Application Note 4
Användning av certifierade
referensmaterial för kvantifiering av
GMO i livsmedel och foder
September 2006
Författare: Stefanie Trapmann
Europeiska kommissionen – Gemensamma
forskningscentret
Institutet för referensmaterial och
referensmätningar (IRMM)
Retieseweg 111, 2440 Geel, Belgien
I detta meddelande ges vägledning om korrekt användning av IRMM:s
referensmaterial som certifierats på massbasis av en specifik
transformationshändelse.
Nedanstående uppgifter avser särskilt användningen av de certifierade
E-post: [email protected]
referensmaterialen ERM-BF410, ERM-BF411, ERM-BF412, ERM-BF413,
ERM-BF414, ERM-BF415, ERM-BF416, ERM-BF417, ERM-BF418 och ERM-BF423.
INLEDNING
Enligt förordning (EG) nr 1830/2003 krävs
märkning av livsmedel och foderprodukter som
består av eller är framställda av mer än 0.9 %
genetiskt modifierade organismer (GMO), förutsatt
att GMO har släppts ut på den europeiska
marknaden i enlighet med gemenskapens
lagstiftning. Därför måste innehållet av genetiskt
modifierat material i sådana produkter kvantifieras
på ett tillförlitligt sätt. För detta behövs lämpliga
certifierade referensmaterial (CRM) som verktyg
för kvalitetssäkring.
EGENSKAPER HOS CRM FÖR GMO
De certifierade värdena för de CRM som
förtecknas ovan baseras på massorna av pulver
av torkat genetiskt modifierat frö och torkat pulver
av icke genetiskt modifierat frö som använts vid
gravimetrisk tillverkning. Massorna är korrigerade
för sitt vatteninnehåll och för uppskattad renhet.
Viktandelen GMO beräknas som
korrigerad
korrigerad massa GMO - pulver
massa GMO - pulver + korrigerad massa icke - GMO - pulver
Varje GMO-CRM är certifierat för massandelen av
en viss genetisk modifiering (som anges på
certifikatet). Därför kan CRM användas endast för
att kvantifiera den modifiering som anges på
certifikatet.
ERM®- BF418c
DRIED MAIZE POWDER
Mass Fraction
1507 maize
Certified value 1)
[g / kg]
Uncertainty 2)
[g / kg]
9.9
-0.6 ; +0.8
1) The certified value is based on the mass fraction of dried non-genetically modified powder and dried
genetically modified powder mixed and corrected for the water content. The certified value is traceable
to the SI.
2) The certified uncertainty is the expanded uncertainty estimated in accordance with the Guide to the
Expression of Uncertainty in Measurement (GUM) with a coverage factor k = 2, corresponding to a
level of confidence of about 95 %.
Figur 1: Del av certifikatet för CRM för GMO, ERM-BF418c.
De GMO-CRM som på senare tid har släppts ut av
IRMM har certifierats med ett asymmetriskt
osäkerhetsintervall. Om ett sådant CRM används för
kontroll av avvikelse (se ERM:s Application Note 1) ska
”plus-osäkerheten”
användas
i
de
fall
det
genomsnittliga mätvärdet ligger över det certifierade
värdet och ”minus-osäkerheten” i de fall det
genomsnittliga mätvärdet ligger under det certifierade
värdet.
ANVÄNDNING AV REALTIDS-PCR
Polymeraskedjereaktion i realtid (rt-PCR) används
allmänt för att kvantifiera GMO-fraktioner i prover
av livsmedel och foder. Denna DNA-baserade
kvantifieringsmetod mäter förhållandet mellan
transgent DNA, som härrör från genetisk
modifiering, och endogent DNA, som är specifikt
för den biologiska arten.
På grund av den varierande genetiska
sammansättningen i olika delar av frön hos
enhjärtbladiga växter (t.ex. majsens frövita, fröskal
och embryo), kan det hända att DNA-förhållandet i
referensmaterialet inte är lika med viktförhållandet
i det certifierade pulvret. Förhållandet extraherbart
transgent DNA / extraherat endogent DNA
behöver därför inte vara lika med förhållandet
GMO-majsmassa / total majsmassa, även om
båda
typerna
av
DNA
har
likvärdigt
extraktionsutbyte.
Under beredningen av GMO-CRM vidtogs
särskilda åtgärder för att se till att GMO-pulver
och icke-GMO-pulver är likvärdiga med avseende
på partiklarnas storleksfördelning.
Detta är
särskilt viktigt när det gäller mängden extraherbart
DNA
i
de
båda
pulvren.
Olika
extraktionseffektivitet för DNA hos GMO- och
icke-GMO-pulver skulle påverka värdet på den
GMO-halt som uppmäts med rt-PCR. Därför bör
endast extraktionsmetoder som har validerats för
att uppfylla detta krav användas.
Vid certifieringen verifieras massfraktionen av
GMO
hos
CRM
med
hjälp
av
en
transformationshändelsespecifik
rt-PCR-metod.
Man måste dock vara försiktig med att dra
kvantitativa slutsatser av mätningar på okända
prover, eftersom DNA-baserad GMO-kvantifiering
kan variera beroende på vilken variant som
testas. Om uppgifter inte finns tillgängliga från
annat håll bör det i en intern validering
undersökas hur olika varianter påverkar rt-PCRanalysens resultat [1].
© Europeiska gemenskaperna, 2006. Kopiering är tillåten med angivande av källan.
Varken Europeiska kommissionen eller de personer som handlar på kommissionens vägnar ansvarar för användningen av informationen i detta
dokument.
Sida 1 av 2
Detektionsmetoder som bygger på rt-PCR,
framlagda och validerade i enlighet med
förordning (EG) nr 1829/2003, är tillgängliga för
allmänheten
på
webbplatsen
för
EU:s
referenslaboratorium för genetiskt modifierade
livsmedel och foder.
(http://gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm).
RESULTAT UTTRYCKTA I ANTAL RELATIVA
DNA-KOPIOR
I Europa är rt-PCR den vanligaste metoden för
GMO-kvantifiering. Därför föreslås i en nyligen
offentliggjord
kommissionsrekommendation
(2004/787/EG) att mätresultat från GMO-prover
bör uttryckas i antal DNA-kopior. Om GMO-CRM
som är certifierade för massandelen av GMOmaterial används för kalibrering av mätningar och
slutresultatet uttrycks i relativt antal kopior bör
man vara medveten om att majs-CRM har
framställts med hjälp av GMO-majs som är
heterozygot för transgenen. Information om
ploiditalet hos det frömaterial som används för
framställning av CRM finns i motsvarande
certifieringsrapport. Dessutom måste man ta
hänsyn till att antalet relativa kopior av transgenen
i majs påverkas av hur GMO-hybridsorten har
framställts
och
av
frönas
grad
av
endoreduplikation som ger en större påverkan
från de sekvenser som finns i frövitan. Om man
ser på extremfallen kan antalet relativa kopior av
transgenen
antingen
vara
33 %
(transformationshändelse som härrör från den
fader som använts för att korsa det heterozygota
fröet) eller 66 % (transformationshändelse som
härrör från den moder som använts för att korsa
det heterozygota fröet) under förutsättning att
endoreduplikationen är så kraftig att påverkan från
frövitan är nära 100 %. Alla andra fall (mindre
påverkan av endoreduplikation och större
påverkan från embryovävnaden) leder till värden
mellan 33 och 66 %, baserat på antagandet att
påverkan från fröskalet är försumbar i jämförelse
med dessa effekter.
Nedan ges ett exempel på hur ett mätresultat och
dess osäkerhet i g/kg kan omvandlas till antal
relativa kopior.
EXEMPEL
Vid kalibrering med hjälp av CRM certifierade för massfraktionen av GMO befanns ett majsprov innehålla 65 ± 20 g/kg av majstransformationshändelse 1507. Den utvidgade mätosäkerheten på 20 g/kg beräknades med en täckningsfaktor 2 och en
mätosäkerhet hos kvantifieringsmetoden på 15 %, uppskattad vid intern validering. För att omvandla det erhållna resultatet för
massfraktionen till antal relativa kopior, måste resultatet i g/kg omvandlas till procent genom att divideras med 10. Eftersom de
GMO-CRM för majs som används för kalibrering har framställts från heterozygota majsfrön, måste resultaten också divideras
med 2.
x
65
=
= 3,3
10 × 2 20
där x = genomsnittligt GMO-innehåll i g/kg
Observera att en korrektionsfaktor måste användas om de icke-GMO- och GMO-grundmaterial som använts för att framställa
CRM har olika extraherbarhet av DNA. Information om extraherbarhet av DNA finns i certifieringsrapporten. Med CTAB erhölls en
kvot på 0,7 ± 0,3 för extraherbarheten av DNA i GMO-pulver i förhållande till icke-GMO-pulver. Provets verkliga GMO-innehåll vid
undersökningen överskattas uttryckt i antal kopior och måste därför korrigeras.
där f = korrektionsfaktor relaterad till olika extraherbarhet av DNA i de GMO- och icke-GMO-pulver
3,3 * f = 3,3 * 0,7 = 2,3
som används som CRM.
Effekten av endoreduplikation och förädling av den heterozygota majs-transformationshändelsen måste beaktas vid beräkning av
mätresultatens osäkerhet. Osäkerheten ska täcka ett intervall på 33 % (66 % minus 33 %) och det uppmätta värdet kan avvika
med 16,5 %. För att kunna beräkna kvoten av antalet kopior måste man kvantifiera det DNA som extraherats ur majsprovet vid
undersökningen och uppskatta antalet majsgenom. För denna uppskattning divideras DNA-koncentrationen med genomstorleken
hos majs. Vid beräkning av osäkerheten måste man alltså ta hänsyn både till osäkerheten i DNA-kvantifieringen och till
osäkerheten i uppskattningen av genomstorleken. Enligt litteraturen kan majsgenomets storlek variera med upp till 36 % [2]. Vid
den interna valideringen fastställdes kvantifieringsmetodens reproducerbarhet till 22 %. Den utvidgade kombinerade osäkerheten
för resultatet uttryckt i kvoter av antal kopior (Ucc) kan följaktligen beräknas som
2
Ucc = k um2 + ugs
+u Dq2 +u 2e
2
2
⎛ 18 ⎞
⎛ 16,5 ⎞
U cc = 2 15 2 + ⎜⎜
⎟⎟ + 22 2 + ⎜⎜
⎟⎟ % = 60 %
3
⎝
⎠
⎝ 3⎠
där k = täckningsfaktor
um = den del av osäkerheten som är förknippad med metoden
för kvantifiering av antalet kopior
ugs = den del av osäkerheten som är förknippad med
uppskattningen av genomstorlek
uDq = den del av osäkerheten som är förknippad med
kvantifieringen av DNA
ue = den del av osäkerheten som är förknippad med förädling
och endoreduplikation
Uttryckt i antal kopior innehåller majsgenomet 2,3 ± 1,4 transgena sekvenser av transformationshändelse 1507 per hundra endogena
sekvenser. Jämfört med resultatet 65 ± 20 g/kg uttryckt i viktandel av 1507 ökade den relativa utvidgade osäkerheten från 30 till 60 %.
-----------------------------------------[1] IUPAC Technical Report (2002): Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Methods of Analysis
[2] Poggio et al., Annals of Botany 85 (1998),107–115.
Sida 2 av 2
