Institutionen för laboratoriemedicin
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete C-nivå, 15 poäng
Biomedicinsk laboratorievetenskap
Vårtermin
Zoledronsyra nedreglerar
uttrycket av IL-2α receptorn på
regulatoriska T-lymfocyter
1. Sammanfattning
Regulatoriska T-lymfocyter (Treg) är en subpopulation av T-lymfocyter som kan negativt
reglera immunförsvaret. Ett lågt antal Treg är förenat med en ökad autoimmunitet. Treg kan
reglera tillväxt och aktivitet av T-effektor och NK celler genom produktionen av det antiinflammatoriska cytokinen transformerande tillväxtfaktor beta (TGF- β). Ett högre antal Treg
i tumörvävnad är associerat med en sämre prognos. Det är därför viktigt att selektivt ta bort
Treg i patienter med cancer för att förstärka den antitumöra aktiviteten. Treg är beroende av
ett högt uttryck av hög-affinitetsreceptorn interleukin-2 (IL-2) alfa (CD25). Zoledronsyra
(ZA) är en bisfosfonat som kan aktivera γδ T-celler. Studiens hypotes är att om behandling
med ZA nedreglerar uttrycket av CD25 hos Treg, kommer den anti-tumöraktiviteten att
förbättras. Isolerade CD3+ celler behandlades med IL-2, ZA och färgades därefter med
flourokromkonjugerade antikroppar för att identifiera olika subpopulationer av T-celler som
sedan analyserades med flödescytometri (FACS). Resultatet visade att Treg in vitro får en
uppreglering av IL-2R efter behandling med IL-2 (p=0,0018). Behandling med ZA av IL-2
aktiverade Treg resulterade i ett nedreglerat IL-2R uttryck hos Treg. Våra resultat kan ge stöd
för nya behandlingsmetoder inom immunterapi mot cancer efter behandling med IL-2 och
ZA.
2
2. Innehållsförteckning
1. Sammanfattning .................................................................................................................. 2 2. Innehållsförteckning ........................................................................................................... 3 3. Förkortningar ...................................................................................................................... 4 4. Introduktion......................................................................................................................... 5 5. Material och Metod ............................................................................................................. 8 5.1 Material ............................................................................................................................ 8 5.2 Cellisolering och förberedelse .......................................................................................... 8 5.3 IL-2 och ZA behandling av celler .................................................................................... 8 5.4 Extracellulär CD3+ CD4+ CD25+ och intracellulär Foxp3 TGF-B färgning .................... 9 5.5 Databearbetning ............................................................................................................... 9 6. Resultat ............................................................................................................................. 10 6.1 Strategi för FACS-analys ............................................................................................... 10 6.2 IL-2 uppreglerar IL-2 receptor hos regulatoriska T-celler ............................................. 10 6.3 IL-2R uttrycket får störst uppreglering efter tre dygn .................................................... 12 6.4 ZA behandling nedreglerar IL-2R uttrycket................................................................... 13 6.5 Oförändrad TGF-β produktion efter ZA behandling...................................................... 13 6.6 Effekt av IL-2 och ZA på Treg frekvens ........................................................................ 15 7. Diskussion ......................................................................................................................... 16 8. Tillkännagivanden............................................................................................................. 19 9. Referenser ......................................................................................................................... 20 3
3. Förkortningar
BSA
Bovint serum albumin
CD
Kluster av differentiering
DPBS
Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning
EDTA
Etylendiamintetraättiksyra
FACS
Flödescytometri
Foxp3
Transkriptionsfaktorn forkhead box protein 3
FPP syntetas
Farnesylpyrofosfatsyntas
IL-2
Interleukin-2
MFI
Medelvärde av den fluorescerande intensiteten
NK celler
Naturliga mördarceller
Teff
T-effektorceller
TGF-β
Transformerande tillväxtfaktor beta
TRAIL
TNF-relaterad apoptosinducerande ligand
Treg
Regulatoriska T-lymfocyter
ZA
Zoledronsyra
4
4. Introduktion
Intresset för immunterapi mot cancer har ökat på senare år. I takt med detta har förståelsen för
hur immunförsvaret känner igen och dödar maligna celler ökat. Detta har också gett en större
insikt i de mekanismer som tumörceller använder för att undkomma immunförsvaret, vilket
har gett en bra grund för framtida terapeutiska ingrepp med adoptiv överföring av
immunceller. Adoptiv cellbaserad immunoterapi introducerades först av Dr. Rosenberg på
NIH (National Institute of Health) i USA (1), och används idag på ett flertal kliniker över hela
världen. Terapin är baserad på att stimulera patientens egna, eller en annan givares,
immunceller ex-vivo för att bli specifika mot cancerceller för att därefter överföras till
patienten. Den mest studerade formen av cellterapi är T-cellsterapi, där tumörinfiltrerade Tlymfocyter isoleras fram, mass-expanderas, och därefter överförs tillbaka till patienten(2, 3).
Immunförsvaret har till uppgift att skydda kroppen mot smittsamma mikroorganismer och
består av två stora delar, det medfödda (naturliga) och det specifika (adaptiva)
immunförsvaret(4). I det medfödda immunförsvaret ingår naturliga mördarceller (NK celler)
som är cytotoxiska lymfocyter vilka kan döda virusinfekterade- och tumörceller utan en
tidigare antigenstimulering(5). En annan viktig del av det naturliga immunförsvaret är
cytokiner, vilka är små proteiner som har till funktion att reglera och koordinera aktiviteten av
och mellan många celler. Det specifika immunförsvaret, som består av B- och T-lymfocyter
reagerar, till skillnad från det medfödda immunförsvaret, senare och mot specifika främmande
antigener (6).
I tymus genomgår T-lymfocyter en s.k. negativ selektion vilket innebär att T-celler som
reagerar på självantingen med en hög affinitet(7) ska selekteras bort och endast de celler som
klarar av den negativa selektionen utvecklas till mogna T-lymfocyter. Dock kan vissa självreaktiva T-effektorceller (Teff) undkomma den negativa selektionen och orsaka
autoimmunitet(8). Den process genom vilken immunsystemet inte reagerar mot självantigener kallas immunologisk tolerans(9). T-lymfocyter delas in i s.k. CD4+ T-hjälparceller
och CD8+ cytotoxiska celler. CD4+ celler hjälper B-lymfocyter att producera antikroppar och
hjälper CD8+ celler med att känna igen ett främmande antigen. CD8+ cytotoxiska celler kan
känna igen främmande antigener med hjälp av antigenpresenterande celler eller utan hjälp av
andra celler, och döda redan infekterade celler (10, 11).
5
I den tidiga utvecklingen av CD4+ T-celler kan de differenseras till en undergrupp som har till
funktion att reglera immunförsvaret vid en inflammation eller autoimmunitet. Dessa celler
kallas för regulatoriska T-lymfocyter (Treg) vilka ingår i den immunologiska toleransen (12).
Treg förekommer i två olika former, naturligt förekommande Treg (nTreg) och inducerade
Treg (iTreg) (13). nTreg utvecklas i tymus genom att undkomma den negativa selektionen
och överlever perifert. Däremot, differensers iTreg perifert från CD4+ T–celler som redan
blivit stimulerade av olika cytokiner i omgivningen, exempelvis interleukin-2 (IL-2)(14).
Karakteristiskt för båda varianterna av Treg (iTreg, nTreg) är det höga uttrycket av
ytreceptorn interleukin-2α (IL-2α, CD25)(15), men även för den intracellulära
transkriptionsfaktorn forkhead box protein 3 (Foxp3)(16). Treg identifieras därför som
CD4+CD25+Foxp3+ (17).
Det första cytokinet som produceras från CD4+ T-celler efter aktivering är IL-2. IL-2 är en
tillväxtfaktor för NK-celler och T-lymfocyter, men även för Treg(18, 19). T-celler binder och
reagerar på IL-2 genom ett ökat uttryck av IL-2 receptor (IL-2R) på sin yta(20). IL-2R består
av tre komponenter, αβγ (alfa, beta och gamma) kedjor vilka binder med olika affinitet
(dragningskraft) till IL-2, där α-kedjan binder starkast. Naiva T-celler uttrycker bara βγ
kedjorna och kan därför inte binda till IL-2 med hög affinitet, dock kan de efter en aktivering
börja uttrycka den tredje kedjan α, vilket gör att de kan binda starkt till IL-2 (21, 22).
Tack vare kunskapen att IL-2 ökar expansionen av tumörspecifika T-celler, gav den en
möjlighet att användas som terapeutisk substans i cancerpatienter. En nackdel med att
använda IL-2 i cancerpatienter, är att den samtidigt leder till en stimulering av Treg(23-25).
I tidigare studier har man visat att i en tumörmiljö kan funktionen av tumörinfiltrerade
lymfocyter (TILs) inhiberas av Treg genom produktionen av anti-inflammatoriska cytokiner,
som transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-β) (26-28). Därför kan Treg tillåta tumörceller
att växa okontrollerat.
Zoledronsyra (ZA, Zometa) är en bisfosfonat som används för att minska mängden kalcium i
blod och för att förebygga benkomplikationer hos patienter med benmetastaser.
Patienter med benmetastaser som har behandlats med ZA har uppvisat minskade
skelettrelaterande problem samt förlängd överlevnad(29, 30). I en ny studie har man kunnat
visa att ZA kan öka uttrycket av receptorn TRAIL på NK-celler som samodlats med
monocyter in vitro. Vid närmare undersökning visade det sig att monocyter som behandlats
med ZA har ett högre uttryck av IL-2R. Dessa monocyter producerar efter behandling med
6
IL-2 höga nivåer av den inflammatoriska cytokinen interferon-gamma (IFNγ)(31). I motsats
till detta, indikerar våra preliminära observationer att behandling med ZA resulterar i ett
minskat uttryck av IL-2R på Treg. Vi hypotiserar att uttrycket av IL-2 receptorer nedregleras
på Treg efter behandling med ZA och att dessa ZA behandlade Treg har en minskad
supression av Teff och NK-celler. Syftet med denna studie är att undersöka IL-2R uttrycket
hos T-lymfocyter, med fokus på Treg, efter behandling med ZA och IL-2. Vidare kommer vi
att undersöka om nedregleringen av IL-2R hos Treg kan leda till en ökad aktivitet av Teff och
NK celler.
7
5. Material och Metod
5.1 Material
Användning av det humana materialet i studien är godkänt av etikprövningsnämnden i
Stockholm (20010305,01–50). Frysta humana mononukleära celler från perifert blod (PBMC)
från fem friska givare analyserades.
5.2 Cellisolering och förberedelse
PBMC från friska givare förbehandlades med 60µg/ml DNAs (Fermentas inc, Hanover, MD,
USA) i en inkubator konditionerad med 5 % CO2 och 37° C i 30 minuter. Cellerna tvättades
med x-vivo 20 medium (Lonza, verviers, Belgium), centrifugerades i 1300 rpm i 5 minuter
och pelleten resuspenderades i MACS buffert (DPBS, 3 % BSA, 2mM EDTA).
Därefter räknades cellerna genom att de färgades med trypanblått, som överfördes till en
cellkammare och räknades i en cellräknare (Countness® automated cell counter, invitrogen,
Eugene, Oregon, USA). T-cellerna (CD3+) isolerades sedan från PBMC genom en positiv
selektion med anti-CD3 mikrobeads enligt tillverkarens instruktioner (Miltenyi Biotec inc,
CA, USA). Kort beskrivet inkuberades PBMC med anti- CD3 mikrobeads (20µl per 107 ) och
MACS buffert (80µl per 107) i 4°C i 15 minuter. Cellerna tvättades sedan med MACS buffert
1-2 ml per 107 celler och centrifugeras i 1300rpm i 10 minuter. Cellerna separerades med
MACS kolonn (Miltenyi Biotec) och räknades som tidigare beskrivet.
5.3 IL-2 och ZA behandling av celler
CD3+ celler odlades i en 24-hålsplatta med en täthet av 1 x 106/ml med x-vivo 20 medium
kompletterad med 10 % värmeinaktiverat humant AB-serum (Karolinska sjukhuset,
Stockholm, Sverige). Cellerna behandlades i närvaro samt i frånvaro av IL-2 (Novartis
Pharma GmbH, Nurnberg, Germany) med koncentrationerna 30U/ml eller 500U/ml och eller
ZA (10µM, Novartis Pharma GmbH, Nurnberg, Germany). Cellkulturen inkuberades i 37° C i
inkubator under 3 dygn. Efter odlingen skördades cellerna och behandlades med 1:1 000
monensin och brefeldin A lösning (Biolegend, San diego, CA, USA). Sedan färgades cellerna
för extracellulära och intracellulära markörer under 3 dygn. Cellerna i FACS buffert
analyserades sedan med flödescytometri (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) och
data från flödescytometri analyserades med FlowJo software (TriStar, Ashland, USA).
8
5.4 Extracellulär CD3+ CD4+ CD25+ och intracellulär Foxp3 TGF-B färgning
Isolerade CD3+ celler (~2 x105 celler) skördades i FACS-rör med FACS buffert (DPBS, 3 %
BSA, 2mM EDTA). Celler färgades in med mus anti-humana fluorokromkonjugerade
antikroppar mot, Pacific orange-märkt CD3+ (1:30, Invitrogen corporation, Carlsbad, CA,
USA) eller APC-märkt (1:50, Immunotools, friesoythe, Germany), Percp- CD4+ (Biolegend,
San diego, CA, USA), APC- CD25+ (1:7, BD Biosciences, San diego, CA) eller PE (1:25,
Miltenyi Biotec inc, CA, USA), med en negativ isotypskontroll, anti-mus IgG2b PE-märkt
(Immunotools) eller APC- IgG1 (1:600, Immunotools). Därefter fixerades och
permabiliserades cellerna med 1x cytofix/cytoperm (BD Biosciences, San diego, CA) och
inkuberades i 20 minuter, 4°C. Cellerna tvättades med 1x permawash (BD Biosciences).
Därefter färgades cellerna intracellulärt med mus anti-humana fluorokromkonjugerade
antikroppar mot Foxp3 FITC-märkt (1:5, Biolegend, San diego, CA, USA) och
TGF-β PE-märkt (1:13, R & D system, Minneapolis, USA) med en negativ isotypskontroll,
anti-mus IgG1 PE (Biolegend) eller IgG1 FITC (1:600, Biolegend). Cellerna i FACS buffert
analyserades sedan med flödescytometri. Data från flödescytometri analyserades med FlowJo
software. Gating inom flödescytometri är en viktig process för att kunna identifiera olika
cellpopulationer av intresse i ett prov för vidare analyser. Gatning-strategi beskrivs i fig. 1.
5.5 Databearbetning
Resultaten analyserades med parat t-test, och p-värden under 0.05 bedömdes som statistiskt
signifikanta mellan de IL-2, ZA- behandlade och obehandlade grupperna. Ett gruppvis t-test
kunde inte användas eftersom analyserna inte var jämförbara då olika fluorokromkonjugerade
antikroppar användes vid de olika försöken.
För antal givare (n) se särskild analys. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse av den
fluorescerande intensiteten (MFI) och ratio.
9
6. Resultat
Syftet med denna studie var att undersöka IL-2R uttrycket hos T-lymfocyter, med fokus på
Treg, efter behandling med ZA och IL-2. Syftet var också att undersöka om nedregleringen av
IL-2R hos Treg kan leda till en ökad aktivitet av Teff.
6.1 Strategi för FACS-analys
Som grund för alla analyser användes FlowJo software. Isolerade CD3+ celler färgades för
CD3, CD4, CD25 och Foxp3 och analyserades med FACS och olika cellpopulationer gatades
fram(Fig.1).
Lymfocyter
Singel-celler
Regulatoriska T-celler
Fig1. FlowJo-analys
Figuren illustrerar de olika stegen i analysprocessen med Flowjo. Först gatades lymfocyter med side scatter
(SSC) på Y-axeln och forward scatter (FSC) på x-axeln. Sedan gatades singel-celler fram med FSC-höjd på Yaxeln mot FSC-area på x-axeln. Därefter gatades CD3+ och CD4+ celler. Från CD4+ populationen kunde Foxp3+
celler gatas fram.
10
6.2 IL-2 uppreglerar IL-2 receptor hos regulatoriska T-celler
CD3+ T-celler från PBMC (n=1) behandlades med samt utan IL-2 i två olika koncentrationer
(30U/ml samt 500U/ml) under tre dygn. Därefter färgades T-celler för CD3, CD4, CD25 och
Foxp3 och analyserades sedan med flödescytometri. Treg (Foxp3+) som inte behandlades med
IL-2 hade ett högre uttryck av IL-2R (CD25) jämfört med Teff (Foxp3-) (Fig. 2A, B). En
uppreglering av IL-2R uttrycket kunde observeras efter behandling med 30U IL-2 hos Foxp3+
T-celler (Fig.2A). Dessutom observerades även en minimal uppreglering hos Foxp3- T celler
med 30U behandling (Fig.2B). Behandlingen med 500U IL-2 gav en tydlig ökad uppreglering
av IL-2R hos både Foxp3+ och Foxp3- T celler (Fig. 2A, B). Då fler givare undersöktes (n=3)
kunde en statistisk signifikant skillnad uppmätas (p=0,0018) mellan de obehandlade (-IL-2)
och behandlade cellerna (500U/ml IL-2). Skalan i figur 2A är 10 gånger så stor som i figur 2B
pga det högre uttrycket av IL-2R hos Foxp3+ celler.
Fig2. Behandling avT-celler med samt utan IL-2.
Isolerade T-celler (n=1) behandlades med eller utan IL-2 i tre dygn. T-cellerna färgades med
fluorokromkonjugerade antikroppar mot CD3+, CD4+, CD25+ och Foxp3. I grafen visar Y-axeln MFI (mean
flourescens intensity) av IL-2R och X-axeln visar typ av behandling. Ett representativt experiment av tre visas.
11
6.3 IL-2R uttrycket får störst uppreglering efter tre dygn
T-celler (CD3+) behandlades med samt utan IL-2 i två olika koncentrationer (30U och 500U).
I en kinetisk studie av IL-2R uttryck har cellerna odlats i tre dygn och färgades dagligen för
att studera uppregleringen av receptorn efter IL-2 behandling hos Foxp3+ och Foxp3- (n=1).
Både Foxp3+ och Foxp3- T-celler uppvisade efter två dygns inkubering med 500U IL-2 en
minimal uppreglering av IL-2R jämfört med 30U och första dagen (Fig.3A, B). Efter tre
dygns inkubering med 500U IL-2 kunde en högre uppreglering av receptorn observeras främst
hos Treg (fig.3A). Däremot kunde inte 30U IL-2 riktigt uppreglera IL-2R varken
hos Treg eller Teff (Fig.3A, B). En annan observation är att IL-2R uttrycket nedregleras efter
tre dygns hos Foxp3+ T-celler som inte behandlats med IL-2 (Fig.3A). Skalan i figur 3A är 10
gånger så stor som i figur 3B pga det högre uttrycket av IL-2R hos Foxp3+ celler.
A
B
IL -2 R -F o x p 3 +
1500
IL -2 R -F o x p 3 -
150
-IL 2
-IL 2
30U
30U
500U
500U
M FI
100
M FI
1000
500
50
0
0
D 1
D 2
D 3
D 1
D 2
D 3
Fig3. Behandling av T-celler med samt utan IL-2 i tre dygn
Isolerade CD3+ T-celler (n=1) behandlades med samt utan IL-2 i tre dygn. T-cellerna färgades med
fluorokromkonjugerade antikroppar mot CD3+, CD4+CD25+ och Foxp3+ dagligen. I grafen visar Y-axeln MFI
(medelvärdet av den fluorescerande intensiteten) av IL-2R och X-axeln visar antal dagar efter behandling. Ett
representativt experiment av tre visas.
12
6.4 ZA behandling nedreglerar IL-2R uttrycket
T-celler (CD3+) behandlades med eller utan IL-2 (500U) och/eller ZA(10µM) i tre dygn och
färgades därefter för IL-2R uttrycket (n=4). En tydlig nedreglering av IL-2R uttrycket
observerades hos Treg (Foxp3+) efter behandling med IL-2 och ZA jämfört med enbart IL-2
(p=0,1550) (Fig.4A). Däremot påverkades inte IL-2 uttrycket på Teff efter behandling med
ZA och IL-2 jämfört med enbart IL-2 (p=0,2282) (Fig.4B). Som negativ kontroll användes de
prover där IL-2 inte hade tillsats (data visas inte). Skalan i figur 4A är större än figur 2B pga
det högre uttrycket av IL-2R hos Foxp3+ celler.
A p= 0,1550
IL - 2 R - F o x p 3 -
150
+ IL - 2
p= 0,2282
+ IL - 2
IL 2 + Z A
800
IL 2 + Z A
100
600
M FI
M FI
B IL - 2 R - F o x p 3 +
1000
400
50
200
0
+ IL - 2
IL 2 + Z A
0
+ IL - 2
IL 2 + Z A
Fig4. IL-2 uttrycket p T-celler efter behandling med IL-2 och ZA
Isolerade celler (n=4) behandlades med IL-2 (500U), och eller utan ZA i tre dygn. T-cellerna färgades med
fluorokromkonjugerade antikroppar mot CD3+, CD4+, CD25+ och Foxp3+. I grafen visar Y-axeln MFI medelvärdet
av den fluorescerande intensiteten) av IL-2R och X-axeln visar typ av behandlingar. Grafen visar medelvärde ±
standardavvikelse, p-värden beräknades med parat t-test mellan de ZA-behandlade och obehandlade grupperna
(n=4).
13
6.5 Oförändrad TGF-β produktion efter ZA behandling
Vid samma försök som nämnts ovan undersöktes även TGF-β produktionen hos T-cellerna
(n=2).
TGF-β produktionen är mycket högre hos Foxp3+ celler jämfört med Foxp3- celler, både i
frånvaro och i närvaro av IL-2 (Fig.5A, B). Efter behandling med ZA minskade produktionen
av TGF-β hos Treg (Foxp3+) till samma nivån som utan behandling med IL-2 (Fig.5A). Dock
observerades ingen effekt av ZA-behandlingen på TGF-β produktionen hos Teff (Foxp3-)
(Fig.5B).
A B T G F -B F O X P 3 +
T G F -B F O X P 3 -
600
600
- IL 2
- IL 2
+ IL - 2
+ IL - 2
IL 2 + Z A
IL 2 + Z A
400
M FI
M FI
400
200
200
0
0
- IL 2
+ IL - 2
IL 2 + Z A
- IL 2
+ IL - 2
IL 2 + Z A
Fig5. Produktion av TGF-β efter behandling med IL-2 och ZA.
T-cellerna färgades med fluorokromkonjugerade antikroppar mot CD3+, CD4+, CD25+, FOXP3+ och TGF-β. I
grafen visar Y-axeln MFI (mean flourescens intensity) av TGF-β och X-axeln visar typ av behandlingar. Grafen
visar medelvärde ± standardavvikelse från två experiment.
14
6.6 Effekt av IL-2 och ZA på Treg frekvens
Effekten av IL-2 och ZA studerades på frekvensen av Treg i förhållande till CD4+ (n=4). Efter
behandling med IL-2 (500U) var ratio av Foxp3+:CD4+ högre (Fig.6A). Däremot var ratio
oförändrat efter tillsats av ZA (10µM) (Fig. 6B). Skalan i figur 6A är 10 gånger så stor som i
figur 6B pga högre Treg frekvens efter behandling med IL-2.
A B IL - 2 e f f e k t
+ IL - 2
-IL 2
+ IL - 2
10
5
R a t io : F O X P 3 + : C D 4 +
R a t io : F O X P 3 + : C D 4 +
Z A e f fe k t
1 .5
15
IL - 2 + Z A
1 .0
0 .5
0 .0
0
- IL 2
+ IL - 2
+ IL - 2
IL - 2 + Z A
Fig6. Effekten av IL-2 och ZA behandling på Treg frekvens.
Isolerade T-celler odlades i närvaro och frånvaro av IL-2 och ZA i tre dagar. Procenten av Treg och CD4+ celler
räknades med hjälp av FlowJo. Behandlingen utan IL-2 (A) och behandlingen med 500U (B) sattes till en bas-ratio
med värdet 1. Grafen visar medelvärde ± standardavvikelse från fyra olika experiment.
15
7. Diskussion
I denna studie har vi undersökt om IL-2 receptorn och TGF-β produktionen nedregleras hos
Treg efter behandling med IL-2 och ZA. Om en nedreglering förekommer så är vår hypotes
att Treg blir mindre suppresiva för Teff och NK-celler i en tumörmiljö. Detta i sin tur kan leda
till en effektivare immunterapi mot cancer.
Tidigare forskning har visat att IL-2 aktiverar och prolifererar Treg genom att binda till IL-2R
(24). Vi började därför med att behandla T-celler med en låg och en hög IL-2-dos (30U och
500U) för att säkerställa andras resultat. Vi kunde visa att en låg dos IL-2 (30U) räckte för att
uppreglera IL-2R hos Treg, däremot behövdes en högre dos IL-2 (500U) för att uppreglera
receptorn hos övriga T-celler. Vi valde därför att gå vidare med 500U IL-2 genom resten av
studien. Därutöver visar våra resultat att uttrycket av IL-2R hos Foxp3+ är mycket högre än
hos Foxp3- celler. Möjligtvis är inte behandling med endast IL-2 tillräcklig för att uppreglera
receptorn hos Teff och därför krävs andra cytokiner för att stimulera receptorn, exempelvis
interleukin-4(IL-4) (32).
För att undersöka IL-2 uttrycket över tid efter aktivering med IL-2, odlades T-cellerna i tre
dygn och analyserades dagligen. Det är känt från tidigare studier att det krävs en längre tid för
T-cellerna att uttrycka aktiveringsmarkörer efter behandling med IL-2(33). Våra resultat
visade att både Foxp3+ och Foxp3- hade något högre uppreglering av IL-2R uttryck efter två
dygn med behandling av 500U IL-2. Dessutom uppvisade båda populationerna av T-celler
högst uppreglering av IL-2R efter 3 dygn av behandling med 500U IL-2, dock främst hos
Foxp3+ celler. Treg som inte behandlats med IL-2 uppvisade ingen nedreglering av IL-2R
uttrycket efter tre dygns odling. Detta kan bero på att överlevad och aktivering av Treg är
beroende av IL-2(34). Vidare har vi visat att Teff har ett mycket lägre IL-2R uttryck jämfört
med Treg. Eftersom naiva T-celler endast uttrycker βγ kedjorna av IL-2 receptorn kan
cellerna inte binda IL-2 med stark affinitet(6). Detta kan förklara varför Teff inte har en hög
uppreglering av IL-2R efter IL-2 behandling till skillnad från Treg. En annan förklaring kan
vara att Teff uttrycker en mycket lägre α-kedja och därför teoretiskt kan binda till färre IL-2
molekyler.
ZA är en bifosfanat som vanligen används kliniskt mot benskörhet och i samband med
benmetastaser hos cancerpatienter (29). ZA är en analog till isoprenoid difosfat lipider, och
16
hämmar farnesylpyrofosfatsyntas (FPP syntetas) som är ett enzym i mevalonatvägen.
Mevalonatvägen är en signaleringsväg för cellmetabolismen där slutprodukten är kolesterol.
Inhiberingen av enzymet påverkar en mängd olika proteiner i signalkaskaden(35). Dock är det
fortfarande inte känt vart ZA binder hos Treg. Behandling med ZA av monocyter har i en
tidigare studie visat positiv påverkan av IL-2R(31). I denna studie undersöker vi hur ZA
påverkar T-lymfocyter, specifikt Treg. Våra resultat visar att Treg får en nedreglering av IL2R efter behandling med ZA och IL-2 jämfört med de celler som behandlats med endast IL-2.
Dock var skillnaden inte statistiskt signifikant, möjligen för att vi undersökte för få givare
(n=4).
Foxp3- celler som behandlats med ZA och IL-2 uppvisar ingen nedreglering av IL-2R jämfört
med behandlingen med endast IL-2. En möjlig förklaring är att ZA påverkar IL-2R, men
eftersom Foxp3- celler inte hade en hög uppreglering av IL-2R kunde inte ZA inhibera
receptorn. I projektets fortsättning kommer fler givare att undersökas för att bekräfta våra
resultat. Om det stämmer att Foxp3-celler inte påverkas av ZA behandling skulle det innebära
att Teff-celler skulle kunna utföra sin funktion i en tumörmiljö utan att få en inhiberande
funktion av ZA.
I samband med IL-2 och ZA behandlingen undersöktes även TGF-β produktionen som är en
anti-inflammatorisk cytokin. Tidigare studier indikerar att TGF-β som producerats av Treg
inhiberar funktionen av Teff och NK-celler(36, 37). Det är dock oklart om IL-2 stimulering
inducerar produktionen av TGF-β hos Treg. Våra resultat visade att Foxp3+ celler producerar
mer TGF-β jämfört med Foxp3- celler. Däremot observerades en liten minskning av TGF-β
produktionen efter behandling med IL-2 och ZA hos Foxp3+ celler, men förblev i stort sätt
opåverkad hos Foxp3- celler. Det förekom dock ingen tydlig skillnad i TGF-β produktionen
mellan de celler som behandlats med samt utan IL-2 hos Foxp3+ celler. Eftersom den ökning
vi såg av TGF-β produktionen var så liten kan vi inte riktigt säga om IL-2 behandlingen
verkligen inducerar produktionen av TGF-β hos Foxp3+ celler. Då TGF-β produktionen är ett
funktionstest, kan vi inte i det här fallet avgöra om funktionen av Treg påverkas av ZAbehandlingen. Vi hade för få givare (n=2) i detta försök för att kunna utföra ett t-test och
avgöra statistisk signifikans. En alternativ metod för att undersöka TGF-β produktionen hade
kunnat vara att analysera med kvantitativ enzymkopplad immunadsorberande analys
(ELISA), där mängden TGF-β mäts mot en standardkurva. En ELISA hade kunnat användas
för att ge stöd till resultaten från FACS-analysen.
17
Vi undersökte även ratio mellan Foxp3+ och CD4+ för att undersöka effekten av IL-2 och ZA
på frekvensen av dessa populationer. Våra resultat indikerade att IL-2 behandlingen ökar
frekvensen av Treg. Detta kan innebära att vid tillsats av IL-2 kommer vissa CD4+ celler att
induceras och utvecklas till iTreg. IL-2 behandling ökar alltså prolifereringen av Treg,
däremot gav tillsats av ZA ingen ytterligare effekt på prolifereringen. Eftersom vi endast
undersökt ZA effekt på prolifereringen och IL-2R, så kan vi inte riktigt säga vad ZA
egentligen har för effekt på funktionen av Treg. Treg har även andra inhiberande funktioner
via IL-10, IL-35, CTLA-4 m.fl.(38, 39). Eftersom dessa funktioner hos Treg inte testats, kan
vi inte utesluta effekten av ZA på övriga inhiberande funktioner hos Treg.
Fokus i vår studie har varit IL-2R uttrycket hos T-lymfocyter efter behandling med IL-2 och
ZA. I fortsatta studier vore det intressant att studera funktionen av Treg, bland annat
suppressionen och proliferationen efter behandling med ZA för att få en större kännedom om
dess funktion. Sammanfattningsvis har vi kunnat visa att T-lymfocyter, specifikt Treg,
påverkas av IL-2 stimulering genom att få en uppreglering av IL-2R samt att behandlingen
ökar frekvensen av Treg. Resultaten indikerade att behandling med IL-2 och ZA nedreglerar
IL-2R uttrycket hos Treg, men statistisk signifikans uppnåddes inte. Vi har kunnat se att IL-2
behandlingen inte hade en direkt påverkan på IL-2R hos Teff, vilket därmed innebär att
behandlingen med ZA är obetydlig då ZA endast påverkar IL-2R uttrycket. Behandlingen
med ZA uppvisade heller ingen effekt på frekvensen hos T-lymfocyterna.
Den slutsats jag kan dra av detta är att våra resultat kan ge stöd för nya behandlingsmetoder
att öka den antitumöra effekten av Teff i cancer via en nedreglering av funktionen hos Treg
efter behandling med IL-2 och ZA. Dock kräver detta fortsatt forskning för att förstärka
hypotesen ytterligare med statistiskt signifikanta resultat. Det här projektet utgör
inledningsfasen i en större studie med målet att finna en förbättrad immunterapi mot cancer.
18
8. Tillkännagivanden
19
9. Referenser
1.Mule JJ, Shu S, Schwarz SL, Rosenberg SA. Adoptive immunotherapy of established
pulmonary metastases with LAK cells and recombinant interleukin-2. Science. 1984 Sep
28;225(4669):1487-9. PubMed PMID: 6332379. Epub 1984/09/28. eng.
2.Southam CM, Brunschwig A, Levin AG, Dizon QS. Effect of leukocytes on
transplantability of human cancer. Cancer. 1966 Nov;19(11):1743-53. PubMed PMID:
5925282. Epub 1966/11/01. eng.
3.June CH. Principles of adoptive T cell cancer therapy. J Clin Invest. 2007
May;117(5):1204-12. PubMed PMID: 17476350. Pubmed Central PMCID: 1857246. Epub
2007/05/04. eng.
4.Moser M, Leo O. Key concepts in immunology. Vaccine. 2010 Aug 31;28 Suppl 3:C2-13.
PubMed PMID: 20713253. Epub 2010/08/18. eng.
5.Farag SS, Fehniger TA, Ruggeri L, Velardi A, Caligiuri MA. Natural killer cell receptors:
new biology and insights into the graft-versus-leukemia effect. Blood. 2002 Sep
15;100(6):1935-47. PubMed PMID: 12200350. Epub 2002/08/30. eng.
6.Abbas AK, Lichtman AH. Basic immunology : functions and disorders of the immune
system. 3rd ed. Philadelphia, PA: Saunders/Elsevier; 2009. viii, 312 p. p.
7.Palmer E, Naeher D. Affinity threshold for thymic selection through a T-cell receptor-coreceptor zipper. Nature reviews Immunology. 2009 Mar;9(3):207-13. PubMed PMID:
19151748.
8.Enouz S, Carrie L, Merkler D, Bevan MJ, Zehn D. Autoreactive T cells bypass negative
selection and respond to self-antigen stimulation during infection. The Journal of
experimental medicine. 2012 Sep 24;209(10):1769-79. PubMed PMID: 22987800. Pubmed
Central PMCID: 3457731.
9.Sakaguchi S, Sakaguchi N, Shimizu J, Yamazaki S, Sakihama T, Itoh M, et al.
Immunologic tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells: their common role in
controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance. Immunological
reviews. 2001 Aug;182:18-32. PubMed PMID: 11722621.
10.Sullivan BM, Juedes A, Szabo SJ, von Herrath M, Glimcher LH. Antigen-driven effector
CD8 T cell function regulated by T-bet. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America. 2003 Dec 23;100(26):15818-23. PubMed PMID: 14673093.
Pubmed Central PMCID: 307651.
11.Marzo AL, Vezys V, Klonowski KD, Lee SJ, Muralimohan G, Moore M, et al. Fully
functional memory CD8 T cells in the absence of CD4 T cells. Journal of immunology. 2004
Jul 15;173(2):969-75. PubMed PMID: 15240684.
12.Pandiyan P, Lenardo MJ. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival.
Biology direct. 2008;3:6. PubMed PMID: 18304352. Pubmed Central PMCID: 2270257.
20
13.Khattar M, Chen W, Stepkowski SM. Expanding and converting regulatory T cells: a
horizon for immunotherapy. Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. 2009 MayJun;57(3):199-204. PubMed PMID: 19479206.
14.Workman CJ, Szymczak-Workman AL, Collison LW, Pillai MR, Vignali DA. The
development and function of regulatory T cells. Cellular and molecular life sciences : CMLS.
2009 Aug;66(16):2603-22. PubMed PMID: 19390784. Pubmed Central PMCID: 2715449.
15.Kanegane H, Miyawaki T, Kato K, Yokoi T, Uehara T, Yachie A, et al. A novel
subpopulation of CD45RA+ CD4+ T cells expressing IL-2 receptor alpha-chain (CD25) and
having a functionally transitional nature into memory cells. International immunology. 1991
Dec;3(12):1349-56. PubMed PMID: 1685671.
16.Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM, Hafler DA. FOXP3+ regulatory T cells in the
human immune system. Nature reviews Immunology. 2010 Jul;10(7):490-500. PubMed
PMID: 20559327.
17.Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in
immunological tolerance to self and non-self. Nature immunology. 2005 Apr;6(4):345-52.
PubMed PMID: 15785760.
18.Hefeneider SH, Conlon PJ, Henney CS, Gillis S. In vivo interleukin 2 administration
augments the generation of alloreactive cytolytic T lymphocytes and resident natural killer
cells. Journal of immunology. 1983 Jan;130(1):222-7. PubMed PMID: 6600178.
19.Geng X, Zhang R, Yang G, Jiang W, Xu C. Interleukin-2 and autoimmune disease
occurrence and therapy. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012 Oct;16(11):1462-7. PubMed
PMID: 23111957. Epub 2012/11/01. eng.
20.de la Rosa M, Rutz S, Dorninger H, Scheffold A. Interleukin-2 is essential for
CD4+CD25+ regulatory T cell function. European journal of immunology. 2004
Sep;34(9):2480-8. PubMed PMID: 15307180.
21.Lindqvist CA, Christiansson LH, Simonsson B, Enblad G, Olsson-Stromberg U, Loskog
AS. T regulatory cells control T-cell proliferation partly by the release of soluble CD25 in
patients with B-cell malignancies. Immunology. 2010 Nov;131(3):371-6. PubMed PMID:
20518821. Pubmed Central PMCID: 2996557. Epub 2010/06/04. eng.
22.Miyajima A, Kitamura T, Harada N, Yokota T, Arai K. Cytokine receptors and signal
transduction. Annu Rev Immunol. 1992;10:295-331. PubMed PMID: 1590989. Epub
1992/01/01. eng.
23.Spiess PJ, Yang JC, Rosenberg SA. In vivo antitumor activity of tumor-infiltrating
lymphocytes expanded in recombinant interleukin-2. J Natl Cancer Inst. 1987
Nov;79(5):1067-75. PubMed PMID: 3500355. Epub 1987/11/01. eng.
24.Ahmadzadeh M, Rosenberg SA. IL-2 administration increases CD4+ CD25(hi) Foxp3+
regulatory T cells in cancer patients. Blood. 2006 Mar 15;107(6):2409-14. PubMed PMID:
16304057. Pubmed Central PMCID: 1473973. Epub 2005/11/24. eng.
21
25.Parkinson DR. Interleukin-2 in cancer therapy. Semin Oncol. 1988 Dec;15(6 Suppl 6):1026. PubMed PMID: 3061014. Epub 1988/12/01. eng.
26.Pardali K, Moustakas A. Actions of TGF-beta as tumor suppressor and pro-metastatic
factor in human cancer. Biochim Biophys Acta. 2007 Jan;1775(1):21-62. PubMed PMID:
16904831. Epub 2006/08/15. eng.
27.Schlecker E, Stojanovic A, Eisen C, Quack C, Falk CS, Umansky V, et al. Tumorinfiltrating monocytic myeloid-derived suppressor cells mediate CCR5-dependent recruitment
of regulatory T cells favoring tumor growth. J Immunol. 2012 Dec 15;189(12):5602-11.
PubMed PMID: 23152559. Epub 2012/11/16. eng.
28.Ghiringhelli F, Menard C, Terme M, Flament C, Taieb J, Chaput N, et al. CD4+CD25+
regulatory T cells inhibit natural killer cell functions in a transforming growth factor-betadependent manner. J Exp Med. 2005 Oct 17;202(8):1075-85. PubMed PMID: 16230475.
Pubmed Central PMCID: 2213209. Epub 2005/10/19. eng.
29.Hatoum HT, Lin SJ, Smith MR, Guo A, Lipton A. Treatment persistence with monthly
zoledronic acid is associated with lower risk and frequency of skeletal complications in
patients with breast cancer and bone metastasis. Clin Breast Cancer. 2011 Jun;11(3):177-83.
PubMed PMID: 21665138. Epub 2011/06/15. eng.
30.Lipton A, Cook RJ, Major P, Smith MR, Coleman RE. Zoledronic acid and survival in
breast cancer patients with bone metastases and elevated markers of osteoclast activity.
Oncologist. 2007 Sep;12(9):1035-43. PubMed PMID: 17914073. Epub 2007/10/05. eng.
31.Sarhan D, D'Arcy P, Wennerberg E, Liden M, Hu J, Winqvist O, et al. Activated
monocytes augment TRAIL-mediated cytotoxicity by human NK cells through release of
IFN-gamma. Eur J Immunol. 2013 Jan;43(1):249-57. PubMed PMID: 22996291. Epub
2012/09/22. eng.
32.Swain SL, Weinberg AD, English M, Huston G. IL-4 directs the development of Th2-like
helper effectors. J Immunol. 1990 Dec 1;145(11):3796-806. PubMed PMID: 2147202. Epub
1990/12/01. eng.
33.Carlsson R, Sjogren HO. Kinetics of IL-2 and interferon-gamma production, expression of
IL-2 receptors, and cell proliferation in human mononuclear cells exposed to staphylococcal
enterotoxin A. Cell Immunol. 1985 Nov;96(1):175-83. PubMed PMID: 3939109. Epub
1985/11/01. eng.
34.Fontenot JD, Rasmussen JP, Gavin MA, Rudensky AY. A function for interleukin 2 in
Foxp3-expressing regulatory T cells. Nat Immunol. 2005 Nov;6(11):1142-51. PubMed PMID:
16227984. Epub 2005/10/18. eng.
35.Jagdev SP, Coleman RE, Shipman CM, Rostami HA, Croucher PI. The bisphosphonate,
zoledronic acid, induces apoptosis of breast cancer cells: evidence for synergy with paclitaxel.
Br J Cancer. 2001 Apr 20;84(8):1126-34. PubMed PMID: 11308265. Pubmed Central
PMCID: 2363858. Epub 2001/04/20. eng.
22
36.Chen ML, Pittet MJ, Gorelik L, Flavell RA, Weissleder R, von Boehmer H, et al.
Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-beta signals
in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jan 11;102(2):419-24. PubMed PMID: 15623559.
Pubmed Central PMCID: 544311. Epub 2004/12/30. eng.
37.Levings MK, Sangregorio R, Roncarolo MG. Human cd25(+)cd4(+) t regulatory cells
suppress naive and memory T cell proliferation and can be expanded in vitro without loss of
function. J Exp Med. 2001 Jun 4;193(11):1295-302. PubMed PMID: 11390436. Pubmed
Central PMCID: 2193376. Epub 2001/06/08. eng.
38.Collison LW, Chaturvedi V, Henderson AL, Giacomin PR, Guy C, Bankoti J, et al. IL-35mediated induction of a potent regulatory T cell population. Nat Immunol. 2010
Dec;11(12):1093-101. PubMed PMID: 20953201. Pubmed Central PMCID: 3008395. Epub
2010/10/19. eng.
39.Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol.
2008 Jul;8(7):523-32. PubMed PMID: 18566595. Pubmed Central PMCID: 2665249. Epub
2008/06/21. eng.
23
