Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Cellskada och manipulering av cellers
känslighet för stress
Bakgrund
En cellskada kan uppstå på många olika sätt, till exempel exponering för kemikalier, värme,
kyla, hypoxi, ischemi eller strålning. Hur allvarlig skadan blir beror på vilket typ av stimuli och
dess styrka och varaktighet. I denna laboration studeras oxidativ stress som är en typ av negativ
påverkan och uppstår på grund av reaktiva syrederivat till exempel syreradikaler och
väteperoxid. Om celler utsätts för någon av dessa leder detta till oxidation av olika cellulära
komponenter som påverkar funktionen hos makromolekyler (DNA, proteiner, lipider,
kolhydrater).
En viss bildning av reaktiva syreradikaler sker hela tiden i alla celler. Under normal metabolism
bildas det reaktiva syrederivat ifrån 1 % av allt syre som metaboliseras. Antioxidanter är ämnen
som kan skydda celler mot oxidativ stress genom att stoppa reaktionerna som skapar fria
syreradikaler. Normalt finns det även en skyddsmekanism som utgörs av enzymet SOD
(superoxiddismutas) som omvandlar superoxidradikaler till väteperoxid (mindre reaktiv).
Reaktionen som bildar fria syreradikaler ser ut som nedan:
O2 ---> O2• --->O22-• ---> HO• ---> H2O
Ett annat sätt att minska skadligheten av reaktiva syrederivat är att hålla koncentrationerna av
fria järnjoner låga genom att använda en järnkelerare som binder upp fria järnjoner. Detta
eftersom väteperoxid kan göra skada genom att reagera med fria järnjoner via Fentonreaktionen där en hydroxylradikal bildas. Se nedan:
H2O2 + Fe2+ ---> HO• + OH- + Fe3+
Oxidativ stress påverkar ofta cellmembraners funktion via en process som heter
lipidperoxidering. Detta kan man studera genom att mäta ATP-nivån i celler eftersom
mitokondriers förmåga att producera ATP minskar om membranet är skadat. Man kan även
mäta utbredningen av lipidperoxidering genom att mäta nivåer av aldehyder (malondialdehyd,
4-hydroxyalkenaler) som bildas när cellmembran bryts ned.
Hypotes
Totalt skulle 10 olika prover med olika tillsatser undersökas. I de prover där väteperoxid
tillsattes tros cellerna utsättas för oxidativ stress genom att skapa reaktiva syrederivat enligt
formeln ovan. Skadligheten på cellerna förväntas öka i de cellodlingsskålar där både järn och
väteperoxid har tillsatts då Fenton-reaktionen bör ske. I proverna med järn, järnkelerare och
1
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
väteperoxid tros de två första neutralisera varandra och att det endast kommer vara
väteperoxid som utövar skadlig effekt. Endast järn bör verka skadligt på cellerna medan
järnkelerare och antioxidant tillsatt utan väteperoxid bör ha liten påverkan på cellerna. I de
prover där antioxidant och järnkelerare har kombinerats med väteperoxid var för sig förmodas
dessa kunna dämpa den negativa effekten av väteperoxid. I proverna med både antioxidant och
järnkelerare samt väteperoxid tros skadan bli mindre än i de enskilda proverna men i vilken
grad är det svårt att säga.
Material
22 st cellodlingsskålar (2x10 + 2)
N-acetylcystein (antioxidant)
Desferrioxamin (järnkelerare, som binder upp fria metalljoner)
Järn
Bilder från fluorescencemikroskop
Trypanblått
PBS (Phosphate-Buffered-Saline)
Triklorättiksyra
Tris-EDTA-buffert
N-methyl-2-phenylindole
ATP-standard
MDA-standard
Cellskrapa
Metod
Tillfälle 1
Tillsats av modulatorer av oxidativ stress
Uppgiften är att förbereda 20 stycken cellodlingsskålar med olika tillsatser som kan påverka
celler vid oxidativ stress. De modulatorer som användes var N-acetylcystein (antioxidant),
desferrioxamin (järnkelerare) och järnklorid (fria järnjoner). Innan laboration förbereddes en
uppställning för vilka modulatorer som skulle tillsättas till de olika cellodlingsskålarna. Se nedan.
1. kontroll (ingen tillsats)
2. järnklorid
3. järnkelerare
4. antioxidant
5. väteperoxid
6. järnkelerare+järn+väteperoxid
7. antioxidant+väteperoxid
8. järn+väteperoxid
9. järnkelerare+väteperoxid
10. antioxidant+järnkelerare+väteperoxid
Volymen för modulatorerna räknades ut med hjälp av formeln;
2
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
C1*V1=C2*V2
C1= koncentration före
V1= volym före (den variabel vi räknar ut)
C2= koncentration efter
V2= volym efter (2ml)
För att få ut V1 V1= (C2*V2)/C1
Modulator
Stamlösning
Järnklorid (FeCl3) 2 μL
30 mM
Desferrioxamin 20 μL
100 mM
N-acetylcystein 2 μL
1M
Slutkoncentration
30 μM
1 mM
1 mM
Tabell 1
Modulatorerna tillsattes i cellodlingsskålarna och ställdes in i cellodlingsskåpet. I skåpet är det
37 grader och 5 procent CO2, för att efterlikna miljön som är i människokroppen.
Kärnmorfologi vid apoptotisk celldöd
Nästa uppgift var att studera morfologiska
förändringar av cellkärnan vid apoptos.
Handledarna hade innan förberett preparat och
bilder för olika kombinationer av modulatorer
och oxidativ stress. Med hjälp av dessa kunde
man studera dessa i fluorescencemikroskop för
att sedan räkna ut en procentsats på hur
många celler som har gått i apoptos i de olika
preparaten.
Bilden visar cellkärnor som har behandlats med
järn. De kärnor som är inringade har bedömts
gått i apoptos. Detta eftersom de är mindre,
deformerade och lyser starkare.
Figur 1
Viabilitetstest – nekrotisk celldöd
Vi studerade också nekrotiska celler genom att använda en infärgning, trypanblått. När cellen är
nekrotisk, dvs trasigt cellmembran, kan färgen läcka in till kärnan och detta gör det då lätt att se
skillnad på en frisk respektive skadad cell. Två cellodlingsskålar hade gjorts iordning innan
laborationen, en kontroll och en där väteperoxid hade satts till. Mediet sögs upp med hjälp av
pipett. Trypanblått sattes till i båda skålarna och dessa fick inkubera i rumstemperatur under en
minut. Efter detta sögs färgen upp och tvättades bort med hjälp av PBS (två gånger). En liten del
PBS fick vara kvar för att cellerna inte skulle torka. Efter detta studerades cellerna i
ljusmikroskop. Vid studerandet av nekrotiska celler såg man att cellerna som hade behandlats
med väteperoxid färgade in med trypanblått ganska svagt. Cellkärnorna syntes tydligt men de
var ganska få till antalet. Kontrollcellerna hade inget tecken på infärgning.
3
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Tillfälle 2
Exponering för väteperoxid samt studera järninnehåll
Skålarna odlas i en inkubatorn som skall spegla miljöförhållandena i människokroppen.
Inledningsvis studerade cellerna i ljusmikroskop för att undersöka deras morfologi.
Odlingsmediet pipetterades bort från skålarna för att ersättas av 1 ml PBS (Phosphate-BufferedSaline) i skål 1-4 och 1 ml väteperoxid utblandad med PBS i skål 5-10 (se skålnummer i tabellen
ovan). Därefter inkuberades skålarna åter under 60 minuter. Därpå pipetterades all PBS och
väteperoxid bort ur skålarna. Efter detta tillsattes 500 µl 2,5 % triklorättiksyra (TCA) varpå
cellerna lyserade. Med hjälp av en cellskrapa kunde de lyserade cellerna sedan skrapas loss.
Vätskan i skålarna pipetterades till provrören som sedan frystes in.
Cellernas järninnehåll studerades i ett ljusmikroskop samt kvantifiering av cellernas järninnehåll
gjordes. Detta gjordes genom att räkna ut andelen järninnehållande celler (som har färgats in
med blått) utav det totala antalet. Cellerna i de olika proverna var sedan tidigare behandlade
med järn – samt tillsats av järnkelerare och antioxidant.
Tillfälle 3
ATP-analys med hjälp av chemiluminiscence
Inledningsvis sögs odlingsmedlet bort från samtliga provskålar. Därefter tillsattes 1 ml PBS till
skål nummer 1-4 och lika mycket väteperoxid till skål nummer 5-10. Proverna inkuberades i en
timme. Efter detta pipetterades all PBS respektive väteperoxid upp ur skålarna och tillsattes till
eppendorfrör. Därpå skrapas skålarna med cellskrapa för att lysera cellerna varpå 200 μL vatten
blandades med cellerna i skålarna och pipetterades till eppendorfrören. Därefter lades rören på
kylning till nästa tillfälle.
ATP-mätning
För att kunna räkna ut ATP-nivåerna studerades reaktionsformeln enligt nedan:
D-luciferin + ATP + O2 -> oxyluciferin + PPi + AMP + CO2 + ljus
780 μL Tris-EDTA-buffert och 200 μL ATP tillsattes till 10 provrör. Luminometern ställdes in för
bakgrunds luminiscens genom att ett av mätrören sattes i luminometern och nollställdes med
hänsyn till blandningen. Därpå tillsattes 20 μL vortexat prov (PBS och väteperoxid) från
eppendorfrören och sattes i maskinen för att mäta ATP-koncentrationen. Därefter tillsattes 10
μL ATP-standard till blandningen som sedan vortexades och sattes i maskinen för mätning.
Slutligen beräknades provernas ATP-koncentration enligt:
ATPprov=10^(-7) x Iprov/((Iprov+standard)-Iprov)
Formeln grundar sig på att koncentrationen ATP är proportionell mot det antal fotoner som
luminometern skickar ut.
4
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Tillfälle 4
Mätning av lipidperoxidering
Det här tillfället gick ut på att få fram koncentrationen av MDA/HAE då detta är ett mått på
mängden oxidativ skada i cellerna. När oxidering av fosfolipider i cellernas membran sker bildas
aldehyder som till exempel MDA och HAE. Prover till en standardkurva skapades genom att
olika koncentrationer av MDA-standard (malondialdehyd) tillsattes till sex olika provrör. Sedan
användes provrören som gjorts under tillfälle 3 genom att en liten mängd pipetterades till ett
nytt provrör. Sedan tillsattes reagenserna R1 (N-methyl-2-phenylindole) och R2. R1 och R2
tillsattes även till standardproverna. Alla dessa inkuberades sedan i 45°C i 60 minuter. Proverna
centrifugerades sedan för att få en klar supernatant, som sedan pipetterades till en 96hålsplatta för spektrofotometrisk absorbansmätning. Koncentrationen beräknades sedan av
MDA/HAE i proverna utifrån standardkurvan.
Resultat
Tillfälle 1
Andelen celler som bedömdes gått i apoptos:
Modulatorer
Totalt antal
celler
Antal apoptotiska
celler
Apoptosfrekvens i %
Kontroll
63
6
9,5
Väteperoxid
32
25
78
Antioxidant
55
5
9,1
Antioxidant + järn +
järnkelerare +
väteperoxid
48
13
27,1
Antioxidant + järn +
väteperoxid
9
7
77,8
Antioxidant +
väteperoxid
33
12
36,4
5
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Antioxidant +
väteperoxid +
järnkelerare
69
12
17,4
Järn
60
18
30
Järn + järnkelerare
50
3
4,4
Järn + väteperoxid
7
6
85,7
Järnkelerare +
väteperoxid
72
6
8,3
Tabell 2
Figur 2
6
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Tillfälle 2
Andelen fritt järn i celler behandlade med olika modulatorer:
Andel celler med järn
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Järn
Järn+Antioxidant
Järn+Järnkelerare
Kontroll
Figur 3
Tillfälle 3
Koncentration ATP i cellprover med olika modulatorer:
Figur 4
7
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Tillfälle 4
Fi
gur 5
M
Figur 6
8
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Diskussion
Tillfälle 1 – Apoptos vs nekros
De resultat som vi fick fram under delen där cellkärnor studerades med hjälp av redan tagna
bilder stämde bra överens med vår hypotes. Bilden som visade ett prov med celler som utsatts
för väteperoxid hade den näst högsta apoptosfrekvensen enligt vår uträkning. Det prov som
hade allra högst apoptosfrekvens var det som hade utsatts för både järn och väteperoxid. Detta
stämmer då väl överens med vad vi trodde från början. Provet med endast antioxidant hade en
av de lägsta apoptosfrekvenserna vilket också var väntat. Det hade också provet med järn och
järnkelerare vilket styrker vår hypotes om att järnkeleraren neutraliserar den skadliga effekten
som järn kan ha. När järnkelerare och väteperoxid kombinerades gav det också ett resultat som
inte påvisade någon hög frekvens av apoptos.
Antioxidant tillsammans med väteperoxid gav en relativt hög apoptosfrekvens vilket inte
stämmer överens med vad vi trodde. Detta kan bero på att antioxidanten inte är tillräckligt
stark vid vissa koncentrationer av väteperoxid eller att vår beräkning inte var helt korrekt.
Provet med antioxidant, järnkelerare och väteperoxid fick högre skadlig effekt än vad vi trodde
om man jämför med de övriga resultaten. Det kan vara så att antioxidanten och järnkeleraren
inte fungerar tillsammans men mest troligt är det att vi inte har bedömt bilderna helt rätt.
Tillfälle 2 Järninnehåll
Bilderna som undersöktes gav det resultat som förväntats. Både i kontrollproverna och de
prover där järn och järnkelerare tillsattes hade inga celler färgats in med trypanblått. Dessa
borde inte visa något heller eftersom cellerna dels lyckats binda upp allt järn själva alternativt
fått hjälp av järnkeleraren. I provet där enbart järn tillsattes kunde man se att 40 % av cellerna
färgats in och det var alltså fritt järn som cellerna inte klarade att binda upp. Detta stämmer
överens med hypotesen. Järn som tillsats gör att cellerna inte har stor förmåga att binda upp
allt och det kommer då att finnas kvar fritt. När det kom till det prov som hade tillförts järn och
N-acetylcystein (NAC) sågs ett mer förvånande resultat. Det var förväntat att NAC skulle ha en
mer hjälpande effekt, alltså hjälpa cellerna att binda upp järnet, dock gav uträkningarna
resultatet att 24 % av cellerna var infärgade i blått. Detta innebär att NAC inte har samma
förmåga att reducera järnmängden som järnkeleraren hade.
Tillfälle 3 ATP-analys
I resultatet ser vi endast en förändring i tre av proven. Resterande värden visar inte på en
betydande skillnad. De tre proven som uppvisade en större förändring var;
Väteperoxid + Antioxidant + Järnkelerare
Väteperoxid
Väteperoxid + Järn
Både resultatet av väteperoxid och väteperoxid + järn följer vår hypotes. Däremot om man
tillsätter antioxidant och järnkelerare blev resultatet oväntat, då cellerna hade större värde än
kontrollgruppen. Det kan bero av flera faktorer, antingen att väteperoxiden
9
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
överkompenserades och de fria radikalerna minskade i jämförelse med kontrollgruppen eller fel
beroende av metodiken.
Att värdet minskar vid tillsättning av väteperoxid och än mer av väteperoxid i kombination med
järn är logiskt eftersom det då kommer ske en Fentonreaktion. I reaktionen bildas de fria
radikalerna hydroperoxyl och hydroxyradikal vilka kommer inducera celldöd. Det är även
logiskt att vi ej ser försämrade resultat vid tillsättning av antioxidant eller järnkelerare då de
endast ska motverka fria radikaler. Anledningen till att antioxidanten inte gav ett högre värde
än kontrollen kan vara att värdena inte skiljer sig tillräckligt från kontrollen för att det ska kunna
avgöras.
Tillfälle 4 Lipid peroxidering
MDA-koncentrationen i de olika proverna är ett mått på lipidoxidering och därmed ett mått på
oxidativ stress. I vår hypotes antog vi att både väteperoxid och järn skulle leda till oxidativ
stress, vilket vi får bekräftat av resultatet. Den högsta koncentrationen fick vi i prov 8 som
innehöll både järn och väteperoxid, medan prov 5 med enbart väteperoxid hade den näst
högsta koncentrationen. I de prover där vi tillsatte antioxidant har vi fått mindre oxidativ stress
vilket också var enligt hypotesen. Det visar att antioxidanten har en skyddande förmåga mot
väteperoxiden. Även prov 6 med järn, järnkelerare och väteperoxid gick som väntat, där
järnkeleraren binder upp järnet och därmed förhindrar Fentonreaktionen från att ske. Detta
medför att vi får ett mycket lägre resultat än i prov 8. Våra kontrollprover följer även den
hypotesen, med låg oxidativ stress i de fyra första som vi inte tillsatt väteperoxid i, samt en hög
oxidativ stress i prov 5 som redan nämnts. Det som förvånade lite var att järnkeleraren var ett
så pass bra skydd mot oxidativ stress även i de proven som saknade järn. Detta resultat kan
visserligen bero på någon felkälla, men stärks i prov 10 där den tillsammans med antioxidant
skyddade mer mot väteperoxiden än i prov 7 där vi enbart hade väteperoxid och antioxidant.
Slutsatsen av laborationen är att antioxidanter ger ett skydd mot oxidativ stress. Nacetylcystein som användes är en vattenlöslig antioxidant vilket innebär att dess effekt är
relativt kortvarig då det inte kan lagras i kroppen. Den förekommer endast i cytosolen och
kommer därför inte kunna ge ett bra skydd mot lipidperoxidering. Med tanken på att det är en
reversibel modulator så kommer effekten avtas så fort den tas bort från cellerna. Vidare kan vi
konstatera att järnkelerare är väldigt effektiv på att binda upp fritt järn, vilket då ger ett skydd
mot skador.
Felkällor
Det finns många felkällor som man skulle ha kunnat påverka. Det kan alltid ske fel vid
pipetteringen av de olika ämnena. Vi kan också ha räknat fel vad gäller koncentrationer och vid
beräkning av formler. Under de studier som gjordes av redan färdiga bilder kan bedömningarna
vara felaktiga och variera från bild till bild. Vi vet heller inte om vi har räknat korrekt när vi
sedan har räknat hur många celler som har gått i apoptos. Den mänskliga faktorn är givetvis
alltid en felkälla.
10
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Felkällor som vi inte hade kunnat påverka är bland annat att de färdiga bilder som tilldelades
skulle kunna vara felaktiga. Vi har ingen uppfattning om bilderna har tagits vid samma tillfälle
och därför blir det svårt att jämföra och tolka dem mot varandra. Vissa celler kan redan ha gått i
apoptos och då försvunnit vilket gör dem omöjliga att ta med i beräkningen. Bilderna visade
också endast ett urval av celler och behöver inte vara representativt för hela cellodlingen. De
maskiner som användes under laborationen kan ha varit felkalibrerade eller använts på fel sätt.
Inkubatorn kan ha haft fel förhållanden i fall den har öppnats och stängts för mycket.
Medicinsk tillämpning
Cellskador och cellulärt åldrande är något som inte kan stoppas helt och hållet, dock kan man
med olika hjälpmedel göra så att skadan inte blir så allvarlig eller att åldrandet skjuts upp.
Slutsatser man kan dra är att antioxidanter och järnkelerare skulle kunna användas som antidot
vid olika cellskador som orsakats av väteperoxid. Det finns också en möjlighet att försöka få
fram tillskott i form av antioxidanter och järnkelerare som skulle tas i ett preventivt syfte för att
minska cellulärt åldrande och risken för allvarliga cellskador. Livsmedel som många människor
köper, till exempel mjölk, skulle kunna berikas med dessa ämnen. Med hjälp av kunskaperna
om väteperoxid och fria radikaler skulle det vara möjligt att få fram läkemedel som skulle kunna
hämma okontrollerad proliferation av celler vid till exempel cancer.
Laborationen visar dock att antioxidanter inte är lika bra i alla lägen då cellers naturliga
järninnehåll var högre i de som hade preparerats med antioxidanter än de som inte hade fått
någon tillsats alls. Därför är det viktigt att gå ut med kunskapen om att antioxidanter inte är bra
i hur höga doser som helst. En annan viktig kunskap som man inte ska glömma är att
väteperoxid i mycket små doser kan visa sig vara bra för cellens överlevnad. Celler bildar
normalt fria radikaler i små mängder och om detta skulle främjas i mycket liten grad skulle det
kunna stimulera cellerna till något positivt. Väteperoxid används som läkemedel i form av till
exempel Microcid som är en antibakteriell kräm.
N-acetylcystein används redan för att generera glutation i kroppen. Detta är väldigt väsentligt
vid intoxikationer av läkemedel, till exempel paracetamol. Järnkelerare används också som
läkemedel för att behandla järnförgiftningar eller sådana sjukdomar som sekundärt bildar fria
järnjoner i kroppen. Detta är patologiskt eftersom järn kommer att lagras in som hemosiderin i
olika vävnader och utövar skadeeffekter på olika sätt. Desferal är ett sådant läkemedel.
Referenser
Internet
http://www.fass.se/LIF/product?1&userType=0&nplId=19940923000023, 2014-02-11
Laborationshandledning, https://www.hu.liu.se/lakarprogr/t3/labbhandledning/1.538917/LabT3Cellskada2013.pdf
11
Cecilia Bergman, Melker Edberg, Axel Olsson,
Maria Persson, Erik Uhlin, Nathalie Vilhelmsson
Litteratur
Rang, Dale, Ritter, Flower, Henderson, Pharmacology, 2012, Elsevier
Övrigt
Föreläsning
”C ll
”
Öll g , 2014-02-11
12
