Bruksanvisning
+
Dynals AllSet ™- och
+
CombiSet ™ SSPfamiljer
0088
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
INNEHÅLL
Sid
AVSEDD ANVÄNDNING.................................................................................................. 3
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING ...................................................................... 3
FÖRFARANDETS PRINCIPER ........................................................................................ 3
REAGENSER .................................................................................................................. 4
Som Ingår I Typningssatsen.............................................................................. 4
Förvaring........................................................................................................... 4
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSANVISNINGAR .................................................... 5
UTRUSTNING SOM BEHÖVS MEN SOM INTE TILLHANDAHÅLLS AV DYNAL.......... 5
FÖRFARANDE ................................................................................................................. 6
Provtagning och provberedning ....................................................................... 6
Inställning av PCR-förstärkning........................................................................ 6
PCR-förstärkning.............................................................................................. 8
PCR-detektering med agarosgelelektrofores ................................................... 9
FÖRFARANDETS BEGRÄNSNINGAR......................................................................................... 10
FÖRVÄNTADE VÄRDEN ................................................................................................. 10
Kvalitetskontroll ............................................................................................. 10
Intern test ...................................................................................................... 10
Tolkning av resultaten ................................................................................... 11
Tolkning me Dynal SSPTool™......................................................................... 11
FELSÖKNINGSGUIDE..................................................................................................... 12
BIBLIOGRAFI................................................................................................................... 13
GARANTI ......................................................................................................................... 14
DOKUMENTETS/PRODUKTENS VARUMÄRKEN.......................................................... 14
DOKUMENTETS/PRODUKTENS PATENT ..................................................................... 14
KONTAKTINFORMATION ............................................................................................... 15
Sid 2 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
För diagnostiskt in vitro-bruk
AVSEDD ANVÄNDNING
DNA-typning av klass I eller klass II HLA-alleler.
TYPNINGSUPPLÖSNING
Lågupplösningskit: Alleleler löses på den allmänna nivån, eller allelgruppnivån, som i allmänhet
överensstämmer med de serologiskt definierade specificiteterna.
Högupplösningskit: Högupplösningskit, eller undertypningskit, sörjer för hög upplösning eller genotypning
på allelnivån
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING
Så gott som alla DNA-baserade vävnadstypningstekniker använder PCR-tekniken1 för att förstärka det
HLA-lokus som ska undersökas. Vid de flesta DNA-baserade metoder för vävnadstypning används
PCR-tekniken som typningsförberedande förstärkningssteg för att öka mängden mål-DNA. Därefter
kräver HLA-typningsprocessen ett förförstärkningssteg för att skilja mellan de olika allelerna. Till skillnad
mot andra PCR-baserade metoder skiljer den SSP-metodologi2,3,4,5 som tillämpas av Dynal Biotech Ltd
AllSet+™ och CombiSet+™ SSP mellan de olika allelerna under PCR-processen. Detta kortar ner
bearbetningstiden för förförstärkningen till enbart ett enkelt detekteringssteg för gelelektrofores.
FÖRFARANDETS PRINCIPER
Dynal SSP-metoden utgör en PCR-baserad teknik som använder sig av sekvensspecifika primers
(Sequence Specific Primers – SSP) för DNA-baserad vävnadstypning.
Dynal SSP-produkterna består av paneler med primerblandningar, där varje primerblandning innehåller
ett eller flera specifika primerpar, dvs. de allel- och/eller gruppspecifika primerna, liksom också ett
kontrollprimerpar, som motsvarar icke-alleliska sekvenser i proven. Kontrollprimerparet fungerar som en
intern PCR-kontroll för verifiering av PCR-förstärkningarnas effektivitet.
Dynal SSP bygger på principen att en perfekt anpassad primer används effektivare i PCR-reaktionen än
en primer med en eller flera missanpassningar i sin 3’–ände. Typningssystemets specificitet utgör en
del av PCR-förstärkningssteget, och efterförstärkningsbearbetningen av proven reduceras till ett
minimum.
Tilldelningen av allelerna består enbart i fastställandet av huruvida försträkning har skett eller inte, dvs.
visualisering och detektering av förstärkningen med agarosgelelektrofores. PCR-SSP-tekniken ger en
höggradig upplösning eftersom varje primerpar identifierar två länkade, cis-placerade polymorfiska
platser. Metoden sörjer för hög känslighet, specificitet och reproducerbarhet.
Sid 3 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
REAGENSER
Reagenser i samtliga Dynal AllSet+™SSP- eller CombiSet+™ SSP-kit
Enhet
Beskrivning
1. PCR-brickor med föralikvoterade
och torkade SSP-primerblandningar
Varje brunn på PCR-brickan innehåller en torkad SSPprimerlösning, som består av såväl allel- och/eller
gruppspecifika primers som av ett kontrollprimerpar
anpassat till icke-alleliska sekvenser. Kontrollprimerparet
förstärker ett fragment av en konserverad gen som
förekommer i samtliga prov.
2. PCR-lock
Lock för förslutning av PCR-brickorna
Antal PCRreaktioner per
test
3. Huvudblandning (hur många
flaskor som ingår i kitet beror på
antalet PCR-reaktioner per test – se
tabellen till höger)
Antal flaskor med
huvudblandning som
ingår i kitet (samtliga
1,8 ml)
1-9
1
10-20
2
21-40
3
41-95
4
96
5
1 x Koncentration klar för användning.
Huvudblandningen har optimerats för användning med
AmpliTaq® DNA Polymerase (Roche Molecular
Systems, Inc.)
Formuleringinformation återfinns på
[email protected]
4. Broschyr med bruksanvisning för
produkten/satsspecifik
produktinformation
Broschyr med bruksanvisning och satsspecifik
produktinformation (BSPI).
5. Tolkningsarbetsblad
Ett arbetsblad för att fastställa av vilken allel
eller allelgrupp respektive primerblandning
identifierar.
Förvaring
1. PCR-brickorna och huvudblandningen måste förvaras vid en temperatur på 2-8 °C.
2. Frys inte reagenserna.
3. Vid korrekt förvaring är dessa reagenser och primerblandningar stabila fram till det sista
användningsdatum som anges i broschyren med satsspecifik produktinformation.
Sid 4 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSANVISNINGAR
1. För diagnostiskt in vitro-bruk
2. Allt arbete med Dynal AllSet+™ och CombiSet+™ SSP ska utföras med tillämpning av god
laboratoriepraxis, och i enlighet med lokala riktlinjer, exempelvis EFI-standarderna eller CPAriktlinjerna
3. Varning för biologisk risk Hantera alla prover som om de kan överföra sjukdomar. Allt arbete
ska utföras med lämpliga handskar och lämplig skyddsutrustning
4. Varning för biologisk risk Rör med skruvlock ska användas vid provberedningen, för att
förebygga provstänk och risken för kontaminering
5. Varning för biologisk risk: Hantera alla prover som om de är infektiösa, med tillämpning av
säkra laboratorieförfaranden som exempelvis dem som redovisas i Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories6 och i NCCLS-dokument M29-T7. Rengör och desinficera alla
arbetsytor omsorgsfullt med 1-procentigt blekmedel (NaClO). Autoklavera utrustning och
material som kommit i kontakt med kliniska prover före kassering
6. Varning för biologisk risk: Den etidiumbromid som används för DNA-färgningen utgör en
potentiell cancerogen. Använd alltid nitrilhandskar vid hantering av färgade geler och
etidiumbromid.
7. Försiktighet: Använd UV-blockerande ögonskydd, och titta inte direkt in i UV-ljuskällor med
oskyddat öga, vid betraktande eller fotografering av geler.
8. Försiktighet: De pipetter som används för PCR-avslutande åtgärder ska inte användas för
PCR-förberedande åtgärder
9. Försiktighet: Kontaminering. Undvik mikrobiell kontaminering av reagenser när alikvoter tas
ur reagensflaskorna. Använd alltid handskar för att eliminera risken för provkontaminering. Vi
rekommenderar att sterila engångspipetter och –filterpipettspetsar används. Använd inte
reagenser som uppvisar tecken på grumlighet eller mikrobiell kontaminering
10. Kasseringsanvisning: Kassera oanvända reagenser och avfall i enlighet med gällande
nationella och lokala föreskrifter
11. Materialsäkerhetsdatablad (MSDS) kan laddas ner från www.tissue-typing.com, och kan
också erhållas från Dynal Biotechs lokala kontor. (Se kontaktinformationen på den sista sidan av
denna bilaga)
UTRUSTNING SOM BEHÖVS MEN SOM INTE TILLHANDAHÅLLS AV DYNAL:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Utrustning för manuell pipettering (exempelvis Eppendorf eller Gilson)
Engångsfilterpipettspetsar för denna utrustning
Virvelblandare
Mikrocentrifug
PCR-rack för mikrorörsförvaring
Perkin-Elmer GeneAmp® PCR system 9600 eller 9700, eller annan godkänd termalcykler
med motsvarande specification
Värmeplatta/mikrovågsugn för uppvärmning av agaroslösningar
Elektroforesapparat (exempelvis ABgene Electro-Fast® Stretch 108 Complete, AB-0708)
UV-transilluminator
Gelfotograferings/bilddokumenteringssystem
Rekombinant Taq-polymeras (Dynal rekommenderar AmpliTaq®)
Agaros av elektroforeskvalitet
Etidiumbromid
Sid 5 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
FÖRFARANDE
OBS: Detta förfarande ska utföras inom två delar av laboratoriet (PCR-förförstärkning och PCRefterförstärkning) enligt vad som framgår av anvisningarna nedan.
PROVTAGNING OCH PROVBEREDNING
Försiktighet: Hantera alla prover som om de kan överföra smittämnen.
a)
VI REKOMMENDERAR INTE ANVÄNDNING AV HEPARINISERAT
BLOD8
b)
DNA kan extraheras från humana celler med kärnor med valfri metod
c)
För att få en optimal PCR-SSP-förstärkning, och optimala typningresultat,
ska man använda DNA med hög renhetsgrad (OD 260:280 förhållande 1,61,8).
d)
Den slutliga DNA-koncentrationen före PCR-SSP ska vara ungefär 50 ng/µl
e)
Extraherat DNA ska spädas i dH20
f)
DNA kan förvaras vid en temperatur på –20 °C eller lägre under längre
tidsperioder (> 1 year) utan att resultaten påverkas negativt. DNA som
förvaras vid en temperatur på +4 °C under längre tid kommer att försämras,
vilket leder till flera artefakter och därmed till icke-specifika förstärkningar.
INSTÄLLNINGAR FÖR PCR-FÖRSTÄRKNINGAR (utförs inom för-PCR-området)
För att utföra en enstaka typning bereder man följande PCR-blandning. De volymer som behövs
framgår av tabellen på nästa sida (beroende på antalet PCR-reaktioner per test).
•
•
•
Huvudblandning
Prov-DNA (vid 50 ng/µl)
AmpliTaq® DNA-polymeras (vid 5 .i.u./µl )
•
•
Blanda ordentligt
Dispensera 10 µl av ovanstående PCR-blandning i varje brunn på Dynal AllSet+™- eller
CombiSet+™ SSP-brickan
Sätt på PCR-locken och dra åt dem ordentligt så att rören blir väl förslutna. Ett
förslutningsverktyg kan användas. PCR-kompatibla, häftande förslutningsark kan också
användas. Proven är nu klara för PCR-förstärkning
Förvara återstående kitreagenser vid en temperatur på 2-8 °C
•
•
Sid 6 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
Beräkningstabell för PCR-blandningar:
MMPCRProv-DNA AmpliTaq®
lösning
reaktioner
(µl )
(µl )
(µl )
per test
1
4
6
8
10
32
48
64
80
96
7,6
11,4
15,2
19,0
22,8
0,32
0,48
0,64
0,80
0,96
12
14
16
18
20
112
128
144
160
176
26,6
30,4
34,2
38,0
41,8
1,12
1,28
1,44
1,60
1,76
22
24
26
28
30
208
224
240
256
272
49,4
53,2
57,0
60,8
64,6
2,08
2,24
2,40
2,56
2,72
40
42
44
46
48
352
384
400
416
432
83,6
91,2
95,0
98,8
102,6
3,52
3,84
4,00
4,16
4,32
96
864
206,0
9,00
OBS: Vid ojämna antal PCR-reaktioner per test, som inte är medtagna i tabellen ovan, ska man i
stället använda närmast högre jämna värde (vid exmeplvis 13 PCR-reaktioner per test ska man
använda sig av beräkningarna för 14 PCR-reaktioner).
Sid 7 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
BRICKLAYOUT
Rätt brickorientering säkerställs av primerblandningen i brunn nummer ett (som även identifieras med
hjälp av blå färg), som är märkt med satsnumret tryckt på sidan.
e.g HLA-X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
BORTSE FRÅN EVENTUELLA ANDRA NUMMER SOM GJUTITS IN I PLASTBRICKAN, SOM
EXEMPELVIS 1, 2, 3
INSTÄLLNINGAR FÖR PCR-FÖRSTÄRKNINGAR (utförs inom efter-PCR-området)
1.
Placera AllSet+™- eller CombiSet+™ SSP-brickan i termalcyklern
Programmera termalcyklern med följande parametrar:
Steg
Ett
denatureringssteg
10 cykler
20 cykler
Temperatur
(°C)
96
Tid (sek.)
Åtgärd
120
Denaturering
96
65
15
60
96
61
72
10
50
30
Denaturering
Bindning
Förlängning
Denaturering
Bindning
Förlängning
För specifik termalcyklerinformation hänvisas till tillverkarens handbok
2.
3.
Starta programmet
Ta bort proverna från termalcyklern när programmet är slutfört
OBS: Flytta inte förstärkt DNA till PCR-förförstärkningsområdet
Sid 8 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
PCR-DETEKTERING MED AGAROSGELELEKTROFORES
OBS: Vi rekommenderar att samma buffert används för såväl framställningen av gelen som för
bufferten. Om man exempelvis använder 0,5 x TBE i gelen ska man alltså också använda 0,5 TBE
i bufferten.
1.
Bered en 2-procentig (viktprocent) agarosgel (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) i 0,5 x
TBE-buffert
a)
Lös upp agasrosen (2 g/100 ml 0,5 x TBE-buffert) genom att koka den i en
mikrovågsugn tills den är helt löst.
• Kyl till en temperatur på 60 °C.
• Tillsätt etidiumbromid till en slutlig koncentration på 0,5 µg/ml gel.
b)
Gjut en 3-4 mm tjock gel med 3 mm breda brunnar.
• Låt gelen sätta sig i minst 15 minuter.
2.
a)
Överför agarosgelen till en submarin gelelektroforesenhet. Gelen ska täckas med
0,5 x TBE till ett djup på omkring 1-2 mm.
• Ta bort kammen försiktigt.
• Ladda hela PCR-produkten på gelen – direkt och omsorgsfullt.
3.
Kör gelerna i 0,5 x TBE-buffert.
Kör minigeler (en gel med mindre än 10 cm mellan elektroderna) i 10 minuter vid 15 V/cm,
och större geler i 15 minuter vid 10 V/cm.
För att beräkna spänningen mäter man avståndet (i centimeter) mellan ELEKTRODERNA i
elektroforesbadet (gelens längd SAKNAR BETYDELSE).
4.
Undersök gelen med UV-belysning och dokumentera med fotografering.
1.
Samma 0,5 TBE-buffert kan användas flera gånger, men prestanda blir eventuellt
bättre om färsk buffert används.
VARNING:
Etidiumbromid är en kraftfull mutagen. Använd nitrilhandskar och
ögonskydd vid hantering av geler eller lösningar som innehåller
etidiumbromid
Sid 9 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
FÖRFARANDETS BEGRÄNSNINGAR
1.
2.
3.
4.
5.
Till följd av den höga analytiska känsligheten hos PCR ska man vara ytterst noga med att
vidmakthålla kitreagensernas och förstärkningsblandningarnas renhet. Se till att arbetsflödet
vid laboratoriet bara löper i en enda riktning, och att ingen PCR-amplikon förs till PCRinställningsområdet. Reagensernas renhet kan bara bevaras genom tillämpning av god
laboratoriepraxis, och testprestanda kan endast garanteras om man följer anvisningarna i
denna förpackningsbilaga noga.
Test Dynal AllSet+™ och CombiSet+™ har utvecklats med användning enbart av ickehepariniserade helblodsprover eller renade DNA-prover. Prestanda med andra prover har
inte utvärderats.
DNA-provet utgör mallen för PCR-förstärkningsprocessen, och dess kvalitet med avseende
på att såväl renhet som koncentration måste ligga inom de intervall som specificeras för
detta förfarande.
Varje typ av godkänd termalcykler kan användas med denna produkt, förutsatt att
instrumentets specifikationer motsvarar dem för Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 9600
eller 9700.
Kontrollera att alla instrument och all urustning har kalibrerats enligt tillverkarens
rekommendationer
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Kvalitetskontroll
Kvalitetskontrollen och uppdateringen av DNA-baserad vävnadstypning utgör mycket viktiga moment.
Syntetiserade oligonukleotider måste testas omsorgsfullt mot kända cellinje-DNA:er. Primerlösningar
måste testas mot såväl positiva DNA:er som negativa DNA:er med hög sekvenslikhet.
Detta kvalitetskontrollförfarande används:
• Test av primersyntes mot en panel väl karakteriserade cellinje-DNA:er
• Test av specifika primerlösningar mot en panel negativa och positiva DNA:er
• Test av komplett SSP-sats
• Test av slutprodukt
Intern positiv PCR-kontroll
Kontrollprimerparet9 finns med för att bekräfta PCR-reaktionens effektivitet. Dess närvaro bekräftar att
avsaknaden av en specifik förstärkning vid en viss given reaktion verkligen är en följd av avsaknaden av
den polymorfismen i DNA-provet, och inte beror på misslyckad PCR-förstärkning.
Till följd av de annorlunda koncentrationerna och bindningstemperaturerna för de specifika primerparen,
jämfört med det interna kontrollprimerparet:
- minskar många gånger kontrollbandets intensitet i närvara av en specifik förstärkning, samt
- blir de interna kontrollprimerna känsligare för icke-optimala PCR-förhållanden och kan
användas för övervakning av PCR-effektiviteten
Misslyckad förstärkning av de interna kontrollfragmenten inom linjer utan specifika förstärkningar ska
betraktas som ett tecken på ett icke-optimalt system. Möjliga orsaker och korrigerande åtgärder
redovisas i felsökningsavsnittet.
Specifik information om den interna positiva kontrollen återfinns i den satsspecifika
produktinformationsbroschyr som medföljer varje kit.
Sid 10 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
TOLKNING AV RESULTATEN
Alleler tilldelas genom förekomsten av en specifik PCR-produkt. En specifik förstärkning i en linje indikerar
att DNA-provet innehåller den allel, eller en allel inom allelgruppen, som definieras av primerparet i den
aktuella PCR-reaktionen. Använd den tolkningstabell som medföljer varje sats för att bestämma vilken allel
eller allelgrupp respektive primerlösningar identifierar.
I många, men inte alla, Dynal AllSet+™- eller CombiSet+™ SSP-kit förstärks varje allel eller allelgrupp av
mer än en primerlösning. Det är viktigt att kontrollera att alla övriga primerlösningar, som ska vara
positiva för att bära allelen eller allelgruppen, verkligen är positiva.
Alleleler tilldelas genom närvaron av PCR-produkten, men PCR-produkternas relativa storlekar kan vara till
nytta vid tolkningen av SSP-typningarna.
Man kan använda de ungefärliga storlekarna på de specifika PCR-produkterna i syfte att skilja på en
verkligt positiv förstärkning respektive:
- primeroligomerartifakter (primerdimer)
- överföring från intilliggande brunnar
- icke-specifika förstärkningar
Den tolkningstabell som medföljer varje Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit redovisar sekvensen
för de tre mest avslutande nukleotiderna, som bestämmer 3’-ändspecificiteten för såväl framåt- som
bakåtprimern.
•
•
För HLA klass I-produkter redovisas positionen för nukleotiden i den 2:a, 3:e eller 4:e exonen
som motsvarar primernas 3’-ände.
För HLA klass II AllSet+™ SSP-kit redovisas positionen för den kodon som motsvarar primernas
3’-ände.
Om sekvensen för en ny allel som inte omfattas av tolkningstabellen finns tillgänglig kan
primersekvensinformationen användas för att ta reda på den nya allelens förstärkningsmönster.
Kontakta i så fall den tekniska serviceavdelningen kontaktas per e-post på adressen
[email protected], eller per fax på nummer +44 151 346 1223.
Tolkning med Dynal SSPTool™
Dynal SSPTool™ är en specialprogramvara som hjälper dig att tolka resultaten. Varje enskilt AllSet+™och CombiSet+™ SSP-kits satsspecifika tolkningstabell läggs in i programvarudatabasen. Databasen
uppdateras kontinuerligt vid lansering av nya produktsatser.
För hjälp med och information om inläggning av resultat och tolkning av programvaran hänvisas till
hjälpfunktionen i SSPTool™.
Kontakta Dynal Biotechs lokala representant för att beställa ett kostnadsfritt exemplar av Dynal
SSPTool™ (produktkod 990.80).
Sid 11 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
FELSÖKNINGSGUIDE
PROBLEM
Ingen förstärkning (vare sig
förstärkning av de interna
kontrollfragmenten eller
specifik förstärkning)
“
ORSAK
För liten mängd DNA
DNA:et innehåller PCR-inhibitorer, exempelvis proteiner, etanol
(från fällningsstegen).
“
DNA:et har extraherats från hepariniserat blod
“
DNA:et har lösts i en buffert som innehåller EDTA
Slumpmässigt
förstärkningsfel
PCR-rörlock som inte är ordentligt åtskruvade leder till
avdunstning och därav följande förstärkningsfel
“
Misstag vid gelladdning
“
“
“
Svaga interna
kontrollfragment
“
“
“
“
Icke-specifik förstärkning
(stegar eller utstrykningar)
Allt svagare
förstärkningssignaler med
tiden
“
Användning av okalibrerade pipetter
Pipetteringsfel
Prov-DNA, Taq-polymeras eller PCR-förblandningar har inte
blandats ordentligt före användning
Orent DNA
“
Genomför pipetteringen mer omsorgsfullt
Blanda helt kort genom virvling före användning
Mät DNA-kvaliteten. Upprepa DNA-extraktionen med nyberedda
lösningar.
Alltför hög bindningstemperatur. Termalcyklern är inte kalibrerad
För liten mängd termostabilt DNA-polymeras
Använd mer enzym i PCR-reaktionerna
Dålig kvalitet på det termostabila DNA-polymeraset
Använd Amplitaq® från Perkin-Elmer
Orent DNA
(Vissa primerblandningar har en ökad tendens att generera ickespecifik förstärkning – se fotnoterna i respektive
specificitetstabell)
Alla fragment som är större än det interna kontrollframgentet kan
ignoreras
Kontrollera DNA-kvaliteten.
Upprepa DNA-extraktionen
Frånvaro av DNA kan också leda till utstrykningar
Den etidiumbromidbaserade agarosgelfärgningslösningen är
gammal
Bered ny etidiumbromidlösning för att få en bättre färgning av
gelen
En av UV-lamporna är trasig
Kontrollera UVbelysningsutrustningen.
Kalibrera termalcyklaren och kontrollera PCR-programmet.
Termalcyklare som används för rutinmässig PCR-SSP ska
kalibreras var sjätte månad.
Använd handskar och pipettspetsar med filterproppar. Använd
separata områden för för- respektive efter-PCR. Omsorgsfull
provhantering i alla skeden. Kontrollera med avseende på
kontaminering med Dynals kontamineringskontrollprimrar
(produktkod 990.05)
Mät DNA-kvaliteten. Upprepa DNA-extraktionen med nyberedda
lösningar.
Kalibrera termalcyklaren och kontrollera PCR-programmet.
Termalcyklare som används för rutinmässig PCR-SSP ska
kalibreras var sjätte månad.
Kontrollera att satsnumret för den produkt som används
överensstämmer med den tolkningstabell som används.
Kontrollera om alla specifika förstärkningar har rätt storlek, eller
om en artefakt (överföring, primerdimer) kan ha misstolkats som
en förstärkning
Upprepa typningen. Om det nya förstärkningsmönstret är
reproducerbart ska du kontakta Dynal Biotechs lokala
representant för information om alleler som beskrivits under
senare tid.
Använd rekommenderad TBE-buffert.
Kör med lägre spänning
Använd tunna kammar (4 x 1 mm)
Använd samma buffert för gelen och körningsbufferten
0,5 x TBE rekommenderas
Pipettera korrekt
Kan orsakas av kontaminering
“
Kontrollera att rätt antal brunnar har laddats och att varje brunn
innehåller ungefär samma mängd PCR-blandning
Kalibrera alla pipetter rutinmässigt enligt tillverkarens
rekommendationer
Mät DNA-koncentrationen och justera den till 50 ng/µl
Falskt positiva
förstärkningar
Underliga
förstärkningsmönster
Mät DNA-kvaliteten. Tillämpa leverantörens DNAextraheringsmetod exakt.
Prova en alternativ DNA-extraheringsmetod
Extrahera DNA på nytt
Använd icke-hepariniserat blod, eller prova med
heparinasbehandling (se
ref. 8)
Upprepa DNA-extraktion och lös DNA:et i sterilt vatten
Kontrollera att alla lock är ordentligt åtskruvade
Använd förslutningsverktyg
Kalibrera termalcyklaren och kontrollera PCR-programmet.
Termalcyklare som används för rutinmässig PCR-SSP ska
kalibreras var sjätte månad
Alltför hög bindningstemperatur. Termalcyklern är inte kalibrerad
“
Kontrollera att volymen och koncentrationen på det DNA som
tillsattes var korrekt.
Liten DNA-mängd
Falskt negativa
förstärkningar
“
ÅTGÄRD
Orent DNA
För låg bindningstemperatur
Termalcyklerna är inte kalibrerad
Fel tolkningstabell används
Förstärkningsmönsttret innehåller en 'falskt positiv'
Ny allel som inte omfattas av tolkningstabellen
Otydliga, suddiga band
Elektroforesbufferten kanske är varm
“
Amplikonen laddas inte
som den ska
Den kam som används har för breda skåror
Avvikande styrka på den buffert som används
Bufferten är inte kompatibel med PCR-amplikonen
Luftbubblor i pipetten
Sid 12 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
BIBLIOGRAFI
1)
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N.
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia.
Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.
2)
Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K. & Wallace, R. B. (1989). Allele-specific enzymatic amplification of
beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A 86(8),
2757-60.
3)
Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.
C. & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory
mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17(7), 2503-16.
4)
Olerup, O. & Zetterquist, H. (1992). HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific
primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including
donor-recipient matching in cadaveric transplantation [se kommentarer]. Tissue Antigens 39(5),
225-35.
5)
Bunce, M., O'Neill, C. M., Barnardo, M. C. N. M., Krausa, P., Browning, M. J., Morris, P. J. &
Welsh, K. I. (1995b). Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3,
DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCRSSP). Tissue Antigens 46(5), 355-367.
6)
Richmond, Y. and McKinney, W. (red.) 1993. Biosafety in microbiological and biomedical
laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
7)
National Committee For Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from
Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS
Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, 1989.
8)
Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction.
Lancet. 1994 Jun 11;343(8911):1509-10.
9)
Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue
Antigens. 1992 Feb;39(2):68-73
Sid 13 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
Garanti
Endast med avseende på den första köparen garanteras att produkterna överensstämmer vad gäller kvantitet
och innehåll med uppgifterna på flaskan och på externa etiketter, under den angivna livslängden. Dynal
Biotechs ansvar, och köparens enda ersättning, med avseende på denna garanti begränsas till antingen
utbyte, på Dynal Biotechs bekostnad, av eventuella produkter som är defekta med avseende på tillverkning,
och som ska återsändas till Dynal Biotech med transporten förutbetald, eller, om Dynal Biotech så väljer, till
återbetalning av inköpspriset.
Anspråk med avseende på varor som skadats under transporten ska ställas till speditören.
Denna garanti gäller inte för produkter som har ändrats sedan de lämnade Dynal Biotech, och inte heller för
produkter som varit föremål för missbruk eller felaktig hantering. SAMTLIGA ÖVRIGA GARANTIER,
UNDERFÖRSTÅDDA ELLER LAGENLIGA, EXKLUDERAS HÄRMED UTTRYCKLIGEN, INKLUSIVE MEN
INTE BEGRÄNSAT TILL GARANTIER MED AVSEENDE PÅ SÄLJBARHET ELLER LÄMPLIGHET FÖR VISS
ANVÄNDNING. Dynal Biotechs största ersättningsskyldighet begränsas under alla omständigheter till priset på
de produkter Dynal Biotech säljer. DYNAL BIOTECH ÄR UNDER INGA OMSTÄNDIGHETER ANSVARIGA
FÖR NÅGRA SPECIALSKADOR, TILLFÄLLIGA SKADOR ELLER FÖLJDSKADOR. I en del länder är det inte
tillåtet att begränsa ansvarsskyldigheten, eller ansvaret för vissa transaktioner. Om så är fallet är
begränsningarna ovan inte tillämpliga.
Denna produkt får inte förpackas om, formuleras om eller säljas vidare i någon som helst form utan skriftligt
tillstånd från Dynal Biotech Ltd., U.K.
DOKUMENTETS/PRODUKTENS VARUMÄRKEN
Dynal® utgör ett registrerat varumärke som tillhör DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norge
AllSet™ och AllSet+™ är varumärken som tillhör DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norge
DynaMix™ är ett varumärke som tillhör DYNAL BIOTECH Ltd., Storbritannien
CombiSet™ och CombiSet+™ är varumärken som tillhör DYNAL BIOTECH., Storbritannien
SSPTool™ är ett varumärke som tillhör DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norge
AmpliTaq® är ett registrerat varumärke som tillhör Roche Molecular Systems, Inc., USA
Electro-Fast® är ett registrerat varumärke som tillhör Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene®)
GeneAmp® är ett varumärke som tillhör Roche Molecular Systems, Inc., USA
DOKUMENTETS/PRODUKTENS PATENT
_
* Dynal SSP-produkterna säljs under licens på ZENECA Ltd. ARMS™ i enlighet med Europapatent 0332435 och
motsvarande globala patenträttigheter. ARMS™ är ett varumärke som tillhör ZENECA Ltd.
** Denna produkt har optimerats för användning i PCR-processen (Polymerase Chain Reaction), som omfattas
av patent som ägs av Roche Molecular Systems Inc. och F. Hoffmann-La Roche Ltd (“Roche”). Ingen licens att
använda PCR-processen under dessa patent övergår uttryckligen eller underförstått på köparen genom köp av
denna produkt. Ytterligare information om förvärv av licenser att använda PCR-processen kan erhållas genom
att kontakta, i USA, Director of Licensing vid Roche Molecular Systems,, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda,
California, 94501, respektive utanför USA, PCR Licensing Manager, F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr.
124, DH-4070 Basel, Schweiz.
Tillverkat av Dynal Biotech Ltd., Storbritannien
Utvecklat av Dynal Biotech Ltd., Storbritannien
Sid 14 av 15
BRUKSANVISNING
Dynal AllSet+™- och CombiSet+™ SSP-kit
KONTAKTINFORMATION
Dynal Biotech Ltd.,
11 Bassendale Road, Croft Business Park,
Bromborough, Wirral, CH62 3QL, Storbritannien
Tel.: +44 151 346 1234, Fax: +44 151 346 1223
E-post: [email protected], Internet: http://www.tissue-typing.com
Dynal Biotech A.S.A
Box 114 Smestad,
N-0309, Oslo, Norge
Tel.: +47 2206 1000
Fax: +47 22 50 70 15
E-post: [email protected]
Internet: http://www.dynalbiotech.com
DYNAL BIOTECH GmbH
Bramfelder Chaussee 41
22177 Hamburg, Tyskland
Tel.: +49 40 36 15 73-0
Fax: +49 40 36 15 73-30
E-post: [email protected]
Dynal Biotech Inc.
HLA Diagnostics Division
555 Andorra Glen Court
Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, USA
Avgiftsfritt: +1 1866 DYNAL TT (396 2588)
Tel.: +1 610 940 1511
Fax: +1 610 940 3606
E-post: [email protected]
Dynal Biotech S.A.
Centre de Transfert de I’U.T.C.,
66 Avenue de Landshut
60200 Compiègne, Frankrike
Tel.: +33 3 44 23 45 95
Fax: +33 3 44 23 16 14
E-post: [email protected]
Dynal Biotech Pty
PO Box 204, Carlton South,
Victoria 3053, Australien
Tel.: 1 800 623 453
Tel.: +61 3 9663 5777
Fax: +61 3 9663 6660
Nya Zealand, avgiftsfritt: 0800 448 246
E-post: [email protected]
För information om Dynals distributörer runt om i världen kontaktas Dynal Biotech Ltd
© Copyright Dynal Biotech Ltd., Storbritannien Med ensamrätt
Tryckt 12.03. Rev. 000
Sid 15 av 15
