Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-19
Cellskada och manipulering av cellers
känslighet för stress
Henrik Lindholm, Ebba Bagge, Mariel Nehme,
Moa Bydén, Julia Dahlgren Solberg, Felicia André,
Mustafa Al-Attar, Daniel Duchen
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Bakgrund
Celler anpassar ständigt sin struktur och funktion beroende på ändrade krav och extracellulär
stress. Sådan stress kan vara kemikalier, ischemi, strålning, kyla eller hetta. Om stressen
överstiger den adaptiva förmågan, eller om den yttre stressen är väldigt skadlig för cellen kan en
cellskada utvecklas. Om stressen är alltför svår, är bestående eller utvecklas väldigt snabbt blir
resultatet en irreversibel cellskada som orsakar celldöd.
Oxidativ stress är en vanlig cellstress som orsakas av fria radikaler. Fria radikaler bildas normalt
som en restprodukt i elektrontransportkedjan i cellens mitokondrier och även i cellernas
peroxisomer. Vanligtvis neutraliseras de fria radikalerna av antioxidanter i cellen, men om
mängden fria radikaler överstiger cellens neutraliseringskapacitet kan cellskador, så som
oxidation av lipider (till exempel lipidperoxidering av cellmembran), DNA och proteiner uppstå.
Blir den oxidativa stressen för stor leder det till celldöd.
Metalljoner så som järnjoner har förmågan att generera hydroxylradikaler genom
Fentonreaktionen där järnjonen reagerar med väteperoxid.
H2O2 + Fe2+ → HO· + OH- + Fe3+
Om koncentrationen av fria metalljoner hålls låg minskar därför bildandet av fria radikaler i
cellen.
Oxidering av cellmembranens fosfolipider genererar aldehyder, exempelvis malondialdehyd
(MDA) och 4-hydroxyalkener (HAE). Dessa kan påvisas med en spektrofotemer (vid våglängd
586nm) efter att reagerat med N-methyl-2-phenylindole (R1) och bildat ett stabilt
kromoforkomplex.
Hypotes
Vid Fentonreaktionen bildas fria radikaler och det blir en oxidativ stress. Därför borde tillsats av
järn och väteperoxid, men även tillsats av endast järn då cellerna själva genererar väteperoxid,
orsaka oxidativ stress hos cellerna.
Tillsats av järnkelerare borde minska den oxidativa stressen cellerna utsätts för då järnkeleraren
binder upp järnet och därmed hindrar det från att medverka i Fentonreaktionen.
Tillsats av antioxidanter borde precis som järnkeleraren minska den oxidativa stressen då det
neutraliserar de fria radikalerna.
För att undersöka hypoteserna om hur olika modulatorer påverkar den oxidativa stressen cellerna
utsätts för läggs undersökningen upp enligt följande kombinationer.
1
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Tabell 1: Försöksupplägg. Skål 1-5 används som kontroll.
Skål Väteperoxid Järn Järnkelerare Antioxidant
x
1
x
2
x
3
4
x
5
6
x
x
7
x
8
x
9
x
x
10
x
x
x
x
x
x
Material
- 20 cellodlingsskålar med UT-SCC-77 (cellinje från humant skivepitel) och näringsmedium
- N-acetylcystein (antioxidant)
- Järnjoner
-Desferrioxamin (järnkelerare)
- Pipetter
- Pasteurpipetter
- Väteperoxid utspädd med PBS
- PBS
-Triklorättiksyra, TCA
- Cellskrapa
2
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Metod
1. Tillsats av modulatorer
De olika modulatorernas volym beräknades och pipetterades till cellodlingsmediet i skålarna
enligt försöksupplägget (se tabell 1). Totalt iordninggjordes 20 cellodlingsskålar för att få två
uppsättningar av varje vald kombination till efterföljande studier.
För att beräkna den volym av varje modulator som skulle tillsättas användes följande formel:
där
c1 = stamlösningens koncentration
v1 = volym modulator som ska tillsättas
c2 = slutkoncentration
v2 = slutvolym
Tabell 2
Modulator
Stamlösning
Slutkoncentration
Volym som ska
tillsättas (v1)
Järn (FeCl3)
30 mM
30 µM
2 µl
Desferal
100mM
1 mM
20 µl
N-acetylcystein (NAC)
1M
1 mM
2 µl
Slutvolymen (v2) i denna laboration ska vara 2 ml medium i varje skål. Se bilaga 1 för
beräkningar.
Cellerna inkuberades sedan i ett cellodlingsskåp som efterliknar kroppens miljö (37oC, 5% CO2)
till nästkommande dag.
Dessutom studerades apoptotiska cellers kärnmorfologi med hjälp av i förväg preparerade prover
(för olika kombinationer av modulatorer och oxidativ stress) i en fluorescencemikroskop.
Proverna var fixerade och DAPI (4’-6-diamidino-2-fenylindol) var tillsatt för att, genom
inbindning till A-T-rika områden i DNA, färga cellernas kärnor. De prover som motsvarade
försöksupplägget i denna laboration valdes ut och de olika provens apoptosfrekvens beräknades i
procent.
3
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Bild 1: Mikroskopisk bild av celler infärgade med DAPI.
Även nekrotisk celldöd studerades, och då med hjälp av infärgning med Tryptanblått. Celler som
gått i nekros färgas in och ses som blå i ljusmikroskop. Infärgningen beror på att cellmembranen
hos de nekrotiska cellerna inte längre är intakta.
Slutligen undersöktes järninnehåll i celler som i förväg behandlats med olika kombinationer av
modulatorer och oxidativ stress. Färgen Prussian blue färgar celler som innehåller järn blå, och
för att öka visualiseringen av cellerna är de även färgade röda. Frekvensen celler med
järninnehåll beräknades i procent utifrån ljusmikroskopiska bilder.
Bild 2:Mikroskopisk bild av celler infärgade med Prussian blue.
4
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
2. Exponering för väteperoxid inför undersökning av ATP samt lipidperoxidering
En uppsättning skålar, det vill säga 10 stycken, togs följande dag ut ur cellodlingsskåpet. Mediet
pipetterades bort och ersattes med 1000 µl väteperoxid i skål 4, 6, 7, 8, 9 och 10, enligt Tabell 1.
I resterande skålar byttes mediet ut mot 1000 µl PBS. Cellerna inkuberades sedan en timme i
cellodlingsskåpet.
Därefter pipetterades den tillförda vätskan bort för att ersättas med 500 µl TCA (triklorättiksyra)
för att lysera cellerna till efterföljande ATP-mätning, eller 200 µl vatten till efterföljande
lipidperoxideringstest. En cellskrapa användes sedan för att lossa cellerna från odlingsskålen,
och med hjälp av en pipett flyttades celler och vätska över till numrerade Eppendorfrör. De tjugo
rören frystes sedan in (i -70oC) för senare analys i steg 3 och 4 av laborationen.
3. ATP-analys
Till tio nya provrör tillsattes 780 µl Tris-EDTA buffert. Ett av dem sattes i luminometern för att
ange buffertens bakgrundsvärde. Till dessa provrör pipetterades sedan 200 µl ATP-reagens.
Sedan tillsattes 20 µl från de tidigare nedfrysta Eppendorfrören till vardera provrör.
Provrören sattes sedan en åt gången i luminometern varav ett värde (Iprov) för varje provrör
uppmättes. Därefter tillsattes 10 µl ATP-standard till varje rör för att sedan vortexas igen.
Provrören placerades sedan än en gång i luminometern för att mäta upp nya värden (Iprov+std).
Med hjälp av dessa värden räknades sedan ATP-innehållet (ATPprov) ut med följande formel:
ATPprov = 10-7 x Iprov/ (Iprov+std – Iprov)
4. Mätning av lipidperoxidering
2 µl av MDA-standardstamlösning späddes med 1000 µl vatten. Spädningen användes sedan för
att bereda sex olika Eppendorfrör med olika koncentration MDA genom att tillsätta vatten. Varje
rör innehöll 200 µl lösning där förhållandet mellan andelen vatten och spädningen av MDAstandard varierades enligt Tabell 3. En standardkurva kunde då tas fram, se Diagram 4. Denna
användes sedan för att beräkna MDA-R1-komplexkoncentrationen utifrån absorbansvärdena som
erhölls vid spektrofotometri.
Tabell 3
Koncentration (µM)
0
0,5
1
2
3
4
MDA-standard (µl)
0
25
50
100
150
200
Vatten (µl)
200
175
150
100
50
0
5
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
100 µl tinat prov, från vardera Eppendorfrör som frystes ned i steg 2, pipetterades till 10 nya
Eppendorfrör.
Reagens (R1) späddes med “diluent” och från denna blandning tillsattes 325 µl till varje
Eppendorfrör och även till de sex proven som utgjorde standardkurvan. 75 µl reagens (R2)
tillsattes till varje Eppendorfrör.
Eppendorfrören inkuberades i värmeblock, 45oC, i 45-60 min. Dessa centrifugerades sedan i 10
min för att bli av med cellrester som annars kan störa vid mätning. 2x150 µl (dubbelprover)
supernatant överfördes från varje prov (prover och standardkurva) till en 96-hålsplatta för
spektrofotometeri. Därefter mättes absorbansen.
Koncentration MDA-R1-komplex beräknades i proverna utifrån standardkurvan. Se Diagram 5.
Resultat
Tabell 4: Beräkning av andel celler som gått i apoptos utifrån fotografier tagna med
fluorescensmikroskop av olika cellodlingsskålar med samma förutsättningar som i denna studie.
Se diagram 1.
Modulatorer
Totalt antal
celler
Antal döda
celler
Antal döda celler i
procent
Enbart celler
65
4
6%
NAC
56
2
4%
Desferal
70
4
6%
Järn
63
9
14 %
Väteperoxid
32
25
78%
NAC + väteperoxid
32
13
41%
Desferal + väteperoxid
72
8
11 %
Järn + väteperoxid
7
7
100 %
Desferal + järn + väteperoxid
51
13
25 %
NAC + järn + väteperoxid
9
6
67%
6
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Diagram 1: Mortalitet hos celler i procent
Diagram 2: Järninnehåll hos celler i procent
Andel celler med järn
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Järn
Järn+Antioxidant
Järn+Järnkelerare
7
Kontroll
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Diagram 3: Beräkning av ATP i cellprover
Absorbans
Diagram 4: Standardkurva från steg 4.
Koncentration MDA
8
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Diagram 5: Koncentration MDA-R1-komplex i cellproverna beräknat med hjälp av
standardkurvan.
9
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Diskussion
Utifrån resultaten ses tydligt att addition av modulatorkombinationer (NAC, järnkelerare, järn)
enligt försöksupplägget gav resultat som överensstämde väl med den uppsatta hypotesen.
Addering av järn och väteperoxid visade sig ge den största oxidativa stressen och därav störst
celldöd vilket bekräftades av den låga koncentrationen, 20 µM, vid ATP-mätningen, hög
koncentration av MDA (hög lipidperoxidering) och 100 % mortalitet vid okulär cellräkning med
hjälp av flouroscensmikroskopiska bilder.
I fall då endast järn eller endast väteperoxid tillsatts kunde viss oxidativ stress uppmätas då ATPnivån för dessa prov var betydligt lägre än kontrollen (endast celler). Vid tillsats av enbart
järnkelerare eller antioxidant tillsammans med väteperoxid uppmättes mindre oxidativ stress med
järnkelerare än med antioxidant. I cellprover med endast antioxidant eller järnkelerare, mättes
liknande ATP-mängd som i kontrollprovet med endast celler. Att antioxidant skyddar sämre än
järnkelerare förstås även från MDA-analysen, då kombinationer med antioxidant gav högre
koncentration MDA än kombinationer med järnkelerare. Dessa resultat överensstämmer även
med resultaten från räkningen av de apoptotiska cellerna.
Anledning till detta skulle kunna vara en minskad frekvens utav Fentonreaktioner när
järnkelerare binder järn kontra antioxidanter som istället neutraliserar fria radikaler.
Orsaken till att järnkeleraren skyddade bättre än antioxidanten vid test av lipidperoxidering beror
troligen på att NAC, antioxidanten som användes, är en mestadels
vattenlöslig(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15122653). Detta gör att den inte är fullt
närvarande i cellmembranet som skydd mot lipidperoxidering, vilket har en effekt på resultatet.
Hade istället en fettlöslig antioxidant används i försöket hade lipidperoxidering skett i mindre
grad.
De felkällor som eventuellt finns har i sådana fall inte påverkat resultaten i någon större grad.
Felkällor som kan finnas i denna undersökning kan vara:
- Att en pipettspets lossnade från en automatpipett vid tillsats av Desferal till skål 7 i steg 1. Det
skulle eventuellt kunnat leda till skadade celler och att modulatorn inte adderades korrekt till
cellodlingsskålen.
- Att det i en skål tillsattes 18+2 µl Desferal istället för 20 µl Desferal direkt.
- Att det finns felberäkning av celler på bilderna från fluorescensmikroskopet.
- Mänskliga faktorer.
10
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Medicinsk tillämpning
N-Acetylcystein (NAC) motverkade inte mortalitet i jämförelse med celler som saknade denna
antioxidant. Detta kan tyda på att den mängd reaktiva syreradikaler som bildas faller inom
cellens naturliga motståndskraft mot oxidativ stress. Vid tillsats av väteperoxid så kan istället en
gynnsam antioxidativ effekt ses, samt lägre mortalitet, i jämförelse med prov där enbart
väteperoxid tillsattes. Fördelaktigheten hos antioxidanter är svår att bestämma, då vi inte vet den
mängd syreradikaler som bildas, men de skulle kunna vara gynnsamma i celler där ökat krav på
ATP-produktion finns; till exempel i muskelceller under arbete.
Det kan eventuellt ha positiv effekt att addera antioxidanter i de fall där den oxidativa stressen
överstiger cellens naturliga motståndskraft, då de verkar genom att oskadliggöra de fria radikaler
som cellen själv inte klarar av att neutralisera.
Järnkelerare gav en signifikant mindre mortalitet hos celler i jämförelse med det prov med
adderad väteperoxid. Intag av järnkelerare i syfte att motverka oxidativ stress kan inte
rekommenderas då den systemiska effekten inte är studerad. Järnkelerare används generellt vid
järnförgiftning där en stor extramängd av järn finns i blodomloppet. Intag av järnkelerare vid
normala järnnivåer skulle eventuellt kunna innebära kompetitiv effekt med transferrin vid
järninbindning, till den grad att järnet inte finns tillgängligt för bildandet av heme, vilket då
skulle kunna leda till anemi.
Referens: FASS 2013
11
Basgrupp 6
Läkarprogrammet, Termin 3
Linköpings universitet
Laborationsrapport
2014-02-12
Bilaga 1
Beräkningar
FeCl3
M
M
Desferrioxamin (Desferal)
M
M
NAC
M
M
12
