Örebro University
School of Medicine
Degree project, 15 ECTS
Jan 2015
Identifiering av specifka sekvenstyper av
Staphylococcus epidermidis med massspektrometri
Version 2
Författare: Christian Karlsson, Läkarstudent T6
Handledare: Erik Ahlstrand, Leg. Läkare, med. dr.
Martin Sundqvist, Leg. Läkare, med. dr.
Bo Söderquist, Leg. Läkare, Professor
Laboratoriehandledare: Bengt Hellmark, Leg. BMA, med. dr.
Örebro, Sverige
Sammanfattning
Bakgrund: Staphylococcus epidermidis är normalt en ofarlig bakterie som ingår i hudens
normalflora. Den kan dock orsaka infektion, speciellt hos patienter som har inopererade
medicinskt tekniska produkter som ledproteser eller centrala venkatetrar. Patienter med
nedsatt immunförsvar löper också ökad risk att infekteras. Det har visat sig att en specifik
sekvenstyp, ST2 är mer benägen att orsaka infektion än andra sekvenstyper. Sekvenstyp (ST)
identifieras med Multi Locus Sequence Typing (MLST) som är en dyr och tidskrävande
metod. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS) är en relativt ny metod som visat god förmåga att identifiera bakterier på artnivå.
Syftet med denna studie var att beskriva huruvida MALDI-TOF MS kan användas för att
skilja ut ST2 från övriga sekvenstyper hos S. epidermidis.
Material och Metoder: 75 bakterieisolat av S. epidermidis vars sekvenstyp identifierats med
MLST i en tidigare studie valdes ut. 40 av dessa tillhörde ST2. De 35 övriga isolaten
utgjordes av 5 isolat per sekvenstyp av ST5, ST22, ST23, ST57, ST59, ST73 och ST215.
Dessa analyserades med MALDI-TOF MS som genererar masspektrum. Dessa analyserades
sedan på 3 olika sätt. Programvaran MALDI Biotyper 3.1 användes för att göra en
klusteranalys av isolaten. Spektrumen granskades manuellt med programvaran Flexanalysis.
Sensitivitet och specificitet för olika tröskelvärden beräknades.
Resultat: Klusteranalysen visade att ST2 förekom i flera grupper. Vid manuell granskning av
spektrumen upptäcktes extra toppar hos 13 av 40 ST2 isolat och även hos ett flertal övriga
sekvenstyper. Vid tröskelvärdet 1 identifierade MALDI-TOF MS ST2 med en sensitivitet på
95% och en specificitet på 85,7%. Vid stigande tröskelvärden sjönk specificiteten kraftigt
medan sensitiviteten steg marginellt.
Diskussion: Den stora spridningen av ST2 i klusteranalysen tyder på stora skillnader i
proteinsammansättning trots begränsade genetiska skillnader. MALDI-TOF MS identifierar
ST2 med låg specificitet redan vid tröskelvärdet 1. Däremot är sensitiviteten hög. Andra
matrixlösningar och inställningar i programvaran inför analys skulle kunna ge annorlunda
resultat avseende diskriminering av olika ST. Det är i dagsläget oklart vad de upptäckta
extratopparna står för.
Slutsats: MALDI-TOF MS kan eventuellt användas som ett stöd för beslut om vidare analys
med MLST i en situation där det är kliniskt relevant att identifiera sekvenstyp. Potential finns
för ytterligare forskning inom ämnet.
i
Förkortningar
α-cyano-4-hydroxykanelsyra-matrixlösning (HCCA-matrixlösning)
Central venkateter (CVK)
Koagulasnegativa stafylokocker (KNS)
Mass spectra projektion (MSP)
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF
MS)
Multi Locus Sequence Typing (MLST)
Receiver operating characteristic kurva (ROC-kurva)
Sekvenstyp (ST)
Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis)
Universitetssjukhuset i Örebro (USÖ)
ii
Innehållsförteckning
Bakgrund……………………………………………………………………………………….1
Syfte……………………………………………………………………………………………4
Material och metoder…………………………………………………………………………..5
Resultat…………………………………………………………………………………………8
Diskussion…………………………………………………………………………………….13
Slutsats………………………………………………………………………………………..15
Särskilt tack…..……………………………………………………………………………….15
Referenser…………………………………………………………………………………….16
iii
Bakgrund
Staphylococcus epidermidis
Cytostatikabehandling har gett en möjlighet att förlänga överlevnaden och ibland bota flera
cancerformer, däribland maligna blodsjukdomar. [1]
Cytostatikabehandling är även associerat med svåra biverkningar då även frisk vävnad
påverkats. Vilka typer och allvarlighetsgrad av biverkningar patienten drabbas av beror på
cytostatikapreparatets typ och dosering. Sterilitet, håravfall, epitelskador och försämrad
sårläkning är vanligt förekommande biverkningar. En annan ofta förekommande biverkan är
benmärgstoxicitet med nedsatt produktion av normala blodceller, däribland erytrocyter,
trombocyter, lymfocyter och granulocyter. [2]
Inom gruppen granulocyter finns de neutrofila granulocyterna. Dessa utgör en viktig del av
det medfödda immunförsvaret och utgör en viktig del i första linjens försvar mot många
mikroorganismer. Vid infektion mobiliseras neutrofila granulocyter och benmärgens
produktion av neutrofila granulocyter kraftigt. Granulocyterna migrerar till det infekterade
området där de kan fagocytera mikroorganismer, samt orsaka inflammation. Vid sjunkande
antal neutrofila granulocyter har en ökad förekomst, allvarlighetsgrad och mortalitet i
sjukdomar som orsakas av bakterier, virus och svampar observerats. [3, 4]
Bland de mikroorganismer som orsakat infektion hos neutropena patienter har det i ett flertal
studier visat sig att grampositiva bakterier utgör den största andelen. Av dessa grampositiva
bakterier orsakas de flesta sjukdomsfallen av koagulasnegativa stafylokocker (KNS) som
tillhör den normala floran på människors hud och slemhinnor. [5-7]
KNS kan i vissa situationer bli invasiv och ta sig in i blodbanan genom skador på slemhinnor
och hud, exempelvis orsakade av cytostatika, samt via centrala venkatetrar (CVK). En CVK
är i många fall är nödvändig vid behandling av maligniteter för att administrera cytostatika.[8]
Vid en närmare analys av KNS-positiva blododlingar i en studie som undersökte
kateterrelaterade infektioner framkom det att Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) var
den art som förekom oftast. [9]
S. epidermidis. har visat sig ibland ha förmågan att binda till främmande material som
opererats in i kroppen, exempelvis CVK, ledproteser eller andra inopererade medicinskt
tekniska produkter. När de har lyckats etablera sig på den inopererade produkten kan de bilda
en polysackaridbaserad biofilm som omsluter bakterierna och skyddar mot antibiotika,
komplement, antikroppar och fagocytos. Det har även framkommit att mindre
bakteriekolonier kan släppa från moderpopulationen och metastasera till andra delar av
1
kroppen via blodbanan. S. epidermidis kan i vissa fall producera cytolytiska och
proinflammatoriska toxiner, men i allmänhet anses inte toxiner vara en avgörande
virulensfaktor. [10, 11]
Att vistas i sjukhusmiljö och behandlas med cytostatika och antibiotika har visat sig leda till
ökad risk för att mer resistenta och virulenta typer av S. epidermidis selekteras fram bland
patienternas normalflora på huden vilket ökar risken för att just dessa därefter kan orsaka
infektion. [12]
I ett flertal studier med syfte att undersöka långtidsepidemilogi har blododlingar från patienter
med sepsis orsakad av S. epidermidis analyserats med metoden Multi Locus Sequence Typing
(MLST). Metoden analyserar mikroorganismer på genetisk nivå genom att analysera
variationer i några (oftast 7) specifika så kallade housekeeping-gener. Dessa tillverkar
proteinaser som är nödvändiga för cellens normalfunktion och har därför låg grad av
mutation. Skillnader i dessa används för att dela upp bakterierna i så kallade sekvenstyper
(ST). [13, 14]
Antibiotikaresistens och förmåga till att orsaka invasiv sjukdom (invasivitet) har visat sig
variera mellan olika sekvenstyper av S. epidermidis. En specifik sekvenstyp (ST2) har visat
sig dominera bland sjukhusförvärvade infektioner orsakade av S. epidermidis hos känsliga
patienter såsom de som vårdas på intensivvårdsavdelningar och patienter med inopererat
främmande material, t ex ledproteser. Detta har observerat på sjukhus i flera världsdelar. [1518]
Även vid den hematologiska vårdenheten vid Universitetssjukhuset i Örebro har en dominans
av ST2 noterats. I en studie inkluderande samtliga S. epidermidis- positiva blododlingar
mellan 1980-2009 analyserats med MLTS. ST2 förekom i en majoritet av dessa. [19]
Mass-spektrometri
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF
MS) är en relativt ny metod som kan användas för att med hög precision artbestämma
mikroorganismer utifrån deras proteinsammansättning. En odlad mikroorganism som ska
analyseras placeras på en platta och där kapslas in i en matrixlösning. Sedan beskjuts provet
med en ultraviolett laser vilket exiterar matrixen vilket i sin tur leder till joniserade proteiner.
Proteinerna fångas sedan upp i ett definierat elektriskt fält varefter de storlekssepareras i en
vakuumtunnel och träffar en detektor i rörets bortre ände. Ju större ett protein är, desto längre
tid tar det för proteinet att färdas genom röret. Baserat på såväl energin som frisätts i detektorn
som den tid det tar för den laddade molekylen att nå detektorn räknas proteinernas massa ut.
2
Även mängden proteiner av samma storlek registreras. Resultatet redovisas som ett massspektrum där proteinstorleken representeras på x-axeln normalt inom intervallet 0-20000Da.
På y-axeln redovisas mängden joniserat protein av en viss storlek. Artbestämningen sker
sedan genom att mass-spektrat jämförs mot en databas som innehåller referensspektrum över
ett stort antal kända mikroorganismarters proteinsammansättning. Från databasen presenteras
sedan förslag på de mikroorganismarter som bäst stämmer överens med det registrerade massspektrat. [20]
MALDI-TOF MS har visat sig kunna identifiera de olika arterna inom gruppen KNS med hög
säkerhet.[21, 22]
I de fall MALDI-TOF MS inte kunnat avgöra mikroorganismens art har i många fall resultatet
förbättrats genom att på förväg lysera bakteriecellerna med hjälp av bland annat myrsyra och
på så vis kunna extrahera mikroorganismernas proteiner i löst form inför inbäddning i
matrixlösningen. Detta ger ett renare prov hos grampositiva bakterier då bland annat den
tjocka cellväggen skiljs från de interna proteinerna och inte inkluderas i analysen. [23]
MALDI-TOF MS har i vissa studier påvisat skillnader i proteinsammansättningen mellan
olika genetiska linjer av Staphylococcus aureus. Denna förmåga har dock ifrågasatts i andra
studier. [24-26]
MALDI-TOF MS har visat sig vara en snabb och billig metod för att identifiera en stor andel
bakterier på artnivå och dessutom kunnat skilja på vissa egenskaper inom arter. Många andra
analysmetoder är dyrare och mer tidsödande. [21, 22, 24, 25]
Eftersom ST2 är en betydande orsak till infektioner hos neutropena patienter så inriktar sig
det aktuella projektet på att undersöka om MALDI-TOF MS kan skilja ut ST2 från övriga
sekvenstyper.
3
Syfte
Att beskriva huruvida MALDI-TOF MS kan användas för att skilja ut Sekvenstyp 2 från
övriga sekvenstyper hos Staphylococcus epidermidis.
4
Material och Metoder
Bakteriestammar
Från en tidigare studie [18] fanns 373 isolat av S. epidermidis sparade vid
Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset i Örebro (USÖ).
Samtliga isolat hade sitt ursprung i positiva blododlingar som tagits från patienter som vårdats
på den hematologiska sektionen på Medicinska kliniken, USÖ mellan 1980-2009. De hade
förvarats frysta i -70°C. Isolatens sekvenstyp hade tidigare identifierats med MLST. [19]
Bland dessa isolat valdes 75st ut till den aktuella studien. Ungefär hälften av isolaten
planerades att tillhöra ST2 för att kunna jämföra dem sinsemellan och avgöra om det fanns
några variationer i proteinsammansättningen inom sekvenstypen. Den andra hälften
planerades bestå av andra sekvenstyper för att kunna avgöra om det fanns skillnader mellan
dessa och ST2. Isolaten från 80-talet exkluderades helt på grund av att det från dessa patienter
saknades viss klinisk information om exempelvis sepsisförloppet, som skulle kunna vara av
intresse vid framtida forskning inom området. I vissa fall förekom flera isolat som tagits från
samma patient. I dessa fall valdes enbart en odling per patient. Efter inkluderingen hade 40st
isolat från ST2 valts ut. Från de övriga sekvenstyperna valdes 5st vardera. Dessa tillhörde
sekvenstyperna 5, 22, 23, 57, 59, 73 och 215. Initialt planerades även att sekvenstyperna 6 och
38 skulle inkluderas. Eftersom antalet isolat av dessa, som uppfyllde inklusionskriterierna, var
färre än 5st exkluderades de i denna analys.
Generering av Mass-spektra
Isolaten odlades ut på agarplattor med 5% hästblod och inkuberades över natt i luft med en
temperatur på 36 grader. Dagen därpå odlades samtliga isolat om på nya blodagarplattor och
inkuberades återigen över natten.
Nästa dag analyserades varje isolat med MALDI-TOF i duplikat. Rena tandpetare användes
för att placera en tunn bakteriefilm på provplattor i rostfritt stål (Bruker Daltonics). Över varje
prov applicerades sedan 1µL α-cyano-4-hydroxykanelsyra-matrixlösning (HCCAmatrixlösning) som fick torka. HCCA-matrixlösningen var en blandning av acetonitril
(Sigma-Aldrich), trifluorätticksyra (Sigma-Aldrich) och vatten i volymsproportionerna
50:2,5:47,5. Efter att dessa kemikalier blandats mättas lösningen med α-cyano-4hydroxykanelsyra (Sigma-Aldrich).
Proverna analyserades sedan i en MALDI-TOF masspektrometer, Microflex LT med
tillhörande programvara (Biotyper 3.1 och Flexanalysis, Bruker Daltonics, Bremen,
5
Tyskland). Samma inställningar användes som vid identifiering av bakterier. Totalt erhölls
150 spektrum, 2 per isolat. Vid analys jämfördes spektrumen mot den databas som ingår i
MALDI biotyper och de 10 troligaste bakteriearterna presenterades i fallande
sannolikhetsordning.
Samtliga bakterieisolat analyserades sedan ännu en gång efter att ha genomgått en fullständig
extraktion. 2-3 bakteriekolonier per isolat löstes upp i 300µL sterilt vatten. Därefter tillsattes
900µL 99,5% etanol. Suspensionen blandades med hjälp av vortex och centrifugerades sedan
i 2 minuter på 15000 RCF. En pellet hade då bildats i botten av röret. Supernatanten hälldes
av och centrifugeringen upprepades. Därefter pipetterades resterande supernatant bort och
pelleten fick lufttorka. Sedan tillsattes 20µL 70% myrsyra. Lösningen rördes om med
pipettspetsen så att pelleten blandades ordentligt med vätskan. Efter 2,5 minuter tillsattes
20µL 100% acetonitril. Lösningen blandades sedan med hjälp av vortex och centrifugerades
återigen i 2 minuter på 15000 RCF. En ny pellet hade då bildats som innehöll bland annat
resterna av mikroorganismernas cellvägg. Proteinerna som skulle analyseras var lösta i
supernatanten. 1 µL supernatant placerades på målplattan. När supernatanten torkat tillsattes
även 1µL HCCAmatrix som sedan också fick torka innan proverna analyserades i
masspektrometern. De fullständigt extraherade isolaten analyserades 5 gånger vardera. Totalt
erhölls då 375 masspektrum.
Analys av Mass-spektra
Programvaran MALDI biotyper 3.1 användes för att bilda ett medelvärde för de 5 massspektra som erhölls för varje isolat. Detta skapar så kallade mass spectra projektion (MSP),
totalt 75 stycken, ett per isolat. Dessa kategoriserades sedan efter sekvenstyp. Med hjälp av
dessa MSP bildades en helt ny databas där de olika sekvenstyperna fanns representerade. Mot
denna kunde sedan spektrum från de icke-extraherade proverna jämföras.
I programvaran MALDI biotyper 3.1 analyserades alla MSP i relation till sekvenstyp med
klusteranalys (parvis jämförelse). Alla MSP jämfördes med varandra. De MSP som var mest
lika varandra grupperades. Även ett avståndsvärde räknades ut beroende på hur lika varandra
spektrumen var. Ett lågt avståndsvärde tyder på låg differentiering mellan de jämförda
spektrumen. Denna parvisa gruppering och avståndsnivån mellan de olika MSP visualiserades
i ett dendrogram (Figur 1).
I tillägg jämfördes de icke extraherade isolatens spektrum mot den nybildade MSPdatabasen
för att se om den aktuella sekvenstypen skulle överensstämma med föreslagen sekvenstyp
6
från databasen. Även här lämnades förslag på de 10 mest överensstämmande spektrumen i
MSPdatabasen.
Programvaran Flexanalysis (Bruker Daltonic) användes för att manuellt leta efter likheter och
skillnader mellan de olika isolaten. Samtliga 375 masspektrum från de extraherade isolaten
analyserades. I ett första steg undersöktes varje bakterieisolats 5 mass-spektra för att se vilket
spektrum som bäst representerade det aktuella isolatet. Sedan analyserades spektrumen inom
de individuella sekvenstyperna för att se vilket spektrum som bäst representerade sin
sekvenstyp. Inom ST2 analyserades spektrumen även för att upptäcka eventuella skillnader i
spektrumen inom sekvenstypen.
Statistisk metod
Antalet isolat som MALDI-TOF MS identifierade som ST2 (ST2-positiva) jämfördes mot det
antal isolat som referensmetoden MLST identifierade som ST2. Denna jämförelse skedde i
fyrfältstabeller.
Sensitiviteten beräknades genom att räkna antalet sant positiva / (antalet sant positiva +
antalet falskt negativa).
Specificiteten beräknades genom att räkna antalet sant negativa / (antalet sant negativa +
antalet falskt positiva).
Dessa beräkningar gjordes vid tröskelvärde 1-5 för att kunna bilda en ROC-kurva (Figur 2)
som visade på sambandet mellan sensitivitet och specificitet för olika tröskelvärden. [27]
Etiska överväganden
Under detta projekt utfördes tester enbart på bakterieisolat utan koppling till information om
de patienter som isolaten kom ifrån. Inga experiment utfördes på vävnad från människa.
Vid inkludering av proverna användes en lista som innehöll information om olika patienter
vars blododlingar isolaten tagits från. Detta för att ge en bättre spridning så att flera olika
isolat inte skulle ha sitt ursprung i samma patient i de fall flera positiva blododlingar tagits
från samma patient. Dessa patientuppgifter var kodade och kunde av författaren till detta
dokument inte härledas till patienten i fråga.
7
Resultat
För alla isolat som analyserades föreslogs S. epidermidis som mest sannolikt art med scorevärde > 2,0 vid jämförelse mot MALDI Biotypers egen databas.
I MSP databasen gjordes en klusteranalys som grupperade ihop MSP efter hur lika varandra
de var, samt illustrerade avståndet mellan de olika isolatens MSP. Likheter och skillnader
mellan dessa MSP visualiserades i ett dendrogram (Figur 1). Klusteranalysen visade på stor
variation i proteinsammansättningen inom ST2. Enstaka ST2 isolat parades ihop med isolat
som tillhörde andra sekvenstyper. Skillnaden i proteinsammansättningen, kallad avståndsnivå,
illustrerades på dendrogramets x-axel. Låg avståndsnivå mellan parade isolat tyder på små
skillnader i proteinsammansättningen. Vid var 100:e avståndsnivå undersöktes hur många
grupper som fanns samt i hur många av dessa ST2 förekom. Klusteranalysen visade att de 75
isolaten var uppdelade i 31 grupper vid avståndsnivån 100. ST2 förekom i 15 av dessa.
Vid avståndsnivån 200 fanns det 17 grupper. ST2 förekom i 6 av dessa.
ST2 förekom i 3 av 10 grupper vid avståndsnivån 300.
Vid avståndsnivån 400 förekom ST2 i 2 av 5 grupper.
Vid avståndsnivån 500 syntes ST2 i 2 av totalt 3 grupper.
Slutligen vid avståndsnivån 800 fanns 2 grupper. ST2 förekom i båda.
8
Figur 1. Del av dendrogram som visar på differentieringen av sekvenstyperna i MSPdatabasen. Avståndsnivån illustreras på X-axeln. Bilden avsiktligt beskuren för att förbättra
läsbarheten.
9
För att definiera de olika tröskelvärdena användes den lista på 10 förslag av isolat som
programvaran presenterar när ett isolats spektra jämförs med spektrumen i MSP-databasen.
Vid tröskelvärdet 1 antogs isolatet tillhöra ST2 om ST2 var det förslag som presenterades som
mest sannolikt av databasen (Tabell 1). Vid tröskelvärdet 2 antogs isolatet tillhöra ST2 om
ST2 förekom som det mest sannolika eller näst mest sannolika förslaget. Detta upprepades
sedan upp till tröskelvärde 5 för att kunna bilda en receiver operating characteristic kurva
(ROC-kurva) (Figur 2).
Resultaten från jämförelsen av de icke-extraherade isolaten och MSP-databasen vid
tröskelvärde 1 redovisas i nedanstående fyrfältstabell. Det som undersöktes var huruvida den
av den nya databasen föreslagna sekvenstypen var överensstämmande med ST2 eller inte.
Som referensmetod användes den tidigare MLST analysen.
Tabell 1. Fördelning av ST2-positiva och ST2-negativa isolat enligt referensmetoden MLST
och testmetoden MALDI med tröskelvärdet 1.
ST2 enligt MLST
Icke ST2 enligt
Total
MLST
ST2 enligt MALDI
38
5
43
Icke ST2 enligt
2
30
32
40
35
75
MALDI
Total
För tröskelvärdet 1 beräknades sensitiviteteten beräknas till 95% och specificiteten till 85,7%.
För tröskelvärdet 2 steg sensitiviteten till 97,5% medan specificiteten sjönk till 71,4%.
För tröskelvärdet 3 steg sensitiviteten till 100% medan specificiteten sjönk till 48,6%
Specificiteten fortsatte sedan sjunka till 28,6% och 20% för tröskelvärdena 4 respektive 5.
10
Sambandet mellan sensitivitet och specificitet för de olika tröskelvärdena illustrerades på en
ROC-kurva. (Figur 2) Det tröskelvärde som ger det bästa förhållandet mellan sensitivitet och
specificitet är det tröskelvärde vars punkt på kurvan befinner sig närmast det övre vänstra
hörnet.
1
0.9
0.8
3
2
1
4
5
0.7
0.6
Sensitivitet 0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1-Specificitet
Figur 2. ROC-kurva som visar sambandet mellan sensitiviteten och specificiteten för
testmetoden MALDI vid tröskelvärdena 1-5.
11
Vid manuell analys i Flexanalysis kunde inga tydliga variationer i masspektrumen upptäckas
som kunde användas för att skilja ut sekvenstyp 2 från de övriga. Däremot upptäcktes att i 13
av de 40 ST2 isolaten förekom det extra toppar i masspektrumen (Figur 3). Proteinerna som
dessa toppar representerade hade massan 2442 Da respektive 4893 Da. Dessa toppar förekom
alltid tillsammans. Denna variation förekom även inom samtliga isolat av ST215 och vissa
isolat av ST22 och ST5.
Figur 3. Del av två spektrum från två olika ST2 isolat. Det undre isolatet har extra toppar vid
2442 resp. 4893 Da.
12
Diskussion
S. epidermidis av ST2 har beskrivits som mer patogen än andra sekvenstyper och det kunde
därför vara kliniskt relevant att hitta en enkel metod för att identifiera dessa. Syftet med
studien var att beskriva om MALDI-TOF MS kan skilja ut ST2 från övriga sekvenstyper av S.
epidermidis.
Metoddiskussion
Utifrån 373 isolat valdes 75 stycken ut till denna studie för att representera de viktigaste
sekvenstyperna hos S. epidermidis. Av de flesta sekvenstyperna fanns endast enstaka isolat.
Det hade dock funnits möjlighet att inkludera fler isolat av ST73, ST215 och ST2. Det är dock
oklart hur detta skulle ha påverkat resultatet, men med tanke på de resultatvariationer som
setts i studier där S. aureus analyserats med MALDI-TOF MS är möjligheten stor att
förändringar i resultatet kommer observeras. [24, 26]
Inför analys behandlades samtliga isolat likvärdigt vad gäller exempelvis inkubering,
mängden tillsatta kemikalier och kemikaliernas exponeringstid. Vid analysen användes den
matrixlösning och de mjukvaruinställningar som används vid rutinanalyser på
Laboratoriemedicinska länskliniken vid USÖ.
Ett par gånger under laborationsprocessen kontaminerades pipettspetsar som fick kasseras för
att minimera kontaminationsrisken. Det finns inga garantier för att oupptäckt oavsiktlig
kontamination inte inträffat under laborationen.
I andra studier har möjliga variationer i masspektrumen observerats vid användandet av olika
agarplattor, buljonglösningar och inkubationstider. Olika matrixlösningar har visat sig ge
variationer i storlek och intensitet av de proteiner som detekteras. Vissa matrixlösningar är
exempelvis mer lämpade för att detektera stora proteiner. [20]
Analys av de olika isolaten med variation av faktorer som inkubationstid, andra
matrixlösningar och andra mjukvaruinställningar inför analys skulle möjligen kunna leda till
ytterligare information om masspektrumet.
Resultatdiskussion
Vid analys av data beräknades en relativt hög sensitivitet även vid låga tröskelvärden.
Däremot var specificiteten lägre redan vid ett tröskelvärde på 1. Denna fortsatte att sjunka
kraftigt allteftersom tröskelvärdet ökade. Enligt ROC-kurvan (Figur 3) uppmättes det bästa
resultatet vid tröskelvärdet 1. Detta borde därför vara det tröskelvärde som passar bäst för att
13
beskriva sannolikheten att isolatet tillhör ST2. Utifrån detta förhållande tycks MALDI-TOF
MS vara en alltför ospecifik metod för att säkert kunna skilja ST2 från övriga sekvenstyper.
Däremot verkar metoden pålitlig i det avseendet att den sällan missar en sann ST2. Särskilt
vid ett tröskelvärde på 3 eller högre. Om det skulle uppstå en klinisk eller forskningsmässig
situation då det är av intresse att avgöra om en okänd S. epidermidis är av sekvenstyp 2 eller
inte skulle MALDI-TOF MS med den nytillverkade databasen som stöd kunna användas som
ett stöd när det ska avgöras om en MLST ska utföras eller inte.
Klusteranalysen visade på stora skillnader i proteinsammansättningen mellan isolaten. Även
de som tillhörde samma sekvenstyp. ST2 parades ofta ihop med isolat av andra sekvenstyper.
Detta tyder på att även om det finns en liten genetisk skillnad så är skillnaden stor i
proteinsammansättningen. Däremot är de stora avstånden generellt intressanta då de tyder på
att det finns en stor variation i isolaten som beror på något annat än sekvenstypen.
En studie av S. aureus visade på betydligt mindre avståndsnivå mellan isolaten. [24]
Det är i dagsläget oklart vad denna stora skillnad i avståndsnivån beror på. Men från vilket år
isolatet isolerades, patientens diagnos och/eller egenskaper hos bakterien som exempelvis
resistensmekanismer kan möjligen visa sig vara associerade med detta.
Vid manuell granskning av spektrumen i programmet Flexanalysis upptäcktes extra toppar i
vissa isolat (Figur 3). Dessa har inte kunnat förklaras i dagsläget, men de behöver inte vara
två separata proteiner. Möjligheten finns att ett protein kan dubbeljoniseras och på så vis
registreras med olika stor massa. Dessa extratoppar skulle möjligtvis kunna förklara
spridningen i dendrogrammet. Att isolat grupperas ihop utifrån om de har dessa extra toppar
snarare än att de grupperas efter sekvenstyp. Detta behöver undersökas närmare.
Andra studier som utförts på S. aureus har kunnat visa ett visst samband mellan variationer i
spektrumet då bakterien utsatts för stress eller uttrycker vissa resistensmekanismer. [24, 28]
De isolat som har dessa extra toppar, även de av andra sekvenstyper än ST2 skulle kunna
undersökas närmare för att avgöra om topparna är kopplade till vissa specifika egenskaper
såsom resistens, toxinproduktion eller ökad invasivitet.
14
Slutsats
I dagsläget har MALDI-TOF MS visat viss potential att kunna skilja ST2 från övriga
sekvenstyper. Men den aktuella metoden är inte tillräckligt specifik för att kunna ersätta
andra, säkrare metoder som exempelvis MLST. Däremot skulle den kunna användas som en
preliminär analys och vara ett stöd i ett eventuellt beslut om huruvida MLST ska göras eller
inte.
Potential finns för ytterligare forskning inom ämnet.
Särskilt tack
Jag vill först och främst tacka samtliga handledare. Era kunskaper inom varierade
expertisområden har varit värdefulla både under laborationens gång och vid
granskning/feedback av det skriftliga arbetets innehåll.
Jag vill även tacka personalen på Laboratoriemedicinska länskliniken, Mikrobiologi. Jag har
känt mig välkommen hos er från första stund.
Slutligen vill jag tacka Lars-Gunnar Gunnarsson för en bra insats som ordförande vid
examinationsseminariet.
15
Referenser
1. Haut A, Altman SJ, Cartwright GE, Wintrobe MM. The Influence of Chemotherapy on
Survival in Acute Leukemia. The Journal of Hematology 1955 Sep;10(9):875-895.
2. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ, Henderson G. Rang and Dale’s Pharmacology.
7th ed. London: Churchill Livingstone; 2007.
3. Murphy K. Janeway’s Immuno Biology. 8th ed. New York:Garland Science; 2012.
4. Bodey GP, Buckley M, Sathe YS, Freireich EJ. Quantitative Relationships Between
Circulating Leukocytes and Infection in Patients with Acute Leukemia. Annals of Internal
Medicine 1966 Feb;64(2):328-340.
5. Huoi C, Vanhems P, Nicolle M-C, Michallet M, Bénet T. Incidence of Hospital-Acquired
Pneumonia, Bacteraemia and Urinary Tract Infections in Patients with Haematological
Malignancies, 2004-2010: A Surveillance-Based Study. PLOS ONE 2013 Mar;8(3).
6. Kjellander C, Björkholm M, Cherif H, Kalin M, Giske CG. Hematological: Low all-cause
mortality and low occurrence of antimicrobial resistance in hematological patients with
bacteremia receiving no antibacterial prophylaxix: a single-center study. European Journal of
Haematology 2012;88:422-430.
7. Wisplinghoff H, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB. Current Trends in the Epidemiology
of Nosocomial Bloodstream Infections in Patients with Hematological Malignancies and
Solid Neoplasms in Hospitals in the United States. Clinical Infectious Diseases 2003;36:11031110.
8. Costa SF, Miceli MH, Anaissie EJ. Mucosa or skin as a source of coagulase-negative
staphylococcal bacteraemia?. The Lancet Infectous Diseases 2004 Maj;4:278-286.
9. Nouwen JL, van Belkum A, de Marie S, Jaqueline S, Wielenga JJ, Kluytmans JAJW,
Verbrugh HA. Clonal Expansion of Staphylococcus epidermidie Strains Causing Hickman
Catheter-Related Infections in a Hemato-Oncologic Department. Journal of Clinical
Microbiology 1998 Sep;36(9):2696-2702.
10. Ryan KJ, Drew WL. Pathogenic Bacteria. In: Ryan KJ, Ray CG, editors. Sherris Medical
Microbiology. 5th ed. New York: McGraw-Hill; 2010. p. 440-441.
16
11. Otto M. Staphylococcus epidermidis – the “accidental” pathogen. Nat Rev Microbiol.
2009 Aug;7(8):555-567.
12. Ahlstrand E, Persson L, Tidefelt U, Söderquist B. Alteration of the coagulase-negative
staphylococci in patients undergoing treatment for hematological malignancy. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis 2012;31:1679-1687.
13. Thomas JC, Vargas MR, Miragaia M, Peacock SJ, Archer GL, Enright MC. Improved
Multilocus Sequence Typing Scheme for Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical
Microbiology 2007 Feb;45(2):616-619.
14. Miragaia M, Thomas JC, Couto I, Enright MC, de Lencastre H. Inferring a Population
Structure for Staphylococcus epidermidis from Multilocus Sequence Typing Data. Journal of
Bacteriology 2007 Mar;189(6):2540-2552.
15. Li M, Wang X, Gao Q, Lu Y. Molecular characterization of Staphylococcus epidermidis
strains isolated from a teaching hospital in Shanghai, China. Journal of Medical Microbiology
2009;58:456-461.
16. Widerström M, McCullough CA, Coombs GW, Monsen T, Christiansen KJ. A MultidrugResistant Staphylococcus epidermidis Clone (ST2) Is an Ongoing Cause of Hospital-Acquired
Infection in a Western Australian Hospital. Journal of Clinical Microbiology 2012
Jun;50(6):2147-2151.
17. Iorio NLP, Cabolo RF, Azevedo MB, Barcellos AG, Neves FPG, Dmoingues RMCP, dos
Santos KRN. Characteristics related to antimicrobial resistance and biofilm formation of
widespread methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis ST2 and ST23 lineages in Rio de
Janeiro hospitals, Brazil. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2012;72:32-40.
18. Cherifi S, Byl B, Deplano A, Nagant C, Nonhoff C, Denis O, Hallin M. Genetic
characteristics and antimicrobial resistance of Staphylococcus epidermidis isolates from
patients with catheter-related bloodstream infections and from colonized healthcare workers
in a Belgian hospital. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 2014;13(20).
19. Ahlstrand E, Hellmark B, Svensson K, Söderquist B. Long term molecular epidemiology
of Staphylococcus epidermidis blood culture isolates from patients with haematological
malignancies. PLOS ONE 2014 Jun;9(6).
17
20. Giebel R, Worden C, Rust SM, Kleinheinz GT, Robbins M, Sandrin TR. Microbial
Fingerprinting using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass
Spectrometry (MALDI-TOF MS): Applications and Challenges. Advances in Applied
Microbiology 2010;71:149-184.
21. Carbonelle E, Beretti J-L, Cottyn S, Quense G, Berche P, Nassif X, Ferroni A. Rapid
Identification of Staphylococci Isolates in Clinical Microbiology Laboratories MatrixAssisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical
Microbiology 2007 Jul;45(7):2156-2161.
22. Dubois S, Leyssene D, Chacornac JP, Kostrzewa M, Schmit PO, Talon R, Bonnet R,
Delmas J. Identification of a Variety of Staphylococcus Species by Matrix-Assisted Laser
Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry. . Journal of Clinical Microbiology
2010 Mar;48(3):941-945.
23. Matsuda N, Matsuda M, Notake S, Yokokawa H, Kawamura Y, Hiramatsu K, Kikuchi K.
Evaluation of a Simple Protein Extraction Method for Species Identification of Clinically
Relevant Staphylococci by by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight
Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology 2012 Dec;50(12):3862-3866.
24. Wolters M, Rohde H, Maier T, Belmar-Campos C, Franke G, Scherpe S, Aqpfelbacher M,
Christner M. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillinresistant Staphylococcus aureus lineages. International Journal of Medical Microbiology
2010.
25. Wang YR, Chen Q, Cui SH, Li FQ. Characterization of Staphylococcus aureus Isolated
from Clinical Specimens by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight
Mass Spectrometry. Biomed Environ Sci 2013;26(6):430-436.
26. Johansson Å, Rhod Larsen A, Skov R, Sundqvist M. Importance of a Diverse Isolate
Collection When Defining Genotype-Specifik Mass Spectra in Staphylococcus aureus.
Journal of Clinical Microbiology 2014 Jul;52(7):2738-2739.
27. Bland M. An introduction to medical statistics. 3rd ed. New York: Oxford University
Press;2006.
18
28. Josten M, Reif M, Szekat C, Al-Sabti N, Roemer T, Sparbier K, Kostrzewa M, Rohde H,
Sahl H-G, Bierbaub G. Analysis of the Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization –Time of
Flight Mass Spectrum of Staphylococcus aureus Identifies Mutations That Allow
Differentiation of the Main Clonal Lineages. Journal of Clinical Microbiology 2013
Jun;51(6):1809-1817
19
