och proteiner.
Utveckling av metoder för in vitro-mutagenes har haft en stor betydelse, i och med att
man därigenom fått möjlighet att göra riktade (dirigerade till speciella positioner) och
önskade ändringar i DNA-molekyler. Att redan på gennivå (DNA) kunna göra
skräddarsydda ändringar i ett senare translaterat proteins aminosyrasekvens för
jämförande studier av närbesläktade proteiner har haft en enorm betydelse för vår
förståelse av proteiners egenskaper såsom sambandet mellan struktur och funktion.
Denna laboration syftar till att ge en praktisk inblick till hur man kan gå tillväga för
att utföra sådana avsedda förändringar i DNA, och vidare hur utfallet av dessa kan
bestämmas (konfirmeras) med DNA-sekvenering. Den position som i laborationen är
aktuell för mutagenes är belägen i en DNA-sekvens som är kodande för ett visst
protein. Detta ger en möjlighet till analys av resultatet även på proteinnivå.
Huvudsakliga tekniker som ingår i laborationen:
• Plasmidrening från bakterier
• In vitro mutagenes enligt Kunkelmetoden
• Transformering av plasmid-DNA till bakterier
• Polymerase chain reaction (PCR)
• DNA-sekvensbestämning med Pyrosekvenering
• Rekombinant proteinproduktion
• Rening av protein med affinitetskromatografi
• Gelelektrofores av DNA och protein
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
5
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
In vitro-mutagenes enligt Kunkel
Metodik för oligonukleotidmedierad mutagenes beskrevs första gången av Michael
Smith i mitten av 1970-talet, något som han 1993 belönades med Nobelpriset i kemi
för. Hans metodik vidareutvecklades senare av flera, däribland
Thomas Kunkel (Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
488-492) vars metod används i denna laboration. Idag används ett
flertal olika alternativa principer parallellt på olika laboratorier för att
Michael Smith
1932-2000
utföra in vitro-mutagenes, förutom ovan nämnda också kassettmutagenes eller polymerase chain reaction (PCR)-medierad mutagenes
(för översiktsartikel, se Ling and Robinson (1997) Anal. Biochem. 254, 157-178).
Valet av metod påverkas av flera förutsättningar, som t.ex. förekomst av lägen för
klyvning med restriktionsenzym i templatet, målmolekylens längd och antalet
positioner som man vill förändra.
Generellt sett baseras både Smiths och Kunkels metoder på att man låter en
enkelsträngad mutagenesoligonukleotid hybridisera (baspara) till en enkelsträngad
och ringsluten version av den DNA-molekyl (templat) man önskar mutera (Fig. 1A).
A
3« 5«
5«
3«
DNA-polymeras
Nukleotider
DNA-ligas
Dubbelsträngat
plasmid-templat
B
Enkelsträngat
plasmid-templat
+
Mutagenesoligonukleotid
Dubbelsträngat
heteroduplex
Transformering
Mutant
Vildtyp
Figur 1. Principen för oligonukleotidbaserad mutagenes.
Mix
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
6
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Enkelsträngad plasmid kan erhållas enligt flera principer, t.ex genom upphettning
eller alkalibehandling av dubbelsträngade plasmider eller genom inkloning av
målsekvensen i genomet hos vissa fager (bakterievirus av typen M13) som i ett
stadium av sin livscykel naturligt bär på ett genom i form av en enkelsträngad sluten
DNA-molekyl. Mutagenesoligonukleotiden designas så att den basparar perfekt (dvs.
är komplementär) med alla sina nukleotider mot templatet, förutom mot de positioner
som man önskar mutera. Denna eller dessa positioner (kallas mismatch-positioner)
brukar förläggas till mittenregionen av oligonukleotiden så att en stabil hybridisering
kan ske via flankerande basparningar. Detta steg följs av en s.k. extension, där man
låter ett DNA-polymeras syntetisera nytt DNA från 3´-änden av oligonukleotiden hela
vägen runt det cirkulära DNAt, användandes tillsatta vanliga nukleotider. Man får då
åter en dubbelsträngad plasmid. Genom att tillsätta enzymet DNA-ligas slutes 5´änden av oligonukleotiden och 3´-änden av den nysyntetiserade strängen kovalent.
Resultatet blir följdaktligen ett ringslutet dubbelsträngat DNA som innehåller en
region med ickeperfekt basparning (heteroduplex).
Vid transformering av bakterier med sådant DNA kommer bägge strängarna ("gamla"
och "nya") vara kapabla att tjäna som templat för plasmid-DNA-replikation, vilket
skulle ge en blandning av plasmider (muterad och vildtyp) (Fig. 1B). I praktiken
brukar den ena formen anrikas mer än den andra, beroende att de replikeras olika
effektivt, trots den ofta mycket lilla skillnaden. Detta ger att efter ett stort antal
delningar återfinns ofta endast en av formerna i varje enskild koloni.
Dock, den gamla strängen är en gång syntetiserad i en bakterie, vilket gör att den
innehåller nukleotider som metylerats (av cellens egna enzymer), vilket inte är fallet
för strängen som syntetiserats in vitro (nya strängen). Detta är av betydelse för
bakteriens försvarssystem mot mutationer som känner igen mismatch-regionen (som
liknar strukturer som kan uppstå vid felaktigheter under replikationen av bakteriens
eget kromosomala DNA), och som vill korrigera den felaktiga basparningen. Vid
denna korrigering känns den gamla metylerade strängen igen som ursprunglig (och
"sann") och användes därför preferentiellt som templat för korrigeringen. Detta får till
följd att det stora flertalet av kolonier innehåller bakterier som innehåller den ickemuterade varianten. För att undertrycka denna motselektion in vivo brukar
bakteriestammar med ett defekt mutationskorrigeringssystem (t.ex. mutS-stammar)
användas som mottagarceller.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
7
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
I metoden som utvecklades av Kunkel användes i stället en annan, och mycket
elegant, princip för att höja mutationsfrekvensen (Fig. 2). Här användes en speciell
typ av muterade bakteriestammar som värdar för produktion av templatplasmiden (i
steget före själva mutagenesen). I dessa är de två enzymerna dUTPas (dut) (reglerar
dUTP-nivån i cellen) och uracil n-glykosylas (ung) (eliminerar dU som felaktigt
-
-
inkorporerats i DNA) utslagna (dut, ung ), vilket får till följd att nivåerna av dUTP
blir höga och att DNA som replikerats i en sådan stam kommer att innehålla dU+
nukleotider. När dU-innehållande DNA däremot förs in i en normal (ung )
bakteriestam degraderas detta effektivt.
A
3« 5«
5«
Replikation i speciell
bakteriestam
(dut - ung - )
3«
U
DNA-polymeras
Nukleotider
DNA-ligas
U
U
U
U
Dubbelsträngat
plasmid-templat
U
Enkelsträngat
plasmid-templat (dU)
+
Mutagenesoligonukleotid
Dubbelsträngat
heteroduplex
Transformering
till normal
bakteriestam
(ung+)
U
U
X
B
X X
U
U
X
X
U
U
Nedbrytning av
dU-innehållande sträng
Mutant
(med hög frekvens)
Figur 2. Principen för oligonukleotidbaserad mutagenes enligt Kunkel.
Kunkelmetoden går ut på att använda dU-innehållande DNA som templat för en
"vanlig" oligonukleotidbaserad mutagenes, under användning av DNA-polymeras,
vanliga nukleotider och DNA-ligas. Det dubbelsträngade heteroduplex-DNA som då
skapas innehåller en dU-innehållande sträng (vildtyp) och en normal (dTinnehållande) sträng (muterad sträng) (Fig. 2A). Vid införsel (transformering) i en
+
normal (ung ) bakteriestam degraderas vildtypssträngen effektivt vilket ger att den
muterade strängen företrädelsevis användes för replikationen, med en mycket högre
frekvens mutantinnehållande kolonier som resultat (Fig. 2B).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
8
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Gemensamt för alla mutagenesmetoder är frågan hur man särskiljer de kolonier som
innehåller muterad plasmid från de som innehåller vildtypen (den urspungliga). Flera,
principiellt olika, metoder finns att tillgå för att lösa detta. Till exempel kan man
genom att samtidigt mutera på ytterligare ett ställe i templat-DNAt (med en extra
mutagenesoligonukleotid) laga genen för en tidigare utslagen selektionsmarkör. Om
denna är en gen som kodar för ett protein som medför resistens mot en viss antibiotika
är det möjligt att hitta rätt kolonier via odling på plattor innehållande denna
antibiotika, där endast kolonier innehållande muterat (förhoppningsvis muterat på
bägge ställena) plasmid-DNA bör överleva. Med PCR kan man också hitta rätt koloni,
genom att en av de två primers som används är designad för att bara kunna baspara
tillräckligt väl med den muterade sekvensen. Beroende på läget av den mutation som
skall skapas i denna laboration kommer en annan princip kunna användas, baserad på
mutagenesberoende uttryck av ett protein vars aktivitet enkelt kan observeras.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
9
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Översiktlig beskrivning av laborationen.
1. In vitro-mutagenes. Den DNA-sekvens som skall muteras i laborationen är
belägen i en s.k. expressionskassett, d.v.s. ett område (i detta fall i en plasmid) som
styr produktionen av ett visst protein (Fig. 3). Expressionskassetten består av en
promotor följd av en en strukturgen som kodar för själva proteinet. Promotorn i detta
fall är en lac-promotor som normalt är avstängd via därtill inbundet Lac-repressorprotein, men som enkelt kan induceras med tillsättande av laktosanalogen isopropyltiogalaktosid (IPTG). Strukturgenen i detta fall kodar för proteinet Z-EGFP, som är
ett fusionsprotein mellan två olika proteiner. Proteinet Z är en 6 kDa stor proteindomän som kommer från ett stafylokockprotein som heter protein A, och har en
förmåga att binda starkt till den konstanta delen av den tunga kedjan (Fc-fragmentet)
hos immunoglobulin G. Detta har gjort att Z-proteinet ofta har använts som s.k.
affinitetssvans för att underlätta upprening av rekombinanta proteiner. Detta faktum
kommer också att utnyttjas i en senare del av laborationen (proteinrening).
P lac
TAA
Z
EGFP
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
In vitro-mutagenes
P lac
Z
EGFP
Figur 3: Schematisk bild över expressionskassetten som är föremål för in vitro-mutagenesen i denna
laboration. Ett stoppkodon beläget mellan generna för protein Z och protein EGFP (Enhanced Green
Fluorescent Protein) skall muteras så att en öppen läsram bildas. Detta möjliggör ett uttryck av
fusionsproteinet Z-EGFP, vars förekomst i cellen kan detekteras med UV-ljus.
Den andra delen av fusionsproteinet är en variant av ett protein som heter Green
Fluorescent Protein (GFP) och har sitt ursprung hos en viss självlysande manetart som
heter Aequorea victoria (Fig. 4). Detta protein har den unika förmågan att avge ett
synligt grönt ljus om det bestrålas med ultraviolett strålning (fluorescerar). Det
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
10
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
alstrade ljuset emitteras från en exciterad s.k. kromofor som är belägen i proteinets
struktur. Denna kromofor utbildas i det veckade proteinet som en följd av spontana
Figur 4. Bild av maneten Aequorea victoria (vänster) och strukturen hos Green Fluorescent Protein
(GFP) (höger). De aminosyror som ingår kromoforen har markerats.
omlagringar hos tre aminosyror (Ser65-Tyr66-Gly67) som ingår i proteinets egen
primärstruktur (Fig. 5A). Intensiteten och excitation/emissionsvåglängder är beroende
av kromoforens omgivning, och flera varianter av GFP har konstruerats. För
vildtypsproteinet användes våglängder kring 400 nm för excitation och fluorescensemissionen kan ses vid 509 nm (Fig. 5B). Den variant som användes i laborationen
heter Enhanced GFP (EGFP) och fluorescerar i förhållande till vildtypen med ett mer
intensivt ljus och exciteras lämpligast vid 488 nm (ofta med argonlaser som har en
stark linje vid denna våglängd).
A
B
Figur 5. (A): Strukturen hos kromoforen i GFP, som bildas genom spontana omlagringar hos tre av
proteinets aminosyror. (B): Excitation (vänster kurva) och emissionsspektra (höger kurva) för GFP
(vildtyp).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
11
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
I den plasmid som användes på laborationen (pZ-stop-EGFP) förhåller det sig
emellertid så i den DNA-sekvens som förbinder generna som kodar för Z-proteinet
och EGFP så finns det en TAA-triplett i samma läsram som för Z och EGFP-generna
(Fig. 3). Denna triplett motsvarar som bekant ett av de tre stoppkodonen (se genetiska
koden), som ger signal till cellens translationsmaskineri att proteinet är
färdigsyntetiserat. I laborationen skall detta stoppkodon muteras så att det istället
bildas en s.k. öppen läsram (oavbruten kodande sekvens) mellan generna för Z och
EGFP.
Delmål 1: Att med in vitro-mutagenes enligt Kunkel förändra detta TAA-kodon till
ett icke-stopp-kodon så att även delen av fusionsproteinet som utgörs av EGFPproteinet uttrycks.
Plasmiden pZ-stop-EGFP skall upprenas med en standardmetod (se bilaga 9) från en
övernattskultur av Escherichia coli-celler i vilka plasmiden har tillåtits replikera. I och
-
-
med att den använda bakteriestammen är av dut ung -typ blir plasmiden förberedd för
in vitro-mutagenes enligt Kunkelmetoden. Efter genomförd mutagenes skall kolonier
innehållande muterad plasmid identifieras genom visuell inspektion av odlingsplattor
som belyses med UV-lampa.
2. Konfirmatorisk DNA-sekvenering. För att försäkra sig om att en utförd
mutagenes har ägt rum på det önskade sättet måste den resulterande plasmidens
DNA-sekvens i det relevanta området bestämmas (s.k. konfirmatorisk sekvenering).
Delmål 2: Att med DNA-sekvenering konfirmera att mutagenesen resulterat i önskad
förändring.
I denna laboration kommer en teknik som kalllas pyrosekvenering att användas.
Pyrosekvenering är i likhet med Sangermetoden (Sanger, F. et al., (1977) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91, 2091-2094) en "sequencing-by-synthesis"-metod som utnyttjar ett
DNA-polymeras, en primer och fria nukleotider för syntes av nytt DNA som är
komplementärt till den DNA-molekyl vars sekvens man vill bestämma. Men till
skillnad från Sangermetoden, där sekvensen utläses från detektion av DNA-fragment
av olika längd (terminerade med dideoxynukleotider) som separeras elektroforetiskt i
en gel, utläses med pyrosekvenering DNA-sekvensen från en realtidsdetektion av
korta ljusblixtar i lösning. Dessa ljusblixtar genereras av enzymet luciferas (från
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
12
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
eldflugor) under spjälkning av adenosintrifosfat (ATP), som via ett kopplat
enzymsystem genereras från det pyrofosfat (PPi) som frigörs vid enzymatisk
(polymeras) inkorporering av en dNTP-nukleotid i en växande DNA-kedja (Fig. 6).
Genom att sekventiellt (i tur och ordning) separat tillsätta en enskild sort av de fyra
dNTP (A, G, C eller T) till systemet och för varje tillsats detektera om det alstras en
ljusblixt eller inte (samt intensiteten) kan sekvensen hos templat-DNAt utläsas. För
vissa tillämpningar kan dispenseringsordningen skräddarsys för att ge maximalt med
information, t.ex. vid bestämning av s.k. single nucleotide polymorphisms (SNPs).
A
(DNA)n + dNTP
DNApolymeras
Sulfurylas
APS + PPi
Luciferas +
luciferin
ATP
(DNA)n+1 + PPi
ATP
Ljus
Ej inkorporerade dNTP och överskott av ATP degraderas
av enzymet Apyras (kontinuerligt)
PPi = pyrofosfat
APS = adenosin 5´-fosfosulfat
ATP = adenosin-trifosfat
Templat-sekvens
B
Ljusintensitet
C
G
-
TT
2
1
G
C T
A
Adderad nukleotid
Figur 6. Principen för DNA-sekvensbestämning med pyrosekvenering. (A): Enzymatisk inkorporering
av en nukleotid i en växande DNA-kedja generarar pyrofosfat (PPi) som via ett kopplat enzymatiskt
system (innefattande det ljusalstrande enzymet luciferas) omvandlas till ljus. Närvaro av enzymet
apyras gör att flera sekeventiella positioner kan läsas, då detta effektivt degraderar överskott av dNTP
och ATP inför nästa cykel. (B): Resultatet presenteras i form av s.k. pyrogram, där ljusintensiteten ses
som funktion av tillsatt dNTP-sort. Observera att ljussignalen är proportionerlig mot antalet
inkorporerade nukleotider; två stycken T´n i rad i målmolekylen ger vid tillsats av dATP en ljussignal
av styrkan "2".
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
13
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
3. Produktion, rening och analys av proteinet Z-EGFP. Resultatet av den utförda
mutagenesen blir som beskrivits ovan att den aktuella expressionskassetten i
plasmiden blir kodande för ett fusionsprotein mellan en IgG-bindande Z-domän och
EGFP. I laborationen ingår att producera detta protein i Escherichia coli samt att rena
upp det från cellens övriga biomolekyler med s.k. affinitetskromatografi. Genom att
ympa en grön koloni (indikerande att mutagenesen lyckats) i en näringslösning startas
en övernattsodling. Transkriptionen av genen (produktion av mRNA) styrs i detta fall
av en lac-promotor, hämtad från E. coli´s eget system för laktosintag och nedbrytning.
Under normala betingelser (glukos som kolkälla, ingen laktos närvarande) är denna
promotor avstängd via lac-repressorprotein som sitter bundet till en s.k.
operatorsekvens belägen i promotoregionen. För att starta transkriptionen och därmed
den
följande
proteinproduktionen
tillsätts
laktosanalogen
IPTG
(isopropyltiogalaktosid), som binder till lac-repressorn och gör den därmed inkapabel
att blockera transkriptionen.
Delmål 3: Produktion, rening och analys av fusionsproteinet Z-EGFP.
Produkten innehåller ingen signal för export utan blir belägen i cellens cytoplasma
(intracellulär lokalisation). Efter avslutad odling skördas cellerna som lyseras med ett
reagens (BugBuster Protein Extraction Reagent) som består av en blandning av
ickejoniska detergenter. Detta kan användas för att enkelt, snabbt och skonsamt slå
sönder E. coli´s cellvägg så att lösliga proteiner i cellen frigörs. Metoden är ett
alternativ till mer mekaniska metoder för att lysera bakterier som French Press
(tryck/tryckfall) och sonikering (ultraljud). Proteinet Z-EGFP kan sedan renas med
affinitetskromatografi tack vare Z-domänens förmåga att binda specifikt och starkt till
IgG som uppbundits till Sepharose (en kromatografimatris) och packats till en kolonn.
Mängden renat protein bestämmes spektrofotometriskt och analyseras avslutningsvis
m.a.p.
renhet
och
storlek
med
gelelektrofores
(SDS-PAGE).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
14
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Laboration i Molekylär Bioteknik
"In vitro-mutagenes"
Dag 1
Översikt dagsschema
Genomgång
Dag 3
Genomgång
Inkl. förhör på laborationens
innehåll och mål
Minipreppning av plasmiden
pZ-STOP-EGFP (dut-, ung-)
från frusen cellpellet
Agarosgel-elektrofores
av plasmid DNA
Mutagenes-reaktion
Agarosgel-elektrofores
av PCR-produkter
Skörd av odling
Preparation av
templat för Pyrosekvenering (robot)
IgG-affinitetskromatografi
Pyrosekvenering
(lys med UV-lampa
före eluering)
Frystorkning av
proteiner (över natt)
Transformering
av E. coli
Genomgång
Genomgång
Sammanfattning av dagen
Sammanfattning av dagen
Dag 2
Dag 4
Genomgång
Inspektion av
uppvuxna kolonier
En grön koloni
En vit koloni
PCR för
Pyrosekvenering
Genomgång
Tolka resultat
från Pyrosekvenering
Analys av renat protein
med SDS-PAGE
En grön koloni
(del av samma koloni
som används till PCR)
Tolka resultat
Ympning för
proteinproduktion
Skrivning av laborationsrapport
Genomgång
Sammanfattning av dagen
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
15
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Dag 1
A. Rening av plasmiden pZ-STOP-EGFP från dut-, ung--celler.
0. Hämta is och tillred ett isbad.
1. Assistenterna delar ut ett rör innehållande en frusen cellpellet från en 2.5 ml
övernattsodling av E. coli (dut-, ung-)-celler innehållande plasmiden pZ-STOP-EGFP.
2. Låt pelleten tina i rumstemperatur.
3. Följ protokollet för plasmidrening som finns i bilaga 10.
4. Den erhållna plasmidpreparationen skall analyseras m.a.p. renhet och koncentration
med gelektrofores i en 1%-ig agarosgel innehållande etidiumbromid (fluorescent ämne
som binder till nukleinsyror). ANVÄND HANDSKAR (OBLIGATORISKT).
(a) Till ett 1.5 ml Eppendorfrör, tag ut ett 1 µl-prov av plasmidlösningen. Tillsätt 2 µl
dH20. Märk detta prov "A".
(b) I ett 1.5 ml Eppendorfrör, gör en 1:10-spädning av den ursprungliga
plasmidlösningen (1 µl + 9 µl dH20). Från detta spädda prov, tag ut ett 1 µl-prov till ett
nytt 1.5 ml Eppendorfrör. Tillsätt 2 µl dH20. Märk detta prov "B".
(c) Tillsätt 2 µl Bromfenolblå (BFB) gelladdningslösning till de båda proven
(innehåller färgämne och glycerol som gör så att provet syns och också sjunker till
botten av laddningsbrunnen).
5. För båda proven, ladda hela provvolymen (5 µl) i brunnar på gelen och kör gelektroforesen
(assistent visar).
I separata brunnar laddas 2 µl-prov av en koncentrationsbestämningsmarkör (Low DNA
Mass Ladder, bilaga 10) (utförs av assistent).
6. Fotografera gelen under UV-ljus (assistent visar).
7. Jämför intensiteten hos dina prov med den hos banden i Low DNA Mass Ladderstandarden för att uppskatta koncentrationen (ng/µl) av plasmiden i
ursprungspreparationen. Beakta alla spädningsfaktorer.
ETIDIUMBROMID ÄR KLASSAT SOM CANCEROGENT ÄMNE. INGET
SLABBANDE! FÖLJ NOGA ASSISTENTERS INSTRUKTIONER.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
16
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
B. Denaturering av plasmid-DNA och hybridisering av mutagenesoligonukleotiden till DNA-templatet.
1. Blanda ihop en hybridiseringsreaktion i ett 1.5 ml Eppendorfrör enligt följande:
Plasmid-DNA (pZ-stop-EGFP,
dut- ung--preparerad). Tillsätt ca 600 ng.
dH2O
Mutagenes-oligonukleotid Mut-1 (5´-fosforylerad)
(koncentration ca 200 ng/µl i stamlösning)
20 x buffert (SSC-buffert)
Totalvolym i röret
x µl
(baserat på konc. bestämning)
14 - x µl
6 µl
1.3 µl
21.3 µl
2. Blanda väl och snabbcentrifugera sedan ner provet.
3. Inkubera 3 minuter vid 100°C.
4. För omedelbart över provet till is och inkubera provet där i 5 minuter.
5. Samla ihop provet genom att snabbcentrifugera ner det.
C. Syntes av mutant-DNA-strängen.
1. Till hybridiseringsreaktionen, tillsätt ytterligare:
dH2O
5 x Polymerasmix*
T4 DNA-ligas (5 U/µl)
T4 DNA-polymeras (3 U/µl)
56 µl
20 µl
1 µl
2 µl
* Innehåller: 100 mM Tris-HCl, pH 7.8; 10 mM dithiothreitol; 50 mM MgCl2;
2.5 mM av vardera dATP, dTTP, dGTP, dCTP och 5mM ATP.
2. Blanda väl och snabbcentrifugera sedan ner provet.
3. Inkubera 2 timmar vid 37°C.
4. Stoppa reaktionen genom att inkubera provet vid 70°C i 5 minuter.
5. Låt röret svalna till rumstemperatur.
D. Transformering av E. coli-celler
1. Tina ett rör transformationskompetenta E. coli-celler (ca. 200 µl) på is (cellerna är
preparerade för s.k. fryskompetens enl. CaCl2-metoden som ger en uppluckring av
cellväggen/ membranen).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
17
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
2. Tillsätt 30 µl av mutagenesblandningen till de kompetenta cellerna och blanda.
3. Inkubera på is i 30 minuter.
4. Värmechocka cellerna vid 37°C (värmeblock) i 5 minuter.
5. Inkubera på is i 5 minuter.
6. Tillverka en s.k. rackla av en pasteurpipett för spridning av celler. Pipetten värmes
i gaslåga och böjs (gravitationellt) till lämplig form (assistent visar).
7. Sprid 10 % (ca. 23 µl) av transformationsmixen på en agarplatta innehållande
ampicillin och IPTG. Sprid resten (90 %) av transformationsmixen på en annan
platta av samma sort. Lägg bägge plattorna i 37°C över natt. OBS: märk med
namn/gruppnummer (märkpenna).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
18
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Dag 2
A. Inspektion och urval av kolonier för vidare analys med konfirmatorisk
pyrosekvenering samt till ympning för proteinproduktion och rening.
1.
Undersök plattorna från gårdagen med UV-lampa. Uppskatta kvoten:
Antalet gröna kolonier
Totala antalet kolonier
2.
Välj ut (ringa in med märkpenna på undersidan av plattan) en vit respektive en
grön koloni bland sådana som växer solitärt. Dessa kolonier skall användas för
vidare analyser enligt nedan.
B. Ympning för proteinproduktion och rening.
1.
Ympa en delmängd av cellerna från den utvalda gröna kolonin (resten av kolonin
skall användas senare) till en 1-liters skakkolv med bafflar innehållande 100 ml
TSB odlingsmedium med tillsats av ampicillin [100 µg/ml].
2.
Ställ kolven i 37°C-rummet på skakbord för odling över natt. Ställ in 100 rpm i
omrörningshastighet. Inducering av proteinproduktionen med IPTG [1 mM
slutkoncentration] utförs efter 5 h av era assistenter.
C. PCR för pyrosekvenering.
1.
"1"
Till två separata 1.5 ml Eppendorfrör (märkta "1" resp. "2", inkuberas på isbad),
tillsätt följande PCR-reaktionskomponenter:
"2"
10 x PCR-buffert (inkl. Mg2+)
dNTP-lösning (konc. 200 µM av vardera nukleotidsort)
Taq DNA-polymeras (konc. 0.5 units/µl, spädd av assistent)
F-primer (konc. 5 pmol/µl)
R-primer (konc. 5 pmol/µl)
dH2O
Totalt
5 µl
5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
37 µl
50 µl
2. Tag med en spetsförsedd pipett (minsta spetsstorleken) upp resten av cellerna från
den utvalda gröna kolonin (se punkt A och B ovan) från agarplattan och överför
dessa till röret märkt "1". Pipettera några gånger upp och ned för att blanda och
lösgöra cellerna från spetsen.
3. Tag med en spetsförsedd pipett (minsta spetsstorleken) upp celler från den utvalda
vita kolonin (se punkt A ovan) från agarplattan och överför dessa till röret märkt
"2". Pipettera några gånger upp och ned för att blanda och lösgöra cellerna från
spetsen.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
19
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
4. För över innehållen i rören till av assistent angivna positioner (brunnar) i en 96brunnars PCR-platta som användes gemensamt av alla grupper.
5. Applicera plattan i PCR-apparaten (utförs av assistent). Denna skall vara
programmerad för PCR-amplifiering enligt följande 30-cyklers temperatur/tidprofil (min., °C) som totalt tar ca. 3 timmar:
94°C 94°C
5:0 0:20
0
5
30 x
72°C 72°C
65°C
0:3
0
1:0
0
Resultatet av PCR-amplifieringen analyseras under dag 3.
5:0
0
4°C
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
20
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Dag 3
A. Konfirmatorisk pyrosekvenering (fortsättning).
Analys av PCR-produkter
1. För att kontrollera att man har fått en bra PCR-produkt (många kopior av rätt
fragment) brukar man analysera produkten med agarosgelelektrofores. För detta
finns en färdiggjuten 1%-ig agarosgel innehållande etidiumbromid (fluorescent ämne
som binder till nukleinsyror).
ETIDIUMBROMID ÄR KLASSAT SOM CANCEROGENT ÄMNE. INGET
SLABBANDE! FÖLJ NOGA ASSISTENTERS INSTRUKTIONER.
3 µl från varje PCR-brunn överföres till separata 1.5 ml Eppendorfrör till vilka 3 µl
BFB-lösning tillsätts. BFB-lösningen innehåller glycerol och färgämne och gör det
lättare att se och applicera provet i de små brunnarna som gjutits i agarosgelen.
Varje grupp laddar sedan sina respektive två prover på den gemensamma gelen
som ligger i ett elektroforesbad. I varje rad laddas också en storleksmarkör
(GeneRuler, se bilaga 8). Proverna får vandra i 10 min. med 140 V spänning
varefter gelen plockas upp och lägges på ett UV-bord och fotograferas.
Templatpreparering för pyrosekvenering
För att omvandla PCR-produkterna till enkelsträngade templat med hybridiserad
sekveneringsprimer använder vi en pipetteringsrobot. Denna flyttar vätskor mellan
olika plattor och har en magnet med vilken den kan hålla kvar paramagnetiska och
streptavidintäckta kulor inne i pipettspetsen. I roboten placeras PCR-plattan (som
innehåller resten av PCR-produkterna), samt en mottagarplatta för själva
pyrosekveneringssteget (också 96-hålsplatta) samt behållare med olika lösningar.
Roboten kommer att utföra följande moment (se Figur 7):
1. Löser upp och tvättar paramagnetiska streptavidinkulor.
2. Tillsätter kulor i varje brunn i PCR-plattan.
3. Inkuberar plattan i 15 min. i rumstemperatur (PCR produkterna binder
in till kulorna via biotin-streptavidinkemi).
4. Tillsätter 0.1 M NaOH (DNA-strängarna smälter isär).
5. Fixerar kulorna i kanten på pipettspetsen och avlägsnar vätskan med
den lösa DNA-strängen. Sköljer kulorna 1 x TE-buffert och löser upp
kulorna i regenereringsbuffert samt flyttar dem till en
pyrosekvenseringsplatta.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
21
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
6. Hettar upp plattan till 80°C. Nu lösgörs den resterande strängen
(biotinylerad) från kulan. Kulorna samlas upp för återanvändning (de
är dyra).
7. Tillsätter hybridiseringsbuffert innehållande sekvenseringsprimer
(Pyro-1). Hybridiserar primern genom att först denaturera DNAt vid
80°C, hybridisering av primer vid 56°C för att sedan gå ner till
rumstemperatur.
8. Tillsätter buffert så att slutvolymen blir 40 µl.
9. Tvättar kulorna som skall återanvändas.
10. Nu är plattan redo för pyrosekvensering.
Forward biotinylerad primer
Templat DNA
Reverse primer
PCR
Uppbindning pŒstreptavidinklŠdda magnetiska kulor
SmŠlt isŠr strŠngarna med NaoH
Lš sgš r strŠngen frŒn kulan
Hybridisera sekvenserings primer
Figur 7. Templatpreparering inför pyrosekvenering.
Pyrosekvenering
Till pyrosekveneringen används ett PSQ 96 MA-instrument från Biotage AB,
Uppsala (f.d. Pyrosequencing AB).
Apparaten är försedd med en kassett som har åtta brunnar och sex dispenseringsnålar (se figur 8).
• Brunn 1 innehåller enzymerna (E) som erfordras för reaktionen: DNA-polymeras,
sulfurylas, luciferas och apyras.
• Brunn 2 innehåller substrat (S) för de enzymatiska reaktionerna: APS och luciferin.
• Brunnar 3 till 6 innehåller de olika nukleotiderna.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
22
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
5
G
4
6
C
T
3
2
1
S
A
E
Figur 8. Kassetten i pyrosekveneringsinstrumentet.
När sekvenseringen påbörjas dispenseras m.h.a. tryckluft först enzym och substrat i
varje brunn. Sedan dispenseras en bas i taget cykliskt, med ca 1 min mellan varje
tillsats. När körningen är färdig måste kassetten tömmas och tvättas med vatten för att
inte dispenseringsnålarna skall sätta igen.
Nukleotiddispenseringsordningen kan väljas fritt och designas utgående från det
specifika fallet. Beroende på om applikationen är de novo-sekvenering av okänd
sekvens eller konfirmativ sekvenering av känd/förväntad sekvens kan olika
dispenseringsordningar vara att föredra. För denna laboration används emellertid en
cyklisk dispenseringsordning (C, G, T, A)n som har förprogrammerats av
assistenterna.
Resultatet från körningen erhålles i form av ett s.k. pyrogram som kan behandlas
manuellt eller med hjälp av utvärderingsmjukvara. I denna laboration tolkas
pyrogrammen manuellt.
B. Proteinproduktion och rening (fortsättning).
1. Häll över odlingen i ett vägt s.k. GSA-rör för centrifugering (vikt = ........ g).
Jämvikta röret med ett annat GSA-rör från en annan grupp; använd vatten vid
jämviktning. Centrifugera rören vid 6 000 rpm i 10 min. Jämviktade rörpar skall
vara diametralt motsatt placerade. Er assistent hjälper till att sätta igång
centrifugen.
2. Häll av supernatanten noga så att så mycket vätska som möjligt avlägsnas. Väg
röret innehållande cellpellet (vikt = ........ g). Bestäm cellpelletens våtvikt.
3. Resuspendera (lös upp) pelleten genom vortex i kvarvarande vätska (fortfarande i
GSA-röret). Tillsätt sedan 1 x BugBuster-lösning (använd 5 ml av 1 x
BugBuster-lösning per gram våt cellpellet).
4. Inkubera i rumstemperatur i 20 min. Skaka röret då och då.
5. Centrifugera (efter jämviktning mot annat rör; använd 1 x TST-buffert) vid
10 000 rpm i 20 min.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
23
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
6. Filtrera supernatanten genom ett 1.2 µm-filter monterat på en 50 ml-spruta ned i
en 100 ml E-kolv. Tag ut en alikvot (10 µl) av den filtrerade supernatanten till ett
märkt 1.5 ml Eppendorfrör och spara i frys för analys med SDS-PAGE (dag 4).
7. Montera en IgG-kolonn och låt i tur och ordning följande lösningar fullständigt
rinna igenom (OBS! ladda inte nästa lösning förrän föregående passerat helt):
0.
1.
2.
3.
Låt lagringsbufferten rinna igenom
0.5 M HAc (pH 3.4)
1 × TST
0.5 M HAc (pH 3.4)
4. 1 × TST
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
8. (a) Späd supernatanten till en slutvolym av 20 ml med 1 × TST-buffert. Ladda
halva volymen (dvs. 10 ml) av den filtrerade och spädda supernatanten på
kolonnen och låt rinna igenom helt.
(b) Tvätta kolonnen med 10 ml av 1 × TST-buffert.
9. Tillsätt 3 ml av 5 mM NH4Ac (pH 5.5)-lösning till kolonnen (sänker buffertstyrkan och ger därmed en effektivare eluering).
10. Lys på kolonnen med UV-lampa innan eluering för detektion av det inbundna
proteinet.
11. Eluera inbundet protein portionsvis med 0.5 M HAc (pH 3.4) ned i en serie
märkta 1.5 ml Eppendorfrör. Börja med en portion om 0.5 ml följt av fyra
stycken portioner om 1.0 ml (dvs. 0.5, 1.0, 1.0, 1.0, 1.0 ml; totalt 5 portioner).
Tejpa fast kolonnen på Eppendorfrören vid varje eluering för säkerhets skull.
12. Kolonnen skall nu tvättas i två steg och sedan konserveras.
(a) Tvätta kolonnen med 5 ml 0.5 M HAc (pH 3.4).
(b) Tvätta kolonnen med 10 ml 1 × TST
(c) Konservera kolonnen med 10 ml 1 × TST innehållande 20% EtOH (hindrar
mikrobiell växt). Ge kolonnen till assistent efter konservering.
13. Mät absorbansen i spektrofotometer vid 280 nm för varje fraktion. Använd 0.5 M
HAc (pH 3.4) som referens. Beräkna mängden protein i varje fraktion. För att
kunna beräkna detta måste sambandet mellan A280 nm och proteinkoncentration
bestämmas. Därtill behövs ε (extinktionskoefficienten) för fusionsproteinet ZEGFP. Denna faktor baseras på antalet aromatiska aminosyror i proteinet (se
bilaga 6 för beräkningsformel).
14. Tag ut ett prov motsvarande 20 µg protein från fraktionen med det högsta
absorbansvärdet till ett nytt och märkt 1.5 ml Eppendorfrör. Frystorka detta prov
över natt (assistent visar), för senare analys med SDS-PAGE (se dag 4).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
24
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Dag 4
A.
Proteinproduktion och rening (fortsättning).
1. Lös upp det frystorkade proteinprovet i 10 µl 1 x Red-buffert ("Red" betyder att
bufferten innehåller ett reducerande ämne som bryter eventuella disulfidbryggor
inuti eller mellan proteiner).
2. Tillsätt 2.5 µl av 5 × Red-buffert (mer koncentrerad än 1 x Red) till det 10 µl-prov
som ni tog ut från supernatanten efter lyseringen av cellerna (dag 3).
3. Koka rören 5 min. (värmeblock eller vattenbad) med locket på. Centrifugera sedan
i några sekunder för att få ner lösningen i botten av röret.
4. Förbered en 20 % homogen polyakrylamidgel (av typen Phastgel) och ladda
1.2 µl av de två proven till gjorda ”reliefbrunnar” på en bit Parafilm (assistent
visar). Gå ihop gruppvis för att maximalt utnyttja Phastgelen.
Applicera kammen på brunnarna för att suga upp provlösning. Sätt sedan kammen
på hållaren i elektroforesenheten. Kör igång ett förprogrammerat
elektroforesprogram (med beteckningen "20 % homogen").
5. Efter avslutat elektrofores, överför gelen till infärgningsbadet och sätt igång ett
förprogrammerat program (med beteckningen "Coomassie-infärgning"). Låt gelen
torka efter avslutad infärgning varefter inplastning utförs (hjälp av assistent).
6. Assistenter scannar de inplastade gelerna digitalt och lägger upp dem på
labkurshemsidan där ni själva får hämta dem.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
25
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Riktlinjer för rapportskrivning
Rapporten skall innehålla:
1. Innehållsförteckning
1. En beskrivning över vad som gjorts innehållande teori, resultat och primärdata (i bilagor):
- mutagenesen
- plasmidpreparering
- gelelektrofores
- transformering, redogörelse för vilka tillsatser som finns i plattorna och varför
- PCR-amplifiering (inkl. längd hos PCR-produkten)
- konfirmatorisk sekvenering (med Pyrosekvenering)
- proteinproduktion (inkl. induktion av transkription) och analys av renat protein
2. En sekvensfigur (extrablad finns med som bilaga till denna handledning) med
hybridiseringslägena markerade för de olika oligonukleotiderna som användes
(mutagenes och PCR).
3. Tolkning av pyrogrammet och svar på vilket kodon (vilken aminosyra) som stoppkodonet byttes ut mot.
4. Utseendet hos ett hypotetiskt pyrogram för sekvenering av en 50/50-blandning av
vildtyp- och mutantsekvens (förutsatt samma dispenseringsordning).
5. Transformationsfrekvens (antal kolonier/µg DNA) samt mutationsfrekvens
(% gröna kolonier). Redovisa uträkningarna.
6. Beräknad extinktionskoefficient och svar på hur mycket protein som kunde renas
totalt (uttryckt i mg) samt utbytet (mg/liter odling). Tänk på att endast hälften av
materialet laddades på kolonnen.
7. Tolkning av SDS-PAGE-gelen.
8. Diskussion
- Misslyckades något? Teori om varför?
9. Utvärdering av laborationen (anonymt om så önskas):
- var den intressant/lärorik?
- var manualen lätt att följa?
- var genomgångarna bra?
- förslag på ändringar (innehåll, utförande)
OBS! Rapporten skall inlämnas elektroniskt (via e-mail) till assistenterna senast
inom en vecka efter laborationens slut. Assistenterna anger relevant e-mailadress.
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
26
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 1.
Plasmidkarta för målplasmiden
pZ-STOP-EGFP
…TAA…
Plac
Z
pZ-STOP-EGFP
3.6 kbp
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
27
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 2.
DNA-sekvens innehållande målsekvensen
för mutagenesen
... ACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGAT
TCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTC
ACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC
"-35"
"-10"
|Start Lac Z leader
|Start Z
ACACAGGAAACAGCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA
Met
Val
CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC
GCC TTC ATC CAA AGT TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC TTG CTA GCA GAA GCT
Slut Z|
AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA CAG ATC TAA TCG GAT CCC CGG GTA CCG GTC
Lys
|Start EGFP
GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG
CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC
ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG
CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ...
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
28
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 2. Extra kopia till rapport
DNA-sekvens innehållande målsekvensen
för mutagenesen
... ACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGAT
TCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTC
ACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC
"-35"
"-10"
|Start Lac Z leader
|Start Z
ACACAGGAAACAGCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA
Met
Val
CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC
GCC TTC ATC CAA AGT TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC TTG CTA GCA GAA GCT
Slut Z|
AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA CAG ATC TAA TCG GAT CCC CGG GTA CCG GTC
Lys
|Start EGFP
GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG
CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC
ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG
CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ...
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
29
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 3.
Oligonukleotider som används i laborationen
(mutagenes, PCR och pyrosekvenering)
Pyro-1:
5´- GTACCCGGGGATCCGATT -3´
R-primer:
5´- CCAGGATGGGCACCACCCCGGTG -3´
F-primer:
5´- Bio-GTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG -3´
Mut-1:
5´- GCGCCGAAACAGATCCAATCGGATCCCCGGGTA -3´
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
30
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 4.
Genetiska koden
Second position
First
position
U
UUU
UUC
UUA
UUG
C
CUU
CUC
CUA
CUG
A
AUU
AUC
AUA
AUG
G
GUU
GUC
GUA
GUG
PHE
LEU
LEU
ILE
MET
VAL
C
UCU
UCC
UCA
UCG
SER
CCU
CCC
CCA
CCG
PRO
ACU
ACC
ACA
ACG
THR
GCU
GCC
GCA
GCG
ALA
A
UAU
UAC
UAA
UAG
CAU
CAC
CAA
CAG
AAU
AAC
AAA
AAG
GAU
GAC
GAA
GAG
G
TYR
STOP
STOP
HIS
GLN
ASN
LYS
ASP
GLU
UGU
UGC
UGA
UGG
CGU
CGC
CGA
CGG
AGU
AGC
AGA
AGG
GGU
GGC
GGA
GGG
CYS
STOP
TRP
ARG
SER
ARG
GLY
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
Third
position
U
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
31
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 5.
Aminosyrasammansättning för fusionsproteinet Z-EGFP
Z-EGFP
Antal aminosyror: 317
Molekylvikt: 35673.3
Aminosyrakomposition:
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
(A)
(R)
(N)
(D)
(C)
(Q)
(E)
(G)
(H)
(I)
(L)
(K)
(M)
(F)
(P)
(S)
(T)
(W)
(Y)
(V)
17
8
21
23
2
16
20
22
10
16
29
26
8
15
16
15
19
1
12
21
5.4%
2.5%
6.6%
7.3%
0.6%
5.0%
6.3%
6.9%
3.2%
5.0%
9.1%
8.2%
2.5%
4.7%
5.0%
4.7%
6.0%
0.3%
3.8%
6.6%
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
32
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 6.
Formel för beräkning av ett proteins extinktionskoefficient
Proteinkoncentrationen uppskattas i den här laborationen
genom absorbansmätning vid 280 nm. Absorbansen och
proteinlösningens koncentration har följande samband:
Abs = ε * b * c1
Abs = absorbans 280 nm [dimensionslöst]
ε = molär extinktionskoefficient [L mol-1 cm-1]
b = kyvettlängd [cm]
c1 = proteinkoncentration [mol L-1]
Ofta vill man veta proteinets koncentration i enheten g/L
(= mg/ml). För sådana beräkningar finns följande samband:
Abs = a * b * c2
där: a = ε / Mw
a = extinktionskoefficient [L g-1 cm-1]
ε = molär extinktion [L mol-1 cm-1]
Mw = molvikt [g/mol]
c2 = proteinkoncentration [g L-1]
Den molära extinktionen beror av proteinets
aminosyrasammansättning. Följande formel används för
beräkning av den:
ε = Trp*5690 + Tyr*1280 + Cys*120
Trp = antal tryptofaner i proteinet
Tyr = antal tyrosiner i proteinet
Cys = antal cysteiner i proteinet
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
33
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 7.
Molekylvikter (kDa)
hos proteiner i markörmixen (SDS-PAGE)
92
66
43
30
20
14
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
34
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 8.
Längder (bp) hos fragmenten i markörmixen
"GeneRuler"
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
35
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 9.
Beskrivning av koncentrationsbestämningsmarkören
"Low DNA Mass Ladder"
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
36
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 10.
Beskrivning av plasmidpreparering från E. coli-celler
enligt kit från Qiagen
Cellular
debris
Cellular
debris
BACTERIAL CELL
CELL LYSIS
HIGH pH
DENATURATION
Chromosomal dsDNA
(double stranded)
Plasmid dsDNA
(double stranded)
NEUTRALIZATION
Chromosomal ssDNA
(single stranded)
Plasmid ssDNA
(single stranded)
Collapsed large
chromosomal DNA
(original basepairings
only partially restored)
Renatured plasmid dsDNA
(original basepairings
completely restored)
SELECTIVE
ADSORPTION
CENTRIFUGATION/
OF DNA TO SILICA
FILTRATION
Negatively charged SiO2
Water
molecules
Plasmid dsDNA
(negatively
charged)
Chaotropic salt
(attracts water)
Pure
plasmid DNA
”Released”
water molecules
(higher entropy)
Hydrogen bonds
ELUTION
WITH
LOW SALT
BUFFER
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
37
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 10 (forts.)
Översiktlig beskrivning av plasmidpreparering enl. kit från Qiagen.
1. Centrifugerade celler resuspenderas i en kontrollerad buffert (P1, som också innehåller
enzymet RNAse A som bryter ned RNA). Cellerna som innehåller kromosomalt DNA,
plasmid DNA (ca. 500 kopior/cell av den typ som används i labben) och andra
biomolekyler lyseras (sönderdelas) sedan med en alkalisk (högt pH) lösning (P2) som också
innehåller en detergent.
2. Det höga pH-värdet gör att de två DNA-kedjorna i dubbelsträngat DNA separareras från
varandra och att flertalet proteiner denatureras.
3. Provet pH-neutraliseras sedan med lösning N3 som också innehåller ett kaotrofiskt salt
(guanidiniumhydroklorid; strukturerar vatten kring sig). Neutraliseringen gör att vid detta
steg kan det relativt korta plasmid DNA´t återfå sin dubbelsträngade form emedan det
mycket större (längre) kromosomala DNA´t "kollapsar" till en olöslig form pga att de två
strängarna inte förmår hitta varandra perfekt och därför aggregerar tillsammans med
denaturerade proteiner.
4. Efter ett centrifugerings- eller filtreringssteg där olösligt material avlägsnas får provet
möta en kiselbaserad matris för uppbinding av lösligt DNA. Då både kiselytan och DNA
(via fosforgrupperna) är negativt laddade kan man undra hur DNA kan fås att fastna. Svaret
ligger i användandet av det kaotrofiska saltet. Dels har det en viss dämpande effekt på den
elektrostatiska repulsionen, och dels främjar det frisläppandet av ytbundna vattenmolekyler
hos DNA och kiselytan till lösningen. Det senare gör att DNA adsorberar till kiselytan via
en entropidriven reaktion (vattenmolekylerna får ökad entropi) där vätebindningar sedan
utbildas mellan kiselytan och DNA.
Vid detta kritiska steg är betingelserna (buffertkomposition) utprovade så att preferentiellt
DNA, och inte kvarvarande RNA-rester skall binda till kiselytan.
5. Efter tvätt med lösning PE (innehåller etanol) kan provet elueras från kiselytan med
lösning EB av låg saltkoncentration (som alternativ kan vatten användas).
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
38
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bilaga 10 (forts.)
Protokoll från leverantör (Qiagen)
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
39
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
40
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Molekylär Bioteknik, KTH
In vitro-mutagenes
Laborationshandledning
41
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------