Intracellulär FACS-inmärkning kan kombineras med qPCR-analys av god
kvalitet och hög sensitivitet
Examensarbete, Läkarprogrammet 2015
Mikael Sandstedt1 (författare), Marianne Jonsson1, Julia Asp1, Göran Dellgren2, Anders Lindahl1, Anders Jeppsson2, Joakim Sandstedt1 (handledare)
Avdelningen för Klinisk Kemi och Transfusionsmedicin, Biomedicinska Institutionen, Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet
Avdelningen för Molekylär och Klinisk Medicin, Institutionen för Medicin, Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet och
Avdelningen för Hjärt- och Thoraxkirurgi, Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Göteborg
1
2
Vi exponeras dagligen för medierapportering avseende nya forskningsrön - alltifrån stamceller som kan bota
hjärtsvikt till nya potentiella läkemedel för Alzheimers sjukdom. Medan resultaten kan te sig tydliga beror
dock tillförlitligheten för all vetenskaplig litteratur på studiers tillvägagångssätt. En grundförutsättning för
att kunna bedriva vetenskaplig forskning är användandet av analysmetoder som inte riskerar att introducera
missledande slutsatser då man tolkar data.
Stamcellsforskning är ett exempel på ett forskningsfält där metoden är helt avgörande för slutsatserna - en
anledning till detta är att stamceller inte sällan utgör endast 1% av samtliga celler i en vuxen människas organ.
Behovet av känsliga analysmetoder är därför stort - samtidigt som de även måste vara tillförlitliga och mäta
det som är av intresse. Två analysmetoder som använts i stamcellsforskning är FACS-analys och realtids-PCR.
Dessa metoder används för att granska cellers protein- respektive genuttryck. FACS-analys har flera fördelar,
bl.a. då proteiner är de byggstenar som ger cellen dess egenskaper samt då man kan sortera ut intressanta
celler till vidare analys. Genom att analysera proteiner på insidan av cellen kan man t.ex. konstatera om en
viss stamcell skulle kunna ge upphov till hjärtmuskelceller - något som är viktigt för att kunna reparera ett
skadat hjärta. Realtids-PCR är å andra sidan en mycket känslig metod som ger tillförlitliga resultat. Genom
att kombinera metoderna kan man dra nytta av analysernas styrkor för att förbättra karakteriseringen av
stamceller.
I nuläget är det dock oklart huruvida det går att kombinera analys av proteiner inuti cellen med
genexpressionsanalys. Eventuellt skulle den inmärkningsprocedur som sker inför proteinanalys kunna
exponera cellens s.k. mRNA för skadliga enzymer - något som skulle kunna omöjliggöra realtids-PCR, då
denna metod analyserar just mRNA.
Vi använde olika typer av celler för att undersöka effekten av inmärkningsproceduren inför FACS-analys.
Celler sorterades ut vid FACS-analysen till realtids-PCR. Såväl realtids-PCR-analysens känslighet som
kvalitet bedömdes. Parallellt med detta analyserades RNA med s.k. RQI-analys, som ger ett mått på graden av
RNA-nedbrytning. Vi undersökte även huruvida det går att spara cellprover inför FACS-analys i 12 timmar.
Våra resultat visade att man kan märka in och analysera proteiner inuti celler, följt av realtids-PCR-analys
på sorterade celler. Vid analys av ett blandat cellprov gav analys av genexpression förväntade resultat. En
viktig slutsats är att en del i inmärkningen - s.k. permiabilisering - orsakar en måttlig sänkning av realtidsPCR-analysens känslighet och kvalitet. Detta berodde sannolikt på ökad RNA-nedbrytning, vilket påvisades
genom RQI-analysen. Detta skulle kunna leda till att vissa geners uttryck skulle underskattas. Dessutom skulle
jämförelse av prover behandlade på olika vis kunna misstolkas. Slutligen kunde cellprover sparas i 12 timmar
utan någon sänkning av realtids-PCR-analysens känslighet eller kvalitet.
Sammanfattningsvis kan analys för proteiner inuti cellen kombineras med genexpressionsanalys. Detta är av
stort värde, inte minst inom stamcellsforskningen, där känsliga och tillförlitliga metoder behövs. Förvaring
av cellprover inför analys gör kombinationen ytterligare användbar, då analysen kan ske mer flexibelt. Vår
förhoppning är att dessa resultat skall bidra till att analysmetoderna kan användas på ett optimalt och korrekt
vis för att ytterligare förbättra karakteriseringen av t.ex. stamcellspopulationer.
