Ger thioredoxinreduktas ett ökat skydd mot oxidativa skador?
Karin Anestål
Thioredoxin reduktas (TrxR) är ett selenprotein, det vill säga en av dess byggstenar är selen. Enzymet
utgör ett viktigt skydd mot så kallad oxidativ stress i cellen samt mot cellulära skador från reaktiva
syreradikaler, såsom väteperoxid. Flera cellfunktioner kräver ett visst mått av oxidativ stress, men blir den
oxidativ stressen för hög leder det i stället i hög utsträckning till att cellen drabbas av ej reparerbara
skador och till slut dör. En viktig funktion hos thioredoxinreduktas är därför att upprätthålla en lämplig
nivå på den oxidativa stressen i cellen. I detta projekt ville jag till att börja med undesöka om
thioredoxinreduktas skyddade celler mot apoptotisk död, dvs programmerad, självbestämd celldöd, eller
nekrotisk död, dvs celldöd genom olycka.
Cellinjen FLTR hade en extra gen för TrxR (kallad FLTR) och uttryckte därigenom mer än normala
mängder av detta enzym. Samma cellinje utan extra gen för TrxR (MOCK), med normala TrxR-nivåer,
användes som kontroll. För att skapa oxidativ stress i cellerna behandlades de med A23187, ett ämne som
ökar kalciumttransporten in i och ut ur cellen. Efter 14 timmars behandling med A23187 räknades antalet
levande och döda celler. Fraktionen levande celler var högre i FLTR-populationerna än i MOCKpopulationerna, vilket tyder på att FLTR-cellerna är bättre skyddade mot oxidativ stress. En möjlig och
högst rimlig förklaring till detta ökade skydd är den större mängden TrxR. Hur TrxR bidrar till den ökade
motståndskraften mot oxidativ stress var därför nästa fråga att försöka besvara. Eftersom TrxR är ett
selenprotein kan mängden i cellerna och i deras närliggande omgivning (d v s i detta fall tillväxtmediet)
lätt studeras genom att man använder radioaktivt märkt selen. Cellerna odlades 12 t i medium med
radioaktivt selen före tillsatsen av A23187. Efter ett antal timmars behandling med A23187 isolerades
proteiner såväl från cellerna som från det medium de växt i. Proteinerna analyserades med hjälp av en
polyakrylamidgel, som separerar proteiner från varandra med avseende på molekylvikt. Därefter utfördes
autoradiografi d v s gelen lades på en skärm som registerar radioaktivt sönderfall och därigenom
synliggör proteiner som tagit upp raddioaktivt selen. Vid utvärdering av autoradiografin visade sig FLTRoch MOCK-celler ha ungefär samma nivåer av TrxR, inte heller A23187-behandling resulterade i mätbara
skillnader. Mediet från FLTR cellerna innahöll höga nivåer av selenprotein, medan inga spår av
selenprotein fanns i mediet från MOCK-cellerna. De utsöndrade selenproteinerna skilde sig i storlek från
de intracellulära selenproteinerna. Även om det inte definitivt har fastslagit att de olika banden
representerar olika former av TrxR verkar det högst troligt eftersom det är så stora skillnader mellan
MOCK- och FLTR-celler. Med största sannolikhet är detta också förklaringen till cellernas ökade tolerans
mot oxidativ stress. Kvar finns dock frågan hur TrxR i mediet bidrar till ett ökat skydd mot oxidativ
stress.
Fig 1. Utsöndrade proteiner från FLTR och MOCK celler. a, Proteiner utsöndrade från celler till medium. Kolumn 1,
storleksmarkör; Kolumn 2-6, utsöndrade proteiner från FLTR-celler efter 0, 4, och 8 timmars med och utan A23187; kolumn 7,
TrxR storleksmarkör, av samma storlek som inuti cellen; kolumn 8-10, utsöndrade proteiner från MOCK-celler. b, Autoradiografi
av bild a, visar radioaktiva selenproteiner i FLTR-celler (kolumn 1-5), i MOCK-celler (kolumn 7-9) samt TrxR storleksmarkör
(kolumn 6).
Examensarbete i biologi, 20p Vt 2001, Uppsala Universitet
Institutionen för medicinsk biokemi och biofysik, Karolinska Institutet
Handledare: Elias Arnér, Anna-Klara Rundlöf
