Sträckning av nervceller och
kompression av makrofager
I denna artikel har två tekniker utvecklats för
att studera två typer av celldeformation.
Celler deformeras ständigt
Kroppens celler lever ett hårt liv. Varje dag blir
de både sammanpressade och uttänjda.
Ibland leder dessa mekaniska deformationer
till skador, som blåmärken och sträckta
muskler, men ofta märker vi inte av det. En hel
del forskning på hur cellerna reagerar på olika
mekaniska påfrestningar har gjorts.
En amerikansk forskargrupp har provat att
utsätta de bentillverkande cellerna i våra
skelett för ett varierande tryck. Vad de fann
var att om man utsatte dessa celler för
tryckvariationer med en styrka och ett
mönster som motsvarade en daglig promenad
på en timme så svarade cellerna med att
tillverka mer av de proteiner som är ansvariga
för benproduktion. Denna upptäckt kommer
inte som en chock för de flesta; det har länge
varit känt att om man har gipsat benet eller
Figur 1 Ett nervcellsutskott har vuxit på en yta som
sprack efter det att cellen dött.
armen och inte använder den på ett par
veckor så blir skelettet svagare just där. När
man sedan tar av gipset och börjar belasta
skelettet så tillverkas snabbt mer ben och
skelettet blir lika hårt som innan.
Även sträckning av celler har visats påverka
deras beteende. När ett ryggradsdjur växer
förlängs hela skelettet vilket sträcker
intilliggande vävnad. Ryggraden hos vissa djur,
t.ex. giraffer och blåvalar, kan förlängas med
upp till 3cm per dygn. Denna snabba tillväxt
sträcker också ut ryggmärgen vilken tvingas
växa lika snabbt för att inte skadas.
Figur 2 I denna anordning kan kvävgas användas för att böja ner ett polymertak. Pelarna som hänger från taket kan
då mosa celler mot botten av kammaren.
Figur 3 Anordning för sträckning av nervceller. Genom att separera glasskivorna sträcks kanalen och därmed
nervcellernas utskott.
1
En tysk forskargrupp har försökt
återskapa denna snabba tillväxt hos
Makrofager är kroppens renhållningsarbetare vars uppgift är att
nervcellerna genom att odla
sluka och bryta ner främmande partiklar, ex bakterier, i en
nervceller på två intilliggande
process som kallas fagocytos.
plattor. Efter några dagar hade
(A)
(B)
nervcellernas utskott växt från en
platta till den andra och förankrat
sig där. Då började gruppen
separera plattorna och på så vis
tvinga nervcellerna att antingen
växa snabbare eller gå sönder.
Figur 4 (A)En makrofag slukar främmande partiklar genom att (a)
Genom att dra allt snabbare under
omsluta partikeln och skapa en membransäck. Denna säck smälts
sedan samman med en annan säck som innehåller
flera veckor lyckades forskarna till
nedbrytningsenzymer (b). När partikeln har brutits ner skickas
slut komma upp i tillväxtresterna ut i en process kallas exocytos (c).
(B) Makrofager som fagocyterat lysande nanopinnar.
hastigheter på 1cm per dygn. Inte
mycket jämfört med girafferna men
oerhört mycket om man jämför med
vid de två glasskivorna. Anordningen visas i
normala tillväxthastigheter i laboratorier.
Figur 3.
Dessa brukar ligga närmare 200µm per dygn,
d.v.s. 50ggr långsammare.
När anordningen konstruerats odlades
Nervceller sträcks i en kanal med
pelare
I detta projekt har två anordningar utvecklats
för att kunna studera både sträckning av
nervceller och kompression av makrofager.
För att sträcka nervcellerna odlades dessa på
en gummiliknande genomskinlig polymer som
var fastsatt vid två glasbitar. Genom att låta
nervcellerna växa över gapet mellan de två
glasskivorna och sedan dra i dessa kunde
nervcellerna sträckas. För att försäkra sig om
att nervcellerna växte på rätt ställe skapades
en kanal som innehöll pelare. Pelarnas syfte
var att nervcellerna ska kunna ta tag i dessa
medan de växer. När man sedan sträcker
kanalen kommer nervcellerna sträckas på flera
ställen samtidigt.
Sträckningskanalen blev gjuten med tekniken
mjuk litografi som beskrivs på nästa sida. Efter
gjutningen byggdes en vägg runt kanalen för
att fungera som reservoar för cellernas
odlingsmedium och sedan fästes polymeren
nervceller i den. Nervcellernas utskott tog tag i
pelarna och slingrade sig fram, precis som
planerat. Denna kanal sträcktes sedan, både i
tio minuter under mikroskop och i 24 timmar i
en inkubator (37-gradig ugn för cellodling). I
båda fallen överlevde nervcellerna vilket tyder
på att tekniken går att använda för vidare
experiment
Figur 5 Nervcellsutskott slingrar sig mellan pelarna och
tar tag i dessa, precis som planerat.
2
Makrofager mosas av
nedhängande stolpar
Makrofagerna skulle placeras i en kammare
med glasbotten och polymertak. Genom att
fylla en liten hålighet ovanför kammaren med
kvävgas kunde taket tryckas ner. Från taket
hängde pelare vars uppgift var att pressa
cellerna mot golvet i kammaren.
Tryckanordningen tillverkades genom att först
gjuta själva odlingskammaren med mjuk
litografi och sedan limma fast en tub ovanpå.
Det hela göts sedan in i ett polymerblock
varpå tuben kopplades till kvävgaskällan, se
bild på första sidan. Anordningen fylldes aldrig
framgångsrikt med makrofager, framförallt
pga. tidsbrist men nedtryckningen av taket
testades och fungerade.
Mjuk litografi
I det här projektet består de båda
anordningarna av mönstrade polymerbitar.
För att tillverka dessa har tekniken mjuk
litografi använts. Denna teknik visas nedan
och går ut på att flytande polymer hälls på
en mönstrad yta, även kallad en master, där
man sedan låter den stelna. När den har
stelnat kan man dra bort den från ytan och
mönstret på mastern har då omvänts och
överförts till polymeren. Genom att göra ett
mönster av kullar på ytan kan man skapa ett
mönster av kanaler i polymeren.
Fluorescens ger möjlighet att
studera membranmobilitet och
fagocytos
Nu när de båda anordningarna framgångsrikt
konstruerats kan de användas för att studera
hur celler svarar på mekanisk deformation.
Projektet sträckte sig bara till utformningen
och produktionen av anordningarna så dessa
experiment utfördes aldrig.
Fluorescenta färgämnen kan användas för att
studera en mängd olika företeelser i en
cellkultur. Dessa ämnen lyser i en färg när de
blir belysta av ljus i en annan färg. Det finns en
mängd olika sådana färgämnen som bara
fungerar vid speciella tillfällen och detta
utnyttjas ofta för att studera hur celler beter
sig. Här följer några exempel på hur
fluorescenta ämnen kan användas tillsammans med de framställda anordningarna
för att lära oss mer om hur celler beter sig.
Den
maximala
deformationen
kan
bestämmas genom att tillsätta ett färgämne
som bara färgar döda celler och sedan pressa
eller dra i cellerna. När cellerna blir färgade
har de dött och då vet man vid vilket tryck
eller vid vilken förlängning de dör. Detta
experiment är bra att börja med så att man
vet hur mycket cellerna tål innan man utför de
mer avancerade experimenten.
Det finns färgämnen som enbart binder till
specifika proteiner. Genom att tillsätta sådana
till två cellodlingar där den ena deformerats
kan man genom att jämföra ljusstyrkan hos de
olika cellerna se om de deformerade cellerna
utrycker mer eller mindre av det undersökta
proteinet. Då proteinerna är en central del av
cellernas beteende kan man på detta sätt se
om deras beteende på något vis har ändrats
och då också hitta de proteiner som är
ansvariga.
Figur 6 Principskiss för mjuk litografi som
beskrivs ovanför.
3
Ett cellmembran består av en massa små
molekyler som flyter runt men ändå bildar en
kompakt yta, ungefär som en simbassäng
vars yta täckts av pingisbollar. Genom att
färga dessa molekyler och sedan rikta en smal
laserstråle mot en punkt på membranet kan
man släcka molekylerna på en liten yta och på
så vis skapa en svart fläck på en annars
lysande bakgrund. Då molekylerna ständigt är
i rörelse och byter plats, precis som
pingisbollarna skulle göra om någon hoppade i
bassängen, kommer den mörka fläcken snart
att försvinna då de släckta molekylerna sprids
ut. Hur snabbt fläcken försvinner beror på hur
snabbt molekylerna kan flytta sig. . Kanske
ändras mobiliteten som följd av att
membranet
spänns
genom
mekanisk
deformation.
UV litografi
Mastern som används för mjuk litografi har
tillverkats med en process som kallas UVlitografi, en välanvänd teknik inom
elektroniktillverkning där den används för att
tillverka i stort sett alla elektroniska
komponenter i dagens datorer.
Principen bakom UV-litografi visas nedan och
kan kort beskrivas som att en UV känslig
polymer, även kallad resist, läggs på en yta.
Genom att lysa med UV-ljus i ett visst mönster
på ytan kan sedan de delar av polymeren som
blivit belyst tas bort (positiv resist). Det finns
även polymerer som reagerar på omvänt sätt,
d.v.s. de delar som inte blivit belysta tvättas
bort (negativ resist). Vid mjuk litografi är det
just detta resistmönster man vill åt medan
man i elektronikindustrin vill exponera den
underliggande skivan för vidare modifikation.
Fluorescenta nanopinnar kan användas för
att studera fagocytos hos makrofager. I Figur
4 visas hur en odling med makrofager har
matats med färgade nanopinnar för att
studera fagocytos. Genom att variera bl.a.
temperaturen har man kunnat ändra
upptagningstakten av pinnarna. Genom att
klämma makrofagerna medan de äter kanske
man kan få dem att spotta ut pinnarna igen.
Kalciumjoner är väldigt viktiga för
kommunikation mellan nervceller.
Varje gång ett meddelande skickas
sker detta genom att kanaler öppnas i
den mottagande cellen och dessa
joner släpps in. Genom att tillsätta ett
färgämne som lyser extra starkt i
närheten av kalcium kan man se vilka
celler som tar emot meddelanden då
dessa kommer att blinka. Om man
kombinerar detta med sträckning kan
Figur 8 Nervceller man se om cellerna svarar genom att
färgade med ett signalera.
Vissa
nervceller
är
ämne som reagerar specialiserade på att ta emot
på kalcium.
Kommunicerande mekaniska signaler och dessa borde
celler ser ut att
reagera genom signalering.
blinka.
Figur 7 UV-litografi med negativ resist beskrivs
ovanför och används för att tillverka masters för
mjuk litografi.
Ett öppet fält
Ingen vet riktigt hur makrofager reagerar på
kompression och sträckning av nervceller är
fortfarande ett i stort sett outforskat område.
Dessa båda polymeranordningar ger ett
användbart verktyg för att utforska dessa
områden. Det finns inte heller något som
säger att inte andra celler kan undersökas.
Denna artikel är skriven av Henrik Persson och är en
sammanfattning av examensarbetet Neuron Stretching and
Macrophage Compression utfört av den samme höstterminen
2008 vid Lunds Tekniska Högskola.
4
