Laboration om cellskada och manipulering
av cellers känslighet för stress
Laborationen kommer att utföras av en basgrupp och pågå under fyra dagar. Två
personer ur basgruppen närvarar vid varje tillfälle och tar vid där den förra gruppen
slutade (”stafett”). Det är nödvändigt att hela basgruppen samlas innan
laborationen och planerar tillsammans (bearbeta de tre första sidorna)!
Bakgrund
Cellskador kan uppkomma t ex genom exponering för kemikalier, hetta, kyla, ischemi
eller strålning. Avgörande för vilka skador som uppkommer är förutom typ av stimuli
även duration och koncentration. Oxidativ stress orsakas av reaktiva syrederivat (t ex
syreradikaler och väteperoxid) och leder till oxidation av intracellulära komponenter.
Detta påverkar framförallt funktionen hos proteiner och lipider (bl a lipidperoxidering
av cellulära membran). Antioxidanter är viktiga molekyler som skyddar mot oxidativ
stress genom att hejda dessa reaktioner och återställa funktionen hos proteiner som
oxiderats. Ytterligare ett sätt att minska effekterna av reaktiva syrederivat är att hålla
koncentrationen av fria metalljoner såsom järn och koppar så låg som möjligt.
Laborationen
Laborationen är tänkt att illustrera cellers reaktion på oxidativ stress och vilka
möjligheter som finns för att manipulera deras känslighet. Vi kommer att använda
cellkulturer och skapa oxidativ stress genom att exponera dem för väteperoxid. För att
undersöka om känsligheten för oxidativ stress kan förändras kommer ni att kunna
behandla cellkulturerna med antioxidanter, extra järnjoner eller järnkelerare (ämnen
som binder järn och gör det icke-reaktivt).
Vid det första tillfället ska celler förbehandlas med de ämnen som eventuellt skulle
kunna påverka cellernas känslighet för oxidativ skada. Ni kommer också att
kvantifiera mängden apoptotiska och nekrotiska celler genom att morfologistudier.
Andra dagen kommer cellskada induceras genom att exponera cellerna för
väteperoxid och ni kommer att studera cellernas järninnehåll. Denna dag kommer
också prover frysas för att mäta cellernas ATP innehåll under den tredje laborationen.
Ytterligare en analys på de frysta proverna kommer att göras med avseende på
lipidperoxidering av den fjärde gruppen (se bild 1).
Planering
Basgruppen ska tillsammans planera upplägget av labben genom att diskutera fram en
försöksuppställning före första laborationstillfället. Förutsättningarna är följande:
Ni kan maximalt använda 10 cellodlingsskålar med olika behandlingar
Oxidativ stress:
Väteperoxid
Modulatorer:
Antioxidant (N-acetylcystein)
Järn joner
Järnkelerare (desferrioxamin)
Tänk på vilka kontroller som behövs för att kunna tolka resultaten.
Använd tabellen nedan!
Anm. Ingen av ”manipuleringsämnena” är toxiska i de koncentrationer som ska
användas. Väteperoxid måste därför användas i de prover där oxidativ stress ska
studeras.
Dag 1: Celler är utsådda från flaska till cellodlingsskål av labbhandledarna. Tillsats av antioxidant, järn och/eller järnkelerare.
modulerare/förbehandling och/eller järnkelerare)
Dag 2: Tillsats av väteperoxid.
Nedfrysning av
prover till ATP analys
Dag 3: Mätning av ATP. Tillsats av väteperoxid
ATP
Nedfrysning
av prover till
lipidperoxiderings
analys
Dag 4: Mätning av lipidperoxidering
på nedfrysta prover
MDA
Skål Antioxidant Järnkelerare Järn Väteperoxid
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Grupp 1: Behandling med modulatorer och studie av celldöd
Cellerna som används heter UT-SCC-77 och är en cellinje från humant skivepitel.
Cellerna odlas normalt på botten av cellodlingsflaskor men inför experimentet sås de
ut i mindre cellodlingsskålar (70 000 celler/ml) i 2 ml cellodlingsmedium. Cellerna
odlas i en inkubator (37 ˚C) med 5 % CO2.
Cellers känslighet för cellskada orsakad av oxidativ stress kan påverkas av olika
faktorer. Oxidativ stress uppstår då produktionen av fria radikaler är högre än cellens
förmåga att göra sig av med dem. Fria radikaler kan skada cellens alla komponenter,
inklusive proteiner, lipider och DNA. Metalljoner kan ge upphov till fria radikaler
genom den s.k. Fenton reaktionen, där en hydroxyl-radikal bildas då väteperoxid
reagerar med t.ex. reducerat järn.
H2O2 + Fe2+
HO· + OH- + Fe3+
Förekomsten av metalljoner i fri form kan leda till ökade nivåer av oxidativ stress. Nacetylcystein (NAC) bildas från aminosyran cystein. Tiolgruppen (-SH) medför att
NAC har antioxidantegenskaper och kan genom att donera en elektron stabilisera fria
radikaler. Desferal är en järnkelerare som används för att ta bort överflödigt järn.
1. Tillsats av modulatorer av oxidativ stress
Beräkna hur mycket av järn, desferal och/eller NAC som ska tillsättas till varje
cellodlingsskål, det är 2 ml medium i varje skål. Slutkoncentration finns i tabellen.
Modulator
Järn (FeCl3)
Desferal
N-acetylcystein (NAC)
Stamlösning
30 mM
100 mM
1M
Slutkoncentration
30 µM
1 mM
1 mM
Tillsätt järn, desferal och/eller NAC direkt till cellodlingsmediet i skålarna
enligt basgruppens försöksupplägg.
Markera på locket vilka skålar som behandlats med vad.
Ställ tillbaka cellerna i cellodlingsskåpet.
•
•
•
2. Kärnmorfologi vid apoptotisk celldöd
Handledarna har i förväg preparerat prover (för alla möjliga kombinationer av
modulatorer och oxidativ stress). Därefter har proverna fixerats och DAPI (4',6diamidino-2-fenylindol) som binder till A-T-rika områden i DNA, har adderats för att
färga kärnorna. Välj ut de prover som motsvarar era behandlingar och studera
kärnmorfologin i ett fluorescencemikroskop.
•
•
•
Beskriv skillnaden i morfologi mellan kontrollceller och celler behandlade
med oxidativ stress (apoptotiska).
Välj ut ett par representativa områden i provet och räkna totalantalet celler
och antalet apoptotiska celler.
Beräkna apoptosfrekvensen i provet i %.
3. Viabilitetstest – nekrotisk celldöd
Karakteristiskt för viabla celler är intakt plasmamembra. Om plasmamembranet är
skadat kan stora vattenlösliga molekyler (t.ex. trypanblått) tränga in i cellen från
utsidan och färga cellkärnan blå. Gör ett viabilitetstest av cellerna genom att tillsätta
trypanblått.
Lösningar
0,2 % trypanblå löst i PBS
PBS
Utförande
Ni kommer att få kontrollceller och celler som behandlats med väteperoxid i förväg.
Sug bort mediet med hjälp av vattensugen. Tillsätt 1,5 ml trypanblå-lösning och
inkubera ca 1 min. Sug bort trypanblålösningen och tvätta 2 gånger med 1,5 ml PBS.
Efter sista tvätten, lämna ca 1 ml PBS i odlingsskålen.
Mikroskopera cellerna i ett ljusmikroskop. Beskriv vad du ser.
Grupp 2: Exponera cellerna för väteperoxid och stuera
järninnehåll
Hämta cellodlingsskålarna från inkubatorn och kontrollera att de ser viabla ut i
mikroskopet (diskutera kännetecken på viabla celler).
1. Exponera celler för väteperoxid
Sug bort odlingsmediet med vattensugen. Tillsätt 1 ml av väteperoxidlösningen.
Ställ tillbaka cellerna i cellodlingsinkubatorn och inkubera 1 timme, 37oC.
Märk provrör och placera dem på is.
Sug bort odlingsmediet från alla skålar och tillsätt 500 µl 2.5% triklorättiksyra (TCA)
till varje cellodlingsskål för att lysera cellerna. Skrapa loss de lyserade cellerna med
cellskrapan och pipettera över lösningen till provrör.
Frys proverna till nästa grupp!
2. Kvantifiering av cellernas järninnehåll
Handledarna har i förväg preparerat prover (för alla möjliga kombinationer av
modulatorer och oxidativ stress). Därefter har proverna fixerats och cellens innehåll
av järn blåfärgas medan kärnor rödfärgas. Välj ut de prover som motsvarar era
behandlingar och studera cellernas järninnehåll i ett ljusmikroskop.
•
•
Beskriv skillnaden i järninnehåll mellan kontrollceller och celler behandlade
med oxidativ stress. Välj ut ett par representativa områden i provet och
bedöm cellernas järninnehåll.
Beräkna frekvens ”blå” celler i provet i %.
Grupp 3: ATP analys med hjälp av chemiluminiscence
Laborationen visar förändringar av mitokondriens funktion vid cellskada.
Mitokondriens elektrontransportkedja skapar en protongradient över mitokondriemembranet och potentialskillnaden används för att syntetisera ATP. Vid cellskada,
(t.ex. oxidation av lipider eller protein i mitokondriemembranet) påverkas
mitokondriens förmåga att behålla protongradienten och därmed påverkas också
cellernas ATP nivå.
ATP nivån analyseras genom att studera reaktionen då D-luciferin omvandlas till
oxyluciferin, en luciferas katalyserad reaktion. Vid denna reaktion omvandlas ATP till
AMP och överskottsenergin avges som ljus (λ=562 nm). Antalet emitterade fotoner är
direkt proportionellt till mängden ATP molekyler som använts.
Luciferase
D-Luciferin + ATP + O2
Oxyluciferin + PPi + AMP + CO2 + Ljus
1. ATP mätning
Pipettera 780 µl Tris-EDTA buffert i mätrör (engångsrör med platt botten), lika
många som antalet prov.
Tillsatt 200 µl ATP reagens till 4 rör i taget.
I nästa steg justeras apparaten för bakgrunds luminiscens: Vortexa ett rör och mät
bakgrund genom att sätta röret i luminometern och tryck på BKGR och håll inne tills
displayen är nollställd.
Ta ett av rören och tillsätt 20 µl prov. Vortexa och sätt tillbaka provet. Tryck på
START. Anteckna värdet (Iprov).
Ta ut röret och tillsätt 10 µl ATP standard (motsvarar 1 x 10-7 M ATP). Vortexa och
sätt tillbaka röret. Tryck på START och anteckna värdet (Iprov+ std).
Fortsätt med nästa prov enligt ovan.
Beräkna mängden ATP i provet med hjälp av följande formel:
ATPprov = 10-7 x Iprov/ (Iprov+std – Iprov)
2. Exponera celler för väteperoxid
Sug bort odlingsmediet med vattensugen. Tillsätt 1 ml av väteperoxidlösningen.
Ställ tillbaka cellerna i cellodlingsinkubatorn och inkubera 1 timme, 37oC.
Märk eppendorfrör.
Pipettera över PBS/väteperoxid lösningen från cellerna till eppendorfröret.
Lysera cellerna genom att tillsätta 200 µL H2O, skrapa loss cellerna från
cellodlingsskålen med hjälp av en cellskrapa och överför dem till eppendorfröret.
Proverna fryses (-70oC) till analys vid fjärde laborationstillfället.
Grupp 4: Mätning av lipidperoxidering
Oxidering av fosfolipider i cellens membran genererar aldehyder, som till exempel
malondialdehyd (MDA) och 4-hydroxyalkenaler (HAE). LPO-586 kitet mäter
förekomsten av dessa aldehyder och detta värde kan användas som en indikation på
lipidperoxidering och därmed graden av oxidativ skada i cellerna.
Metoden baseras på att N-methyl-2-phenylindole (R1) reagerar med MDA och HAE.
En molekyl av MDA eller HAE reagerar med två molekyler R1 och bildar ett stabilt
kromoforkomplex som kan mätas spektrofotometriskt vid våglängd 586 nm. Värdet
avläses sedan mot en standardkurva.
Utförande
Tina proverna.
Standardkurvan:
•
Tillsätt 2 µl MDA-standard till 1 ml H2O.
•
Använd den utspädda standarden till proverna i standardkurvan enligt
nedanstående tabell.
Koncentration (µM)
0
0.5
1
2
3
4
MDA-standard (µl)
0
25
50
100
150
200
Vatten (µl)
200
175
150
100
50
0
•
Pipettera 100µl av varje tinat prov till ett nytt eppendorfrör.
•
Späd 4,5 ml reagens R1 med 1,5 ml ”diluent”.
•
Tillsätt 325 µl R1 till varje prov, även standardkurvan. Blanda genom att
vortexa.
•
Tillsätt 75 µl R2 reagens och vortexa.
•
Inkubera alla rören i 45°C i 60 min.
•
Centrifugera proverna för att få en klar supernatant (15000 x g, 10 min)
•
Överför 150 µl av supernatanten till 96-hålsplatta. Gör dubbelprover.
•
Mät absorbansen vid 586 nm.
Beräkna koncentrationen av MDA/HAE i proverna utifrån standardkurvan.
