Biomedicinsk analytiker program 10p
INTRACELLULAR DISTRIBUTION PATTERNS OF
ORGANELL SPECIFIC PROTEINS USING
IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING OF TISSUE MICRO
ARRAYS
Dijana Cerjan
Institutionen för genetik och patologi
Rudbeck laboratoriet, Uppsala
Handledare:
Kenneth Wester
Linda Paavilainen
ABSTRACT
The knowledge of the human genome sequence, as revealed in the HUGO project,
has created exciting new possibilities for biomedical research. The Swedish
Human Proteome Resource (HPR) program aims to make use of this information
to gain further insight into the human proteome. Recombinant proteins are
generated from coding sequences identified from the human genome sequence
and used to produce specific antibodies to target proteins. Antibodies are
subsequently utilized for functional analysis of the corresponding proteins using
tissue micro arrays. The aim of my project was to investigate the possibility of
distinguishing characteristic distribution patterns of intracellular proteins in the
resolution capacity offered by light microscopy. A map of representative
distribution patterns was created using immunohistological staining with
commercially available antibodies toward well-characterised proteins in the cell.
Such a map could then aid in interpreting the results of immunohistological
staining of intracellular proteins using antibodies produced within the Human
Proteome Resource program. Proteins manifested in nucleus, nuclear membrane
and plasma membrane were clearly visible at the expected location. Proteins
manifested in different organelles in the cytoplasm however, showed all a similar
staining pattern, making determination of exact protein location uncertain. A
possible explanation is the resolution of the light microscope not being sufficient
to visualize certain proteins specific to organelles in the cytoplasm. Results may
also have been influenced by the choice of secondary antibody, where the
strenghtened signal generated by an enzyme labelled polymer may have a
negative effect on depiction of details in the image generated.
Key words: proteomic, TMA, Immunohistokemistry, Bright field microscopy,
intracellular
2
The Swedish Human Proteom Resource (HPR) är ett projekt vars grundprincip
byggdes på ett pilotprojekt som utfördes av en grupp forskare från Institutionen
för bioteknologi- Kunglig Teknisk Högskola (KTH) Stockholm. Målet med
pilotprojektet var en kartläggning av alla proteiner som kodas av gener som finns
på kromosom 21 (1).
HPR-projektet syftar till att utifrån HUGO- projektet beskriva funktionaliteten hos
alla humana gener. Genom att utnyttja den genetiska informationen framställs
antikroppar mot människans proteiner, som sedan studeras med avseende på
lokalisation och distributionmönster i vävnadspreparat. Detta görs på
egentillverkade Tissue Micro Arrays (TMA).
Mitt arbete gick ut på att immunhistokemiskt färga vävnadspreparat med
kommersiellt tillgängliga antikroppar riktade mot avseende distributionsmönster
välkarakteriserade proteiner i cellkärna och cellorganeller. På så sätt skapades en
provkarta av olika intracellulära distributionsmönster som sedan utverderades vid
den upplösning som ljusfältmikroskopi erbjuder. Provkartan kan senare vara till
hjälp vid tolkning av de immunohistokemiska färgningsresultat som erhålls med i
HPR- projektet framställda antikroppar med okänt mönster. Metoder som
användes i projektet var: snittning, immunohistofärgning, mikroskopering och
bildanalys.
3
Schematiskt går kartläggningen av humana proteiner till så här: Till att börja med
identifieras lämpliga gensekvenser i HUGO databaser, sådana som är unika för
varje protein. Mycket av svårigheterna ligger i att tillverka en korrekt
proteinstruktur. Finessen är att identifiera ett särdrag hos ett protein, dvs att hitta
en representativ del av proteinet, som är unik i jämförelse med alla andra proteiner
i kroppen. Varje vald gensekvens kodar för 100-150 aminosyror och kommer att
utgöra en så kallad PrEST (Protein Epitope Signature Tag). Proteinstrukturen
framställs sedan på konstgjord väg med rekombinant teknologi. Sedan användes
proteinstrukturen som immunogen för att framställa antikroppar i biologiskt
material (kaniner). Antikroppar renades fram genom en annan avancerad teknik
som kallas affinitetsrening där PrEST: ar användes för att selektivt rena fram
monospecifika polyklonala antikroppar. Antikropparna användes i
immunhistokemisk färgning av vävnadsprover från olika delar av
människokroppen. Antikropparna binder endast till en specifik del av ett protein.
Med hjälp av en enzymatisk reaktion uppstår då en färgning som är synlig i
ljusfältmikroskop vilken bekräftar proteinets lokalisation i vävnaden och cellen.
Detta bidrar till det pussel som måste läggas för att få fram kunskap om hur
kroppen fungerar på molekylär nivå vid friska och sjuka tillstånd (2).
Människan har ca 23000 gener. Många av dem har ingen känd funktion. Gener
kodar för olika proteiner som tillverkas i cellen. Proteiner utför många olika
uppgifter i kroppen. Transportproteiner möjliggör transport av ämnen i blodet
och cellerna. Vissa proteiner sitter på cellmembranet och förmedlar kontakten in i
cellen. De kallas receptorproteiner och har förmåga att binda till ett speciellt
4
ämne. Strukturproteiner är de proteiner som ger struktur åt olika vävnadstyper
samt ingår i cellskelettet. Kontraktila proteiner spelar stor roll vid celldelning
och vid muskelsammandragningar. Enzymer är proteiner som är verksamma som
katalysatorer för kemiska reaktioner. Vid olika infektioner eller förekomst av
främmande ämnen försvarar kroppen sig med hjälp av försvarsproteiner.
Hormoner och transkriptionsfaktorer reglerar avläsning av gener och
tillväxtfaktorer och kallas därför reglerande proteiner.
Det finns mer än 200 celltyper i människokroppen. Deras utseende är anpassat
efter funktion. Alla celler har samma intracellulära organeller vilka kan
klassificeras i två grupper: membranösa organeller som är avgränsade från
cytosolen med plasmamembran och icke membranösa organeller utan
plasmamembran.
I eukaryota celler är cellkärnan en membranavgränsad organell som innehåller
genetisk information. I kärnan finns kromatin som innehåller DNA, histoner och
olika kärnproteiner. Förutom kromatinet finns nukleoler, små områden inuti
kärnan, som innehåller RNA och proteiner. Nukleoler är de ställen där ribosomalt
RNA syntetiseras. Membranen som avgränsar kärnan består av inre och yttre
membran. Inre membranet innehåller specifika laminreceptorer och några
laminaassocierade proteinreceptorer. Yttre membranet övergår till kornigt
endoplasmatiskt retikulum. Endoplasmatisk retikulum (ER) är ett membranöst
nätverk som hänger ihop med kärnhöljet. ER består av kornigt ER (rER) som
innehåller ribosomer och glatt ER (sER) utan ribosomer. ER finns i varje cell,
5
men de celler som syntetiserar och utsöndrar proteiner har mer ER. Exempel på
sådana celler är fibroblaster, plasmaceller, odontoblaster och osteoblaster. Celler
som producerar mucin karakteriseras av välutvecklad rER, vilket ses
immunohistokemiskt som starkt färgad cytoplasma. Mucinsekretoriska celler är
en del av ytepitelet. De kan bli aggregerade i speciella körtlar i genitaltrakten,
respiratoriska och intestinala trakten.
Glatt ER är involverad i lipid- och steroidmetabolism, glykogenmetabolism,
syntes av membranlipider och lagring av kalcium. Glatt ER finns därför lite
rikligare i lever, adrenocorticala celler, Leydig celler i testis, samt
skelettmuskelceller och glatta muskelceller. De nysyntetiserade proteiner går från
sER vidare till Golgi komplexet som består av antal membransäckar. I
Golgikomplexet modifieras, sorters och packas proteiner och membranlipider från
ER för intra- och extracellulär transport. Golgikomplexet förekommer i större
utsträckning i sekretoriska celler exempelvis plasmaceller och osteoblaster. Celler
som syntetiserar stora mängder av membran och membranassocierade proteiner,
exempelvis nervceller har också mer Golgikomplex (3). Mitokondrier är
cylinderformade organeller som består av dubbelmembran och matrix.
Dubbelmembranen är uppbyggd av yttre och inre membran samt intermembranärt
utrymme. Mitokondrier har flera viktiga funktioner som cellandning, ATP syntes,
citronsyracykeln och nedbrytning av fettsyror. Mitokondrier förekommer i alla
celler utom i röda blodkroppar och terminala keratinocyter. Eftersom ATP
syntetiseras i mitokondrier förekommer de mer i de celler som har stor behov av
energi som tvärstrimmiga muskelceller. Även i de celler som är involverade i
6
vätske- och elektrolyttransport förekommer mitokondrier i stor utsträckning,
exempelvis i proximala tubuli (4).
Alla de hittills nämnda organellerna är avgränsade med plasmamembran. Det
finns dessutom ickemembranösa organeller. En av dem är mikrotubuli.
Mikrotubuli består av proteinet tubulin och har funktioner som att bestämma
cellform, transportera organeller inom cellen, vid celldelning, rörelse av cilier och
flageller. Tillsammans med aktin och intermediära filament ingår mikrotubuli i
cellskelettet. Intermediära filament är flätliknande fiber som innehåller flera
proteingrupper. Dessa proteiner är vävnadsspecifika med undantag av lamin.
MATERIAL OCH METOD
Tissue Micro Array- TMA
Framställs vanligen från formalinfixerat paraffininbäddat vävnadsmaterial. Små
stansar tas från ett representativt område i respektive vävnadsprov och sätts in i ett
nytt mottagarblock. Upp till 300 på varandra följande snitt kan snittas från varje
block och undersökas på DNA, RNA eller protein nivå (5). Den mest
förekommande användningen av TMA- tekniken är vid detektion av
proteinantigen med hjälp av immunohistokemi. Det finns flera fördelar med detta.
En av dessa är möjligheten att analysera ett stort spektrum av olika vävnadstyper i
ett och samma vävnadssnitt. TMA med normal vävnad, tumörer eller cell- linjer
kan produceras för testning och optimering av förbehandlingen,
antikroppsspädning och detektionssystem. Kontrollvävnad kan placeras i samma
′array′. Detta försäkrar specificitet och sensitivitet av immunohistokemin.
7
Reproducerbarheten av färgningen och tillförlitligheten av tolkningen blir
förbättrad när alla vävnader behandlas samtidigt och på exakt samma sätt. Det är
möjligt att jämföra olika antikroppsfärgningar mot samma antigen på histologiskt
identiska vävnadsregioner (6). Resultatbedömning och analys av TMA- snitt kan
utföras i vanligt ljusfältsmikroskop.
För framställning av respektive TMA block krävs 48 paraffininbäddade prover
vilka erhöllits från en klinisk biobank. Från varje vävnadstyp valdes tre
individuella prover för att erhölla en variation i ålder och om möjligt även kön.
Med hjälp av ett automatiserat instrument (ATA 100, Beecher Instruments),
tillverkades vävnadsarrayerna. Med hjälp av instrumentet plockades en
millimeterstor stans från varje vävnadsprov och placerades 72 sådana i ett nytt
paraffinblock enligt ett schema som programmerats in i förväg. Trippletter av 48
olika vävnadstyper rymdes i två nya block.
Paraffinsnittning
Snitten till vävnadsarrayerna erhålls med mikrotom (Microtom-cool cut, Leica).
De överfördes sedan till objektglasen (Super frost®Plus Menzel GmbH & Co). På
varje glas fanns tre prover av varje vävnad, sammanlagt 144 stycken. Därefter
inkuberades de vid 42°C över natt och avparaffinerades.
Avparaffinering av glasen gjordes i xylen (HistoLab) 2×5 minuter, sedan följde
rehydrering i absolut alkohol 2×5 minuter, 95 % alkohol 2×5min, 80 % alkohol 5
8
minuter och därefter 5 minuter i 0,3 % H2O2+70 % alkohol. Slutligen sköljdes
glasen och placerades i en kyvett med Target Retrieval Solution-TRS, (Dako).
Immunohistokemi
För detektion av antigen i vävnad används antingen polyklonala eller
monoklonala antikroppar. De monoklonala har högre specificitet eftersom de
produceras av en plasmacells klon. Därför är de immunhistokemiskt identiska och
reagerar med en specifik epitop på antigenet mot vilken de är riktade.
Monoklonala antikroppar är mer användbara pga. deras höga homogenitet,
frånvaron av ospecifika antikroppar, inga variationer mellan olika ′batcher′.
Polyklonala antikroppar produceras av flera celler och reagerar med olika epitoper
på det antigen mot vilka de är riktade.
Det finns några nackdelar med monoklonala antikroppar. De är mer beroende
av pH och rätt spädning jämfört med polyklonala antikroppar. Ibland klarar de
inte formalinfixering. Reaktiviteten av epitopen kan försämras efter fixeringen
vilket gör att ′antigen retrieval ′krävs. Varje antigen innehåller en eller flera
epitoper som består av fem eller flera aminosyror. Aminosyror är kopplade till
varandra och arrangerade tredimensionellt som resultat av intermolekylär
veckning. Under formalinfixeringen kan epitopstrukturen förändras. Detta
resulterar i delvis eller hel förlust av immunoreaktiviteten. För att återskapa
immunoreaktiviteten används flera metoder, exempelvis proteasbaserad eller
värmebaserad.
9
Vi använde värmeinducerad antigen retrieval i fuktig miljö och närvaro av
saltlösningar, i detta fall citrat buffert, pH 6. Uppvärmningen till 125°C i ca 40
minuter gjordes i tryckkokare (Biocare Medical) enligt tillverkarens instruktion.
Efter värmebehandlingen kyldes glasen under rinnande vatten och placerades i
tvättbuffert med tillsatts av 0,1 % Tween20 (Dako). Under tiden förbereddes
instrumentet, Autostainer (DakoCytomation) som användes vid den
immunhistokemiska färgningen. Det är ett automatiserat instrument med vilket det
går att färga 48 objektglas samtidigt. Principen för färgningen som gjordes på snitt
var följande: Vävnadssnitten inkuberades först med primära mus eller kanin
antikroppar (tabell 1) i 30 minuter i rumstemperatur varefter de sköljdes i
tvättbuffert. Sedan tillsattes enzymmärkt get anti mus/kanin dextran polymer,
(EnVision, Dako) och efter 30 minuter inkubering i rumstemperatur sköljdes
snitten åter. Polymeren var märkt med HRP (horseradish peroxidase) vars
aktivitet resulterade i en olöslig produkt. Som kromogen-substrat användes
diaminobenzidin (ChemMate DAB, Dako) som spädes 1:50 (kromogen: substrat).
Slutligen sköljdes proverna och glasen placerades i destillerat vatten. Motfärgning
gjordes i Harris hematoxylin i 6 minuter. Efter sköljning i kranvatten avlägsnades
överflodig färg bort genom att glasen doppades i saltsur sprit ca 20 sekunder.
Färgen oxiderades i kranvatten ca10 minuter. Slutligen dehydrerades snitten i
stigande alkoholskala och xylen. Täckglas monterades med xylenbaserat
monteringsmedel (Pertex).
10
Visualisering och utvärdering av immunhistokemiskt färgningsresultat med den
utvalda antikroppspanelen gjordes i ljusfältmikroskopet (BH-2, Olympus) med
objektiven X4, X10, X20 och X40.
RESULTAT
Resultatet redovisas i Tabell 2 och bildcollage (fig 1-4).
DISKUSSION
För att göra en provkarta över den intracellulära distributionen av olika proteiner
användes 14 olika antikroppar vilka testades på 48 olika vävnadstyper.
Antikropparna var samtliga välkarakteriserade och riktade mot proteiner uttryckta
i olika cellorganeller.
Syftet var att se hur detaljerat det går att studera proteiners intracellulära
distribution via immunhistokemiska färgningsmönster och ljusfältmikroskop.
Fibrillarin är ett protein som skall finnas i nukleoler i alla friska celler (7). Efter
den immunhistokemiska färgningen kunde man se att antikroppen bundit specifikt
till nukleoler i cellkärnan. Proteinet emerin ingår i alla cellers kärnmembran (8).
Detta bekräftades efter att antikroppen riktad mot emerin visade ett tydlig
perinukläert mönstret. De proteiner som lokaliseras till olika organeller i
cytoplasman var däremot inte lika enkla att särskilja sinsemellan.
Färgningsmönstret som erhöllits med antikroppar riktade mot Golgikomplexet
liknade det som erhålls med antikropp riktade mot endoplasmatisk retikulum. I
båda fall var det cytoplasmatisk och granulär färgning som inte gick att härleda
11
till respektive organell. De tre mitokondriella markörerna uppvisade samtliga
färgning av cytoplasman spridda i små granula som varierade i storlek och antal
beroende på celltyp. Alla de proteiner som ingår i cytoskelettet visade samma
distributionsmönster. Färgningen var cytoplasmatisk och homogen, men inte på
något sätt specifik för de olika cytoskeletala proteinerna. Det fanns en tendens till
ihopklumpning hos alla antikropparna i denna grupp. Upplösningen i
ljusmikroskop räckte inte till för att se skillnader i distributionsmönster. Ecadherin visade däremot en tydlig membranös utbredning. Detta protein ingår i
plasmamembranet i alla celler av epitelialt ursprung (10). I just de celltyperna
observerdes en distinkt, membranös färgning som ibland var okontinuerlig.
Skillnader i intensiteten mellan de tre prover från samma vävnadstyp kunde bero
på att proverna var från tre olika individer. Visserligen var det normal vävnad men
man vet ingenting om medicinering och eventuella behandlingar som dessa
personer har genomgått. Som tidigare nämnts, fanns det en spridning i ålder och
kön mellan proverna. Också detta är faktorer som kan ha påverkat
färgningsintensiteten.
Att ett tydligt färgningsmönster inte alltid med säkerhet kunde särskilja kan bero
på det detektionssystem som användes. Vi använde en enzymmärkt polymer,
EnVision, som förstärker signalen från den bundna antikroppen (11). Det är ett
system där en peroxidasmärkt dextran polymer är konjugerad med ensekundär
antikropp mot kanin eller mus. Den starka signalen från varje antikropp-protein
interaktion kan ha en negativ effekt på detaljrikedomen i bilden. Alternativet är att
använda direkt eller indirekt immunhistokemisk färgning men detektions
12
känslighet är inte tillräckligt hög då. Även den ljusmikroskopupplösningen var
otillräcklig för att särskilja den cytoplasmatiska utbredningen i de olika
organellerna. Man vet inte tillräckligt om distributionen av dessa organeller. Den
kanske är likartad och då går det inte att se några skilnader oavsett metod.j
Alternativet är att använda andra verktyg med högre upplösningsförmåga
exempelvis elektronmikroskop.
REFERENSER
(1) Agaton, C. et al. Affinity proteomics for systematic protein profiling of
chromosome 21 gene products in human tissues, 2003, Molecular & Cellular
Proteomics 2, 405-414
(2) Uhlen M. and Pontén F. Antibody-based proteomics for human tissue
profiling, 2005, Molecular and Cellular proteomics 4
(3) Michael H. Ross m.fl. Histology with Cell and Molecular Biology, 3:40, 40-45
(4) Stevens Lowe, Human Histology, 3:40
(5) Olli-P. Kallioniemi, Urs Wagner et al. TMA teknology for high-throughput
molecular profiling of cancer, Human Molecular Genetics, 2001, vol.10, No7,
657-662
(6) Holger Moch, Juha Kononen et al. TMA-What will they bring to molecular
and anatomic Pathology, 2001, Advances in Anatomic Pathology, Vol. 8, No. 1,
14-20
13
(7) Ochs RL et al. Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by
autoimmune sera, (1985), Biol Cell 54: 123-33
( 8) James M. Holaska, Amy K. Kowalski, Katherine L. Wilsom, Emerin caps the
pointed end of actin filaments: Evidence for actin cortical network at the nuclear
inner membrane, (2004) PloS Biology 2:9
(9) Bloom GS & Brashear TA, A novel 58-kDa protein associates with the Golgi
apparatus and microtubules, (1989), J Biol Chem 264:16083-92
(10) Marrs J. A. And Nelson W. J. , Cadherin cell adhesion molecules in
differentiation and embryogenesis, (1996), International Review of Cytology 165:
159-205
(11) Handbook, DAKO Corporation, Immunochemical Staining Methods, (2001),
3:29-31
Figur 1-4
14
15
16
17
18
DISTRIBUTÖR
FÖRBEHANDLING
SPÄDNING
KLON
ANTIKROPP
ORGANELL
Tabell 1
ÖVRIG INFORMATION
cellkärna
fibrillarin
38F3
1:35
TRS pH6 GeneTex
Fibrillarin är beskrivet som ett nukleolärt protein
emerin
FL-254
1:2000
TRS pH6 St.Cruz
Emerin är ett protein från nuklearlaminaassocierade proteinfamilj. Det förekommer i
nuklearmembran i alla friska celler. Mutation på genen som kodar för emerin resulterar i
sjukdomen Emery-Dreyfuss muscular dystrophy(EDMD).
endoplasmatisk calreticulin
retikulum
poly
1:300
TRS pH6 GeneTex
Calreticulin är ett chaperon som har många cellulära funktioner. Det är ett kalciumbindande
protein. Proteinet är viktig för reglering av genuttryck, celladhesion och autoimmunitet.
Calreticulin är lokaliserad i cytoplasmatisk granula i de cytotoxiska T-celler, lymfocyter,
vesikler i testis.
golgi komplex
58K-9
1:1500
TRS pH6 GeneTex
Golgi protein är en bra markör för golgi komplex. Antikroppen binder till det ställe där
mikrotubuli binder till den yttre, cytoplasmatiska sidan av golgi komplex.
mitochondria mono
1:100
TRS pH6 Chemicon
mitochondria MTCO2
1:500
TRS pH6 GeneTex
golgi protein
mitokondrie
mitokondriaantikropp används som mitokondriel markör i cell- och vävnadspreparaten.
prohibitin
poly
1:300
TRS pH6 GeneTex
Prohibitin används som mitokondriel markör. Det är ett protein som finns på inre
mitokondriemembran. Proteinet visar antiproliferativt aktivitet samt spelar stor roll i reglering
av normala cellcyklar, imortalisering av celler och tumör supression. I visa celltyper kan
prohibitin ses även i nukleus.
peroxisomer
catalas
poly
1:16000
TRS pH6 GeneTex
Catalas är ett protein som finns mest i peroxisomer och därför används oftast som markör
för peroxisomer.
cytoskelett
tubulin
DM1A+DM1B 1:400
TRS pH6 GeneTex
Tubulinantikropp är en koktel av två monoklonala antikroppar med hög specificitet för
proteinet tubulin och visar ingen korsreaktion med andra cytoskelettproteiner.
vimentin
3B4
1:400
TRS pH6 DakoCytomation
Vimentin är ett protein från grupp III intermediära filament. Proteinet finns i olika
ickeepiteliala celltyper, specielt i mesenkimala celler. Vimentin finns uttryckt i många
hormonberoende cancercell-linje.
desmin
DE-R-11
1:50
TRS pH6 DakoCytomation
Desmin tillhör grupp III intermediära filamentproteiner som är en del av cytoskelettet.
Desmin bygger cytoskelettal nätverk genom muskelfibrer. I normal vävnad binder
antikroppen mot desmin till skelett och glatta muskelceller i blodkärl och i intestinal
området. Även glatta muskelceller i uterus samt mesoteliala celler färgas med antidesmin.
När det gäller sjukvävnad binder antikroppen till rhabdomyosarcoma.
aktin
1A4
1:200
TRS pH6 DakoCytomation
Aktin är kroppens vanligaste protein. Antikroppen mot aktin reagerar med glatta
muskelceller i blodkärl, myoepiteliala celler, visa stromaceller i intestinal trakt, testis, bröst
och ovarier.
20
cellmembran
cytokeratin
AE1/AE3
AE1/AE3
1:150
TRS pH6 DakoCytomation
Antikroppen är avsedd för laboratoriebruk för att med hjälp av ljusmikroskopi kvalitativt
identifiera två epitop som finns på majoriteten av epitelcytokeratiner i formalinfixerad
paraffininbäddad vävnad. Positiva resultat används som hjälp vid klassificering av normal
och neoplastisk vävnad av enkel och skiktat epitelial ursprung. Det fungerar som
komplement till konventionell patologi. Positivt färgningsresultat ses i cytoplasma i
cylinderepitel i cervix, kolon, matstrupe, hud, tunntarmen, buken och tonsiler. Övrig vävnad
som färgas inkluderar glandulär vävnad (bröst, tyroidea, prostata och svett), distala tubuli
och Bowmans kapsel, gallgång, endometrium osv. Negativt resultat erhålls från binjure,
hjärta, mjälte, testis.
E-cadherin
HECD1
1:500
TRS pH6 Zymed
Majoriteten av celladhesionstrukturer i epiteliala celler är adherens junctions. Dessa
strukturer är uppbyggda mest av två adheresionmolekyler, E-cadherin och nectin.
Celladhesionsmolekyler är viktiga för celltillväxt och celldifferentiering. Förutom det
cadheriner är involverade i aktivering av cellsignalering, reglering av cytoskelett och kontrol
av cellpolariteten. Uttryck av E-cadherin korrelerar med rörlighet och invasivitet av
tumörceller. Vävnadsspecificiteten av olika cadheriner är bra markör för identifiering och
differentiering i diagnostik av olika typer av cancer
21
Tabell 2
INTRACELLULÄR DISTRIBUTION
äggledare
endometrium
prostata
testis
binjure
njure
bronkie
pankreas
lever
duodenum
hud
tonsil
cerebral cortex
VÄVNADSDISTRIBUTION
glatt muskel
ANTIKROPP
Fibrillarin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Fibrillarin förekommer som små fina korn i cellkärnan.
Intensiteten varierare från sparsamt till ymnigt. Bild 1
visar hud, bild 2 är njure.
Emerin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Färgningsmönstret är perinukleärt, intensivt och
homogent. Bild 1 visar hud, bild 2 visar njure.
Calreticulin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Den intracellulära distributionen är cytoplasmatisk med
fin, grynig, homogen färgning som varierar i intensitet
från cell till cell. Bild 1 visar binjure och bild 2 är från glatt
muskel.
Golgi protein
0
-
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
Golgiproteinet ger en cytoplasmatisk, kornig färgning
som är något heterogen, ibland perinukleär. Bild 1 visar
pankreas, bild 2 visar äggledare.
+
Bred spridning i olika vävnader. Homogen,
cytoplasmatisk färgning med kornigt mönster. Bild 1
visar kraftig färgning i sekretoriska celler i duodenum,
bild 2 visar binjurevävnad.
Mitochondria
(Chemicon)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
22
+
+
Mitochondria
(GeneTex)
Prohibitin
Katalas
Tubulin
Vimentin
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
23
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Bred vävnadsdistribution med olika intensitet beroende
på energibehov. Det intracellulära distributionsmönstret
är cytoplasmatiskt, finkornigt, något heterogent. Bild 1
visar hjärtmuskel, bild 2 pankreas med sekretoriska
celler som innehåller många mitokondrier.
+
Prohibitin som mitokondriel markör ger ett grynigt,
homogent, cytoplasmatiskt färgningsmönster.
Intensiteten på färgningen beror på typen av cellen.
Celler med större energibehov som de i njurtubuli eller i
muskler har kraftigare uttryck. Bild 1 visar njure , bild 2
hjärtmuskel.
+
Katalas är ett peroxisomspecifikt protein. Det uttrycks
homogent, cytoplasmatiskt, fint till grovkornigt framförallt
i lever och njure pga detoxiska processer. Bild 1 visar
lever, bild 2 visar njure.
+
Proteinet förekommer i alla celltyper utom i röda
blodkroppar. Uttrycksmönstret är homogent,
cytoplasmatiskt men heterogent i olika celltyper.
Intensiteten varierar. Bild 1 visar tuba med cilier där
tubulinet uttrycks rikligt. Bild 2 visar hud där man kan se
heterogenitet i olika celltyper.
+
Intensiv och homogen, cytoplasmatisk färgning. När det
gäller granulering är det svårt att karakterisera med
namn. Det finns tendens till ihopklumpning. Bild 1 visar
duodenum, bild 2 visar cerebral cortex.
Desmin
Aktin
Cytokeratin
AE1/AE3
E-cadherin
+
+
-
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
24
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Desmin tillhör gruppen intermediära filamentetsproteiner.
Finns i alla typer av muskelceller, myofibroblaster,
blodkärl, celler av mesotelial ursprung osv. Proteinet
uttrycks kraftigt och homogent cytoplasmatiskt. Bild 1
visar glattmuskel, bild 2 visar endometrium med
desminuttryck.
+
Som ett av kroppens vanligaste proteiner finns aktin i
alla vävnader. Proteinet ingår i cellskelettet. Den
intracellulära distributionen är homogen, kraftig,
cytoplasmatisk. Bild 1 visar cerebral cortex med blodkärl
och bild 2 visar vävnad från testis.
+
Det är ett protein som ingår i epitelcellernas cytoskelett.
Den intracellulära färgningen är kraftig, homogen och
cytoplasmatisk. Bild 1 visar njure med olika
färgningsintensitet i de proximala respektive distala
tubuli. Bild 2 visar epiteliala celler i tuba.
+
Proteinet ingår i plasmamembranet i alla celler av
epitelialt ursprung. Färgningsmönstret är membranöst,
ibland okontinuerligt som exempelvis i hepatocyter vilket
visas i bild 1. Bild 2 visar membranös färgning i hudens
epitelceller.
