Kvalitetssäkring och Validering Molekylära Metoder Susanna Falklind Jerkérus Sektionen för Molekylär Diagnostik Karolinska Universitetslaboratoriet Vem/Vad styr oss? • 98/79/EG - IVD direktivet • Lagen (1993:584) om medicintekniska produkter •Socialstyrelsen • SOSFS 2008:1 Socialstyrelsens föreskrifter om användning av medicintekniska produkter i hälso- och sjukvården •Läkemedelsverket • Läkemedelsverkets föreskrifter (LVFS 2001:7) om medicintekniska produkter för in vitro diagnostik •SWEDAC • SWEDAC DOC 01:55 Validering/verifiering av kvantitativa och kvalitativa metoder - Vägledning • ISO 15189 Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Socialstyrelsen - SOSFS 2008:1 5 kap. Egentillverkade medicintekniska produkter Krav på egentillverkade medicintekniska produkter 1 § Egentillverkade medicintekniska produkter ska i tillämpliga delar uppfylla de krav som ställs på CE-märkta medicintekniska produkter i 1. lagen (1993:584) om medicintekniska produkter, 2. Läkemedelsverkets föreskrifter (LVFS 2003:11) om medicintekniska produkter, 3. Läkemedelsverkets föreskrifter (LVFS 2001:7) om medicintekniska produkter för in vitro diagnostik 4 § Vårdgivaren ska ansvara för att det inte ställs lägre krav på de egentillverkade medicintekniska produkternas säkerhet och medicinska ändamålsenlighet än på CE-märkta produkter. Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Läkemedelsverket - LVFS 2001:7 • Analytisk och diagnostisk sensitivitet • Analytisk och diagnostisk specificitet • Noggrannhet och mätosäkerhet • Reproducerbarhet • Repeterbarhet och precision • Spårbarhet genom kända referensmetoder och referensmaterial • Livslängd och stabilitet (transport och lagring) • Bruksanvisning på svenska • Genomförande av riskanalys Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder SWEDAC - ISO 15189 - DOC 01:55 Vägledning Validering Fastställer att metoden mäter det man har för avsikt att mäta Verifiering Bekräftar att metoden uppför sig på ett specificerat sätt. Om en metod är väldokumenterad t ex. genom publikation i facktidskrift kan valideringen styrkas med en Verifiering. Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Metodens ursprung påverkar omfattningen av valideringen. Alternativ 1 Metod som är utvecklad och validerad för ett speciellt instrument Leverantörens validering kan accepteras efter bedömning av leverantörens bifogade dokumentation. Även ett annat laboratoriums validering kan accepteras, efter bedömning av valideringsprotokollet. Alternativ 2 Metod som anpassas till ett instrument och som avser vedertagen metod där flera än en leverantör alternativt egna program/moment/komponenter förekommer. Om validerade komponenter från flera leverantörer används åligger det laboratoriet att verifiera att specificerade krav i metoden uppfylls i sin helhet. Om komponenter inte är validerade ska laboratoriet genomföra en tillräckligt omfattande validering. Alternativ 3 Tillämpning av en metod publicerad i vetenskaplig litteratur eller modifiering av tidigare ackrediterad metod. I detta fall måste valideringen/verifieringen vanligen ges en större omfattning än i fall 1 och 2. I de fall där metoden är allmänt etablerad inom professionen kan validering/verifiering ges en mindre omfattning (motsvarande den för Alternativ 1). Alternativ 4 Egenutvecklad metod. För egenutvecklade metoder krävs en utförlig validering. Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Analytisk Sensitivitet och Specificitet Analytisk Sensitivitet Den minsta mängd målDNA/RNA som metoden korrekt kan detektera = detektionsgräns Bakterier: Viable count, Virus: referensmaterial, paneler Analytisk Specificitet Primer/probsekvens, annealingtemp, korsreaktivitet Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Metodens förmåga att bestämma enbart mål DNA/RNA, och identifiera sant negativa prov Klinisk Sensitivitet och Specificitet Klinisk Sensitivitet Klinisk Specificitet Andelen sanna sjukdomsfall som påvisas med metoden Andelen friska som får negativt testresultat med metoden Referensmetod/jämförelsemetod där fynden korreleras till sjukdom/friskhet Molekylärbiologiska metoder ofta känsligare än referensmetoden vilket ger lägre specificitet, konfirmera m sekvensering eller annan metod. Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Analytisk vs Klinisk Specificitet 100% Analytisk Specificitet ≠ 100% Klinisk Specificitet • Friskt bärarskap (ingen sjukdom = falskt positiv) • Utsöndrat DNA/RNA efter behandling • Kontaminant • Bifynd Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Positivt Prediktivt Värde Sannolikheten att ett positivt utfall i en metod är sant positivt. Positivt prediktivt värde = sant positivt/(sant positivt + falskt positivt) (sensitiviteten)(prevalensen) / ((sensitiviteten)(prevalensen) + (1specificiteten)(1-prevalensen)) Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Negativt Prediktivt Värde Sannolikheten att ett negativt utfall i en metod är sant negativt. Negativt prediktivt värde = sant negativt/(sant negativt + falskt negativt) (specificiteten)(1-prevalensen) / ((specificiteten)(1-prevalensen) + (1sensitiviteten)(prevalensen)) Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Prevalensens betydelse Sensitivitet 99,9% Specificitet 99,8% Prevalens 5% PPV= (0.999)(0.05) / ((0.999)(0.05) + (1- 0.998)(1- 0.05))=96% Prevalens 0.2% PPV=50% Lika många sant positiva som falskt positiva Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Repeterbarhet Reproducerbarhet Robusthet Repeterbarhet %CV Reproducerbarheten %CV Robusthet Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Alla faktorer hålls konstanta En eller flera faktorer varieras Lotberoende, personberoende osv Kontroller Interna kontroller Driftkontroll Positiv PCR-kontroll Internkontroll /Inhibitionskontroll /extraktionskontroll Negativa kontroller , drift o PCR Standardkurva Externa kontroller Paneler Flerlabsjämförelser Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Driftkontroller Driftkontroll standardavvikelser HSV 1 blåsor, 2012 30 Ct-värde HSV 1 +3 SD 28 -3 SD + 2SD -2 SD 26 Datum Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Driftkontroll standardavvikelser Parotit, 2011 32 CP-värde 30 28 Agens 26 +3 SD 24 22 + 2SD 20 -2 SD -3 SD Datum Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder PCR kontroll standardavvikelser HSV 1 blåsor, 2010 38 36 Ct-värde 34 HSV 1 +3 SD -3 SD + 2SD -2 SD 32 30 28 26 24 22 20 Datum Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Internkontroll Negativt prov Internkontroll måste vara positiv för godkänd analys Positivt prov Internkontroll kan vara positiv eller negativ, pga kompetition Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder Mutationer? Håll koll på amplifieringsplottarna Håll koll på statistiken Håll koll på sekvenser i GenBank Håll koll på omvärlden Kvalitetspaneler Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder TACK! Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder