Humant papillomvirus
som riskmarkör för utveckling av
prolifererande verrukös leukoplaki
Angelica Gustavsson och Josefine Hjalmarsson
Handledare: Gunnar Warfvinge
Pia Lindberg
Avdelningen för Oral Patologi
Examensarbete (30 hp)
Malmö högskola
Tandläkarprogrammet
Odontologiska fakulteten
Februari 2013
205 06 Malmö
Abstract
Proliferative verrucous leukoplakia, PVL, is a rare disease that is characterized by multiple and
recurrent white lesions in the oral epithelium which over time may develop into cancer. The diagnosis can only be made by the clinician when the disease has progressed for a long time. There
is no effective treatment. The etiology of the disease is unknown but today it is known that there
is a link between cancer and certain viruses.
The purpose of this study is to investigate whether it is possible to detect human papilloma virus,
HPV, in tissue samples from patients who possibly are affected by PVL.
The selected samples consisted of 11 cases in which tissue samples from the biobank at the
Department of Oral Pathology at Malmö University, were collected and HPV was detected by
chromogenic in situ hybridization. The results showed a higher incidence of HPV in biopsies
taken at a later stage of the disease compared with previous biopsies. However, a specific HPV
genotype could not be identified.
In this study, it has not been possible to demonstrate HPV with in situ hybridization at an early
state of PVL as a putative indicator of disease development
2
Sammanfattning
Prolifererande verrukös leukoplaki, PVL, är en ovanlig sjukdom som yttrar sig genom multipla,
vita förändringar i munslemhinnan som recidiverar och med tiden riskerar att utvecklas till
cancer. Diagnosen kan endast ställas kliniskt när sjukdomsförloppet pågått under lång tid och det
finns heller inga effektiva behandlingsmetoder. Etiologin till sjukdomen är okänd, men idag vet
man att det finns ett samband mellan cancerutveckling och vissa virustyper.
Syftet med studien är att undersöka om det går att påvisa humant papillom virus, HPV, i vävnadsprover från patienter som kan misstänkas ha PVL.
Urvalet bestod av 11 patientfall, där vävnadsprover från biobanken vid avdelningen för oral patologi, Malmö högskola, samlats in och studerats med kromogen in situ hybridisering. Resultaten
visade en högre förekomst av HPV i biopsier tagna i det senare skedet av sjukdomen jämfört med
tidigare biopsier. En specifik HPV-genotyp kunde dock inte identifieras.
I denna studie har det inte varit möjligt att påvisa HPV med in situ hybridisering, i ett tidigt stadium av PVL, som en möjlig indikator på sjukdomsutveckling.
MeSH- termer: Human papillomavirus, in-situ hybridization, leukoplakia, neoplasms, oral,
proliferative verrucous leukoplakia
3
Introduktion
1985 publicerade Hansen et al den första artikeln som rapporterar om en ovanlig form av leukoplaki som beskrivs som multifokal, långsamt växande, progredierande, terapiresistent med benägenhet att recidivera efter avlägsnande (1). Författarna valde att benämna detta tillstånd som prolifererande verrucös leukoplaki (PVL). PVL är en tydlig klinisk form av leukoplaki som definieras av sitt progressiva förlopp och som histologiskt primärt yttrar sig som enkla benigna hyperkeratoser men som med tiden progredierar till multifokala lesioner som ofta utvecklas till verrukös cancer eller skivepitelcancer (Figur 1a-c). Vid multifokal sjukdom befinner sig inte alla läsioner i samma stadium (2). Flera studier har gjorts för att identifiera en säker markör för när en
lesion är en del av en PVL och när det föreligger en risk för cancerutveckling. Sambandet mellan
PVL och COX-2, TGF-α och HPV har undersökts men ingen studie har nått övertygande resultat
(2). Bruk av tobak och alkohol är de starkaste riskfaktorerna för utvecklandet av oral cancer men
i fall med PVL har man inte sett något sådant samband(1,3). Etiologin är således okänd och tillsammans med ett brett spektrum i hur PVL yttrar sig till en början, kliniskt såväl som histologiskt, är det omöjligt att i ett tidigt skede avgöra om en första lesion, i form av en hyperkeratos, är
del i en PVL (1).
I sin studie illustrerar Hansen et al (1) hur en från början benign lesion utvecklas till en dysplastisk, precancerös förändring för att slutligen bli cancer. I Figur 2 framgår tydligt hur alla stegen i
PVL-progressionen kan vara en differentialdiagnos och vice versa.
Det man idag konstaterat om sjukdomen är att den drabbar kvinnor fyra gånger oftare än män,
debutmedelåldern då diagnosen ställs för första gången är 66 år och från diagnostillfälle till utvecklandet av cancer tar det 4,4 -11,6 år (2). Prolifererande verrucös leukoplaki är en ovanlig
4
klinisk diagnos som är svår att ställa i ett tidigt stadium då kriterierna för diagnosen idag bland
annat innebär recidiv och terapiresistens.
Idag vet man att det finns ett samband mellan cancerutveckling och vissa virustyper. Histologiskt
ger PVL med sitt verrucösa epitel en bild som för tankarna till en vävnad infekterad med humant
papillomvirus (HPV). Redan 1933, då viruset för första gången isolerades ur kaniner, rapporterades ett samband mellan HPV och malign transformation av benigna papillom (4). Syrjanen et al
var de första att 1983 föreslå sambandet mellan HPV och orala lesioner efter att ha upptäckt
virusindicerade koilocyter i orala lesioner (5). Detta bekräftades i uppföljande analyser av vävnaderna med in situ hybridisering där HPV hittades i fyra av fem leukoplakier och tre av sex
cancerfall (5). Det faktum att HPV detekterats i benigna lesioner indikerar att inte alla typer av
HPV-infektioner orsakar sjukdom och det vore av essentiellt värde att identifiera faktorerna som
leder till malign utveckling. Sambandet mellan högrisktyperna 16 och 18 är idag accepterad som
en av de viktigaste faktorerna bakom utveckling av livmoderhalscancer (6). Ett eventuellt samband mellan HPV och cancer i munhålan har rapporterats, men är inte lika väletablerat (7,8).
HPV är ett för människan artspecifikt virus som tillhör familjen papillomaviridae. Papillomvirus
är små DNA-virus som orsakar hud- och slemhinnehyperplasier. Enligt gällande uppfattning kan
HPV inte infektera frisk hud eller slemhinna, infektion är endast möjlig om slemhinnan är penetrerad (9). Målet är de basala epitelcellerna där HPV behöver specifika receptorprotein på keratinocyternas cellmembran att binda till. När det väl har penetrerat cellmembranet, gör det sig av med
sitt proteinhölje och virus-DNA kan börja använda sig av värdcellen. HPV-genomet innehåller
sex tidiga (E), två sena (L) gener och en lång kontrollregion (LCR) (9). Det är de tidiga generna,
5
E-generna, som initialt ökar celldelning och DNA-syntesen och stör faktorer som reglerar celldelningen och därmed möjliggör en signifikant replikation av virusgenomet (10).
De flesta HPV-infektioner läker ut spontant, men blir de kroniska ökar risken för virusinducerade
cellförändringar (9). De onkogena proteinerna E6 och E7 kontrolleras normalt av E1 och E2, men
dessa kan raderas eller förändras vid virusintegrationen med okontrollerad transkription av E6
och E7 som resultat. De infekterade generna får en tillväxtfördel då E6 binder till p53, ett protein
som normalt reglerar celldelningen, och E7 binder till proteinet Rb som även detta, normalt sätt,
har en hämmande effekt på cellcykeln (7). (Figur 3) Den tumörsuppressiva funktion som p53 och
Rb ansvarar för hämmas och cellerna får en högre benägenhet att ta sig igenom kontrollsystem
trots skadliga mutationer (8). Genomet blir alltmer instabilt ju fler delningar det går igenom, mutationer ackumuleras och till slut förvandlas de till odödliga celler. Beroende på värdens respons
kan detta leda till tumörbildning (11,12).
2006 hade över 150 olika typer av HPV identifierats (11). Typerna har namngetts i den ordning
de identifierats och indelningen bygger på variationer i nukleinsyror i L1-genen. Virustyperna
kan även klassificeras på andra sätt; bland annat baserat på beteende kan de indelas i hög- eller
lågrisktyper.
Tidigare har studier gjorts för att utreda om ett samband kan ses mellan PVL och förekomst av
HPV. En studie påvisade en lika hög förekomst av HPV hos PVL-patienter (24,1%), som hos
kontrollgruppen med orala leukoplakier (25,5%), och ingen signifikant skillnad på genotyp (13).
En annan studie visade ingen förekomst av HPV hos 13 PVL-diagnostiserade patienter (14).
HPV-16 har rapporterats vara den mest prevalenta typen i leukoplakier och i PVL (15), medan
andra studier indikerar att lågrisktyper förekommer mest i leukoplakier (15) och ytterligare andra
6
talar om en koinfektion med flera olika typer av HPV (15). I metaanalysen av Miller och
Johnstone (16) påstås att sannolikheten att detektera HPV i precancerösa läsioner är 2-3 gånger
högre och i oral skivepitelcancer är den 4-5 gånger högre än i frisk slemhinna. I sin metaanalys
kom de fram till följande prevalenser: 10% i normal mukosa, 20,2% i icke-dysplastiska leukoplakier, 26,2% i dysplastiska leukoplakier och andra precanerösa lesioner och 46,5 % i oral skivepitelcancer (16). Det är alltså sannolikt att det även finns ett samband mellan HPV och PVL.
Syftet med vår studie är att utreda om det retrospektivt med hjälp av in situ hybridisering går att
påvisa tidig förekomst av HPV i vävnadsprover från patienter med en möjlig PVL-diagnos för att
på så sätt söka ett samband mellan utvecklingen av PVL och HPV förekomst.
Material och metod
Urval
Patienterna som inkluderats i studien valdes ut från biobanken på Malmö högskolas avdelning för
oral patologi. Då PVL inte är en histopatologisk diagnos, finns den inte registrerad i patientregistret och kan inte användas som sökord i patientdatabasen. Vissa remisser kan dock innehålla
en fritextkommentar om möjlig PVL. Sökningen i patientdatabasen, som utfördes 2011-10-25,
genomfördes därför enligt följande:
-
Patientregistret genomsöktes med avseende på samtliga patienter med någon av följande
diagnoser under 2000-talet; verrukös cancer, skivepitelcancer och möjlig diagnos PVL. Valet
av verrukös och skivepitelcancer beror på att sjukdomsbilden vid PVL slutligen leder till
någon form av cancer.
7
Sökningen resulterade i 2 patienter med PVL som kommentar, 20 patienter med diagnosen
verrukös cancer och 307 med skivepitelcancer. Patientunderlaget granskades och för att inkluderas måste patienten förutom en cancerdiagnos uppvisa följande:
1. Andra diagnoser som kan förknippas med PVL, dvs benign hyperkeratos, lichenoid
förändring, epiteldysplasi eller verrucös hyperplasi.
2. Materialet ska innefatta minst fyra remisser.
3. Biopsierna ska härstamma från minst två olika områden i munhålan.
4. Minst ett av dessa två områden ska ha utvecklat minst två olika lesioner relaterade till
PVL, varav en ska vara cancer. Detta för att i studien kunna följa utvecklingen i ett
område hos en PVL-patient och se hur HPV låter sig detekteras under sjukdomsförloppet
från en benign eller precancerös lesion till cancer.
5. Senaste biopsin ska ha inkommit mellan 2000-01-01 och 2011-10-25. Detta av administrativa skäl, samt för att garanterat kunna få tillgång till biopsierna.
Denna urvalsprocess resulterade i 10 patienter som uppfyllde kriterierna.
Ytterligare två patienter inkluderades från patientdatabasen då de erhållit PVL som tentativ diagnos. I dessa två fall gjordes undantag med avseende på antalet remisser. Detta gav oss ett totalt
patientunderlag på 12 patienter. Vid insamlandet av biopsierna föll en utvald patient bort då den
biopsi som diagnostiserats med cancer saknades i biobanken, så det slutliga urvalet blev 11
patienter.
Patienterna har i samband med biopsitagning lämnat samtycke till studier av de lämnade
biopsierna.
8
In situ hybridisering
In situ hybridisering är en histologisk metod som används för att detektera en speciell RNA- eller
DNA-sekvens i en vävnad. Man kan med denna metod till exempel visa i vilka celler en viss gen
används eller vilka celler som är infekterade med ett bestämt virus (17). Metoden bygger på att
märkta DNA-prober bildar hybridmolekyler med eftersökta DNA-sekvenser i ett vävnadsprov, så
kallad hybridisering. Förutsättning för detta är att proben och den eftersökta DNA-sekvensen är
komplementära till varandra, samt att vävnadens DNA är åtkomligt för DNA-proben. Målet är att
de eftersökta DNA-sekvenserna ska visualiseras så att det blir möjligt att granska vävnaden och
dess innehåll under ljusmikroskop.
In situ hybridisering kan delas in i tre arbetssteg. Steg ett är en förbehandling då proverna avparaffineras, rehyderas och genomgår en proteolytisk behandling. I andra steget sker denaturering
och hybridisering. Efterbehandlingen innebär att de bildade hybridmolekylerna synliggörs till
exempel via immunfärgning.
De vävnadsprover vi studerat härrör från en biobank där proverna är inbäddade i paraffin. Inbäddningen i paraffin är en konserverande behandling för att vävnadsprover ska kunna bevaras
och hållas stabila under lång tid. Efter att vävnadsvätskan ersättas av formalin måste de urvattnas,
för att sedan bäddas in i paraffin. För att möjliggöra vidare studier på vävnadssnitt måste en avparaffinering utföras. Detta sker i xylen, följt av rehydrering i tre olika etanolbad med fallande
alkoholkoncentration från 100% till 70%.
Vid en in situ hybridisering måste vävnadens DNA vara åtkomligt för DNA-proben. Snitten behandlas därför enzymatiskt med en pepsinlösning (ES1), för att proteolytiskt bryta ned de proteiner i cellen som omger DNA, och därefter med en EDTA-lösning (etylendiamintetraättiksyra)
9
som tar bort de magnesiumjoner som behövs för att bevara cellmembranets struktur. Dessutom
hämmas de enzymer i cellen som annars bryter ner DNA. Denna förbehandling av snitten resulterar i att DNA blottas.
I nästa steg tillsätts en DNA-probe som är komplementär till den eftersökta DNA-sekvensen och
markerad med en viss markör, ofta biotin eller digoxigenin. För att DNA-proben och den eftersökta DNA-sekvensen ska kunna binda till varandra måste cellens DNA delas, dvs denatureras.
Denatureringen sker på värmeplatta så att vätebryggorna som håller ihop DNA-dubbelhelixen
bryts. Enkla DNA-strängar kvarstår. Hybridiseringen sker i en efterföljande inkubering då DNAproben, via basparning, binder in till sin komplementära sekvens på de enkla DNA-strängarna.
Hybridmolekyler bildas.
Hybridmolekylerna synliggörs via immunfärgning där en primär omärkt antikropp (AB1) binder
till hybridmolekylen via markören på DNA-proben, t.ex digoxigenin. En sekundär antikropp
(AB2) som är märkt med ett enzym, binder till den primära antikroppen. Enzymet på den
sekundära antikroppen, oftast peroxidas, bildar vid tillsats av ett substrat (AEC, 3-amino-9ethylcarbazole), ett färgkomplex som kan visualiseras i ljusmikroskop (18).
Ett positivt resultat visar sig som rött färgade kärnor som bäst undersöks i ljusmikroskop med
100-200 gångers förstoring. Den omgivande vävnaden i proverna färgas med en annan färglösning (CS2) i en så kallad kontrastfärgning för att man enkelt ska kunna särskilja hybridiserade
områden ifrån resterande vävnad.
10
I denna studie detekterades HPV i utvalda biopsier med kromogen in situ hybridisering (CISH)
med ett detekteringskit (ZytoFastPlus CISH Implementation Kit HRP-AEC, ZytoVision GmbH,
Bremerhaven, Tyskland). Detta kit är speciellt designat för att detektera digoxigeninmärkta
DNA-prober i formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads- eller cellprover (18).
I kitet ingår en digoxigenin-markerad HPV-screening probe för HPV-typerna 6, 11, 16, 18, 31,
33, 35, 45, 51 och 82, två specifika prober för detektion av HPV-typerna 6/11 respektive 16/18,
samt en positiv och en negativ kontrollprobe. Kontrollproberna består av oligonukleotider där den
positiva, ZytoFastDNA(+)Control Probe (PF32), är komplementär till repetitiva Alu-sekvenser
som alltid finns i mänsklig vävnad och den negativa, ZytoFastDNA (-)Control Probe (PF24), inte
har samstämmighet med någon känd naturlig sekvens. Detta betyder att den positiva kontrollproben alltid och den negativa aldrig ska kunna visa utslag. I det fall de gör det, måste felkällor
identifieras. Fabrikantens protokoll följdes med viss modifikation av temperaturer och arbetstider
för att optimera metoden på äldre biopsier, även detta inom ramen för fabrikantens anvisningar.
Metod
Inledningsvis testades metoden för sin specificitet och sensitivitet på bifogade testprover med
positiva resultat.
De utvalda biopsierna som påvisats med cancer testades först med screeningproben. De vävnadsprover som visade positivt resultat vid screeningen, följdes upp med proben för HPV 16/18. Vid
negativt utslag för HPV 16/18 utfördes en tredje inkubering med HPV 6/11-specifik probe. Om
en patients cancerbiopsi visat sig positiv vid screening för HPV, utfördes även färgning av den
tidigare biopsin från samma område. Denna biopsi hade en diagnos förenlig med PVL, men
11
tidigare i sjukdomsförloppet. Syftet var att följa utvecklingen av HPV-infektionen hos en PVLpatient under sjukdomsutvecklingen från en benign eller precancerös lesion till cancer.
Kontrollfärgningar utfördes på samtliga cancerbiopsier, med både positiv och negativ kontroll
(Figur 4).
Metodbeskrivning
Förbehandling med avparaffinering, rehydrering och proteolys:
De paraffininbäddade biopsierna snittades till 4 µm och torkades på objektglas 4 timmar i 63o C.
Snitten avparaffinerades i xylen (3x7 minuter) och rehydrerades sedan i etanol (3x3 minuter). En
inkubering i 10 minuter i 3% H2O2 samt två minuter i destillerat vatten följde. Proteolysen
genomfördes med pepsinlösning (ES1) 15 minuter i 37o C i fuktkammare och efterföljdes av
inkubering i 95o C EDTA-lösning (PT2) i 15 minuter.
DNA-denaturering och hybridisering
Till varje snitt tillsattes 10 µl 37o C varm DNA-prob med och täckglas fixerades över snitten med
RubberCement, följt av en denaturering på värmeplatta med 75o C i 5 minuter. Sedan följde
hybridisering i fuktkammare i 37o C under 20 timmar.
DNA-detektion
Täckglasen avlägsnades och snitten inkuberades först i 37 oC TBS-buffert i 5 minuter, sedan i
rumstempererad TBS-buffert i 5 minuter. Mus-anti-DIG-antikropp (AB1) tillsattes droppvis och
följdes av inkubering i fuktkammare under 30 minuter i 37 o C och därefter i rumstempererad
TBS-buffert i 5 minuter. Anti-mus-HRP-polymer (AB2) tillsattes droppvis och inkuberades även
12
denna i fuktkammare under 30 minuter i 37 o C och i rumstempererad TBS-buffert i 5 minuter.
AEC-färglösning (SB5) tillsattes droppvis och efterföljdes av en inkubering i fuktkammare under
25 minuter i rumstemperatur. Glasen tvättades i 2 minuter i destillerat vatten. Nuclear Blue
Solution (CS2) tillsattes droppvis och inkuberades 7 minuter i rumstemperatur. Glasen tvättades
under svagt rinnande vatten under 2 minuter och sköljdes därefter i destillerat vatten. Täckglas
monterades med Mounting Solution (MT5) och lämnades för torkning i 30 minuter.
Resultat
De mikroskopiska fynden har sammanställts i Tabell 1. Av cancerbiopsierna var sex av nio
positiva för HPV vid infärgning med screeningproben (Fig. 5). Tre av dem hade en föregående
lesion som också var positiv vid screening (Fig. 6). En av patienterna med en cancer som var
positiv vid screening och hade en positiv föregångare, uppvisade HPV 16/18 i cancern, dock inte
i föregångaren (Fig. 7).
Tre av patienterna uppvisade ingen HPV vid screeningen och följdes därför inte upp med fler
infärgningar. De två patienter som tagits med i urvalet på grund av sin PVL-diagnos uppvisade
inga tydliga resultat (Tabell 1: patient nr 4 och 8). En av patienterna uppvisade en positiv
screening i båda lesionerna, medan den andra endast uppvisade det i en av lesionerna, i detta
fallet i den tidigare tagna biopsin.
Inga fall av positivitet för HPV-typ 6/11 hittades i materialet.
13
Diskussion
Proliferativ verrukös leukoplaki (PVL) är en ovanlig sjukdom. Det är en klinisk diagnos som idag
endast kan ställas retrospektivt. Detta är möjligt först när patienten nått ett slutstadium då sjukdomen tagit överhand. Med tanke på PVLs aggressiva förlopp och utmynnandet i recidiverande
lesioner och cancer är det av stor betydelse för den enskilde individen som drabbas att etiologin
klaras upp och att en diagnostisk metod tas fram så att diagnosen kan ställas i ett tidigare skede.
HPVs betydelse för carcinogenesen har undersökts sedan 1930-talet och är än idag ett omdebatterat ämne. Ett samband mellan HPV och PVL har också föreslagits (19,20).
I denna retrospektiva studie har biopsier från möjliga PVL-patienter undersökts med in situ
hybridisering i syfte att utreda om möjlighet finns att detektera HPV, både på ett tidigt stadium i
sjukdomsförloppet och i slutskedet, det vill säga när en cancer utvecklats. Resultaten visar inget
tydligt samband mellan progressionen av PVL och infektion med HPV. I flera fall kan man
påvisa HPV, dock förekommer det i större grad i biopsierna från det senare skedet av sjukdomen.
Prevalensen av HPV i frisk oral slemhinna, premaligna lesioner och skivepitelcancer varierar
stort och reviewartiklar rapporterar siffror mellan 0% och 100% (21). Svårigheten i att få fram
den sanna rollen HPV spelar i carcinogenesen består både i bristande förståelse för hur HPV
skulle kunna vara en orsakande faktor, men främst i begränsningen i att analysera och detektera
HPV (22,8). HPV kan inte odlas in vitro och man är därför beroende av molekylära analyser av
HPV-DNA (21). De olika detekteringsmetoderna och deras olika sensitivitet verkar vara den
absolut viktigaste anledningen till den stora variationen i de rapporterade HPV-prevalenserna
(7,8, 9, 21).
14
En bredspektrumsprob för HPV med en tydlig bild för positivt respektive negativt utfall skulle
kunna leda till mer klarhet, både gällande orala lesioner såväl som lesioner i andra delar av
kroppen.
Metoden som valdes i denna studie var kromogen in situ hybridisering. Ett kit speciellt designat
för detektering av digoxigenin-markerade DNA-prober i formalinfixerade och paraffininbäddade
vävnads- eller cellprover användes.
PCR är den metod som anses ha den högsta sensitiviteten för att detektera olika typer av HPV
(23) där en virusförekomst på mindre än endast en kopia per cell är nödvändig (23) jämfört med
in situ hybridisering som kräver en hög virusförekomst, 20-25 kopior per cell (24). Alla
molekylära analyser överskuggas av problemet med kontaminering mellan prover. DNA eller
RNA kan lätt överföras mellan proverna via handskar, instrument eller till och med via luften.
Trots noggrann isolering kan kontaminering inte alltid förhindras (22). Problemet med PCR är att
det kan detektera en mycket liten mängd virus och även kontaminerade vävnader kan få positivt
utslag. Positiva utslag med in situ hybridisering är mer säkra, då en större mängd virus krävs än
vad som kan överföras via kontaminering. Det finns dock tekniska svårigheter med att tolka
resultatet av in situ hybridisering. Om positiviteten är diffus uppstår inga problem, men ibland
syns endast ett punktformat mönster av positiva signaler och då finns alltid risken att färgningen
har skett ospecifikt (21). I de fall detta scenario har uppstått i denna studie har den negativa
kontrollen av vävnadsprovet kontrollerats och om båda infärgningarna stämde överens med
varandra drogs slutsatsen att det handlade om en ospecifik färgning och den punktformade
färgningen har därmed bedömts som negativ.
15
Materialet till studien samlades in från biobanken på Malmö Högskolas avdelning för Oral
patologi och består av patologiska vävnadsprover från patienter med ett flertal lesioner som ingår
i sjukdomsbilden för PVL. Då PVL är en klinisk diagnos som yttrar sig i en sjukdomsbild med
flera olika lesioner som slutligen leder till cancer kan den endast ställas retrospektivt av klinikern.
I studien är den kliniska informationen begränsad till klinikerns remisstext då inga journalanteckningar inhämtats. För att på bästa sätt säkerställa att de patienter som tagits med i urvalet
har diagnosen PVL användes stränga och snäva urvalskriterier. Utgångsmaterialet var mycket
omfattande men på grund av urvalskriterierna valdes många möjliga PVL-patienter bort. Det
finns därför förutsättningar för att i en senare, mera omfattande studie utvidga materialet genom
att även inkludera journalanteckningar från klinikerna och därmed erhålla ett större urval av
patienter.
PVL progredierar under en mycket lång tid, vilket medför att en del av vävnadsproverna var upp
till 13 år gamla. Trots inbäddning i paraffin, bryts DNA ned över tid, vilket kan innebära att
utslaget av infärgningarna inte blir så tydligt som om vävnaderna hade varit färskare.
Resultaten i studien visar en tendens till att HPV kan spela en roll i PVLs utveckling. I 7 av 11
patientfall kunde HPV detekteras i biopsin tagen i det senare sjukdomsskedet med hjälp av
screeningproben. Vid uppföljningen av de sju fallen av en föregående biopsi från samma
lokalisation var fyra positiva vid screening. I tre fall var vävnaden där cancer senare uppstod
infekterad av HPV redan innan cancern uppstod, vilket antyder att HPV haft betydelse för den
maligna transformationen.
Fynden i de andra biopsierna som var positiva vid screening, men där HPV inte kunde följas
tillbaka till innan cancern, tyder på att HPV i deras fall inte spelade in i carcinogenesen. Vid
16
livmoderscancer har man sett att HPV-infektionen avtar efter hand, vilket betyder att HPV skulle
kunna initiera cancerstarten och sedan försvinna vilket antyder att denna tidiga effekt av HPV
inte alltid kan upptäckas med traditionella molekylärbiologiska metoder. Det är heller inte klarlagt om HPV måste integreras i orala cellers genom för att påverka carcinogenesen eller om de
kan förbli i episomal form (22). Möjligheten att en infektion med HPV kan avta eller helt
försvinna efter att ha initierat den cancerogena transformationen innebär att det föreligger en brist
i denna studie då inte alla biopsier från det tidiga stadiet genomgått screening för HPV.
Endast i en biopsi i underlaget påvisades HPV 16/18 som anses vara de mest maligniserande
HPV-typerna. HPV-16 har dock tidigare rapporterats som den mest prevalent typen i leukoplakier
och i PVL (15). Inget fall med lågrisktyperna HPV 6/11 kunde identifieras trots att det har indikerats att lågrisktyper förekommer oftast i leukoplakier (16, 15). Detta kan bero på att den valda
metoden med in situ hybridisering inte är tillräckligt känslig då ett visst antal viruskopior krävs
för att ge ett positivt utslag. En del studier talar om en koinfektion med flera olika typer av HPV
vilket stämmer väl över ens med resultaten i denna studie då flertalet positiva biopsier
detekterades med screeningproben (15) . Det har även föreslagits att HPV kan ha en initial roll i
transformationen och sedan försvinna (15), något som inte stämmer med resultaten i denna studie
då HPV påvisas mer frekvent i de senare lesionerna. Som nämnts tidigare har detta scenario dock
inte utretts adekvat. En möjlig förklaring till skillnaden i studier skulle kunna vara att vissa
cancerlesioner är sekundärinfekterade med HPV.
Bagan et al har visat att PVL breder ut sig i form av så kallad ’field cancerization’, vilket innebär
att det över stora ytor förekommer spridda förstadier till cancer och invasiv cancer (14). Detta
menar Bagan et al tillsammans med det korta tidsspannet mellan uppkomsten av lesionerna ger
17
stöd åt hypotesen att PVL har en infektiös etiologi, möjligen av viral typ (14). Bagan et al har
dock misslyckats med att hitta HPV med PCR, sannolikt beroende på det begränsade urvalet,
varför det inte går att dra några klara slutsatser. Då PVL är en ovanlig sjukdom, som är svår att
diagnostisera, föreligger problem att utforma studier, där urvalet utgör ett tillräckligt underlag för
att kunna komma fram till övertygande resultat.
Den samlade bilden av dagens forskning är att HPV kan spela en roll i den maligna transformationen, framförallt med tanke på förmågan hos E6 och E7 att mediera cancer via inaktivering av
p53 och Rb (7,8).
Slutsats
I föreliggande studie där prevalensen av HPV i biopsier från patienter med misstänkt PVL undersöktes i syfte att använda HPV som riskmarkör för utveckling av PVL, kan man dra slutsatsen att
förekomsten av HPV ofta tycks öka vid progression av sjukdomen men det går inte att identifiera
något säkert samband med hjälp av in situ hybridisering. Sambandet mellan HPV och PVL har
redan ifrågasatts i tidigare studier (14)(13).
Idag behandlas PVL-lesionerna på samma sätt som vanliga leukoplakier vilket innebär
behandling med kirurgi i form av excision eller resektion, laser, kemoterapi, strålbehandling,
retinoider eller kortikoider. Ingen av dessa behandlingsmetoder har visat sig vara effektiv. Det
finns få studier publicerade som utreder olika behandlingsmetoders effektivitet. Målet med
forskningen bör vara att finna etiologin för att kunna förbygga att lesionerna uppkommer. Det
vore av stort värde att identifiera en riskmarkör för utveckling av PVL och få klarhet i etiologin
för att i ett tidigt skede kunna ställa diagnos och utveckla behandlingsmetoder.
18
Referenser
1. Hansen LS, Olson JA, Silverman S,Jr. Proliferative verrucous leukoplakia. A long-term study of
thirty patients. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1985; 60: 285-298.
2. Cabay RJ, Morton TH,Jr, Epstein JB. Proliferative verrucous leukoplakia and its progression to
oral carcinoma: a review of the literature. J Oral Pathol Med. 2007; 36: 255-261.
3. Parkin DM, Bray F. Chapter 2: The burden of HPV-related cancers. Vaccine. 2006; 24 Suppl 3:
S3/11-25.
4. Shope RE, Hurst EW. Infectious Papillomatosis of Rabbits : with a Note on the Histopathology.
J Exp Med. 1933; 58: 607-624.
5. Syrjanen K, Syrjanen S, Lamberg M, Pyrhonen S, Nuutinen J. Morphological and immunohistochemical evidence suggesting human papillomavirus (HPV) involvement in oral squamous
cell carcinogenesis. Int J Oral Surg. 1983; 12: 418-424.
6. Jenkins D. A review of cross-protection against oncogenic HPV by an HPV-16/18 AS04adjuvanted cervical cancer vaccine: importance of virological and clinical endpoints and implications for mass vaccination in cervical cancer prevention. Gynecol Oncol. 2008; 110: S18-25.
7. Chaudhary AK, Singh M, Sundaram S, Mehrotra R. Role of human papillomavirus and its
detection in potentially malignant and malignant head and neck lesions: updated review. Head
Neck Oncol. 2009; 1: 22-3284-1-22.
8. Ha PK, Califano JA. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit Rev Oral Biol
Med. 2004; 15: 188-196.
19
9. Syrjanen S, Rautava J, Willberg J. Humana papillomvirus och orala infektioner. Tandläkartidningen. 2012; 3: 70-74.
10. Doorbar J. Papillomavirus life cycle organization and biomarker selection. Dis Markers. 2007;
23: 297-313.
11. Syrjanen S. Humana papillomvirus och orala infektioner. Tandläkartidningen. 2006; 98 (2):
41.
12. Wu TC. Immunology of the human papilloma virus in relation to cancer. Curr Opin Immunol.
1994; 6: 746-754.
13. Campisi G, Giovannelli L, Ammatuna P, Capra G, Colella G, Di Liberto C et al. Proliferative
verrucous vs conventional leukoplakia: no significantly increased risk of HPV infection. Oral
Oncol. 2004; 40: 835-840.
14. Bagan JV, Jimenez Y, Murillo J, Gavalda C, Poveda R, Scully C et al. Lack of association
between proliferative verrucous leukoplakia and human papillomavirus infection. J Oral
Maxillofac Surg. 2007; 65: 46-49.
15. Feller L, Lemmer J. Oral Leukoplakia as It Relates to HPV Infection: A Review. Int J Dent.
2012; 2012: 540561.
16. Miller CS, Johnstone BM. Human papillomavirus as a risk factor for oral squamous cell
carcinoma: a meta-analysis, 1982-1997. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.
2001; 91: 622-635.
20
17. Nationalencyklopedin. in situ-hybridisering. http://www ne se. ; 2013-01-27.
18. ZytoVision GmbH. http://www.zytovision.com/Manuals/zytofastmanuals.html. T-1144-400,
T-1055-400, T-1056-400, T-1053-400, T-1054-400. ; 2013-01-27.
19. Palefsky JM, Silverman S,Jr, Abdel-Salaam M, Daniels TE, Greenspan JS. Association between
proliferative verrucous leukoplakia and infection with human papillomavirus type 16. J Oral
Pathol Med. 1995; 24: 193-197.
20. Gopalakrishnan R, Weghorst CM, Lehman TA, Calvert RJ, Bijur G, Sabourin CL et al. Mutated
and wild-type p53 expression and HPV integration in proliferative verrucous leukoplakia and
oral squamous cell carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1997; 83: 471477.
21. Boy S, Van Rensburg EJ, Engelbrecht S, Dreyer L, van Heerden M, van Heerden W. HPV
detection in primary intra-oral squamous cell carcinomas--commensal, aetiological agent or
contamination? J Oral Pathol Med. 2006; 35: 86-90.
22. Ha PK, Califano JA. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit Rev Oral
Biol Med. 2004; 15: 188-196.
23. Chaudhary AK, Singh M, Sundaram S, Mehrotra R. Role of human papillomavirus and its
detection in potentially malignant and malignant head and neck lesions: updated review. Head
Neck Oncol. 2009; 1: 22.
21
24. Syrjanen SM, Syrjanen KJ, Happonen RP. Human papillomavirus (HPV) DNA sequences in oral
precancerous lesions and squamous cell carcinoma demonstrated by in situ hybridization. J Oral
Pathol. 1988; 17: 273-278.
22
Figurer
Fig. 1a
Fig. 1b
Fig. 1c
23
Fig.2
Fig. 3
24
Fig. 4a
Fig. 4b
Fig. 5
25
Fig. 6a
Fig. 6b
Fig. 6c
26
Fig. 7a
Fig. 7b
27
Figurtexter
Fig. 1a-c: Eosininfärgade biopsier från patient 2 (se tabell 1) med återkommande lesioner på olika
ställen i munnen.
Fig. 1a: 2004: Verrukös hyperplasi med dysplasi i kindslemhinna.
Fig. 1b: 2008: Lichenoid reaktion i gom
Fig. 1c: 2011: Biopsi från läpp visar på skivepitelcancer med invasivt växande epitel
Fig. 2: Modifierad version av Hansens histologiska illustration som visar diagnoser inkluderade i
PVLs sjukdomsbild (1).
Fig. 3: HPV-16-genom och integration i värdcellen (8).
Fig. 4a-b: Närliggande seriesnitt hybridiserades med positiv (4a) och negativ (4b) kontrollprob
visar att hela snittet har förmåga att färgas in positivt och den negativa visar att snittet inte färgas
in ospecifikt. Dessa kontroller bekräftar att vårt resultat är korrekt
Fig 5: Patient 5: Skivepitelcancer som visar positivitet med röda kärnor i basalcellslagret för
screeningproben
Fig. 6a-c: Patient 2 med epiteldysplasi som med röda kärnor i cellerna i basalcellslagret visar
positivitet för screeningproben (HPV 6/11/16/18/31 /33/ 35/45/51/82)
Fig. 7 a-b. Patient 1: Skivepitelcancer som visar positivitet för HPV 16/18
28
Tabell
Patient nr
Diagnos
6/11/16/18/31/33/35
/45/51/82
16/18
1
Skivepitelcancer
+
+
Epiteldysplasi
+
-
Verrucös cancer
+
-
Epiteldysplasi
+
Skivepitelcancer
+
Verrukös hyperplasi
+
Verrukös hyperplasi
2
6/11
-
-
-
+
-
-
Benign hyperkeratos
+
-
-
Skivepitelcancer
+
-
-
Epiteldysplasi
-
Skivepitelcancer
+
-
-
Benign hyperkeratos
-
Skivepitelcancer
+
-
-
Lichenoid reaktion
biopsi saknas
Verrukös hyperplasi+epiteldysplasi
-
Verrukös hyperplasi
+
-
-
9
Verrukös cancer
-
10
Skivepitelcancer
-
11
Skivepitelcancer
-
3
4
5
6
7
8
Tabell 1. Visar resultaten för varje patientfall vid screening, HPV 6/11 och 16/18.
29
