Malariaparasitens resistens mot läkemedel William Ondusye

Malariaparasitens resistens mot läkemedel
William Ondusye
Independent Project in Biology
Självständigt arbete i biologi, 15 hp, höstterminen 2014
Institutionen för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet
Sammandrag
Malaria är en av världens dödligaste sjukdomar och år 2012 inträffade det uppskattningsvis
över 600 000 dödsfall. Myggsläktet Anopheles sprider den eukaryota encelliga parasiten
Plasmodium varav den dödligaste arten är Plasmodium falciparum. I sin livscykel genomgår
parasiten olika stadier där den infiltrerar hepatocyter och erytrocyter vilket framkallar symtom
hos värden. Sjukdomen delas upp i två kategorier, icke-komplicerad och komplicerad malaria.
Flera olika typer av läkemedel används mot malaria och de verkar genom att angripa
parasiten under de olika stadierna. Ett växande problem är att P. falciparum utvecklat
resistens mot antimalariska läkemedel, bland annat chloroquin, ett vanligt förekommande
läkemedel. Det enda kvarstående effektiva läkemedlet mot P. falciparum är artemisinin.
Många av parasitens intracellulära processer är fortfarande okända, framförallt exakt hur
läkemedelsresistens uppstår. Studier på P. falciparums genetik har kommit fram till att två
gener är viktiga i denna process, PfCRT och PfMDR1. Dessa gener orsakar att mindre av
läkemedlet ansamlas i parasitens digestiva vakuol. Genernas exakta roll i
resistensutvecklingen är än oklar men många studier som observerat mutation i dessa
konstaterar att de är av betydelse.
Inledning
Bakgrund om sjukdomen
Malaria är idag känd som en av värdens dödligaste insektsspridda sjukdomar. Enligt
världshälsoorganisationen uppskattades över 600 000 människor ha omkommit år 2012
(World Health Organization 2013), men tidigare år har så många som över två miljoner
dödsfall uppskattats (Holt et al. 2002). Sjukdomen sprids av myggsläktet Anopheles (Holt et
al. 2002) av vilket det finns över 400 arter (Sinka et al. 2012). Ungefär 70 av dessa har
förmågan att bära på mänsklig malaria men vanligtvis är det runt 40 arter som sprider
sjukdomen (Sinka et al. 2012). Myggan bär på den encelliga parasiten Plasmodium, en
eukaryot som, utöver människor, även har förmåga att smitta andra djur, däribland fåglar,
reptiler och även andra däggdjur (Centers for Disease Control and Prevention). Under sin
livscykel har plasmodium-parasiten två värdar, en mygga till vektor och ett ryggradsdjur där
cellen utövar sin patogena verkan. Malaria finns över hela världen men frodas huvudsakligen
i de tropiska regionerna. 90 % av dödsfallen sker i Afrika, söder om Sahara och de flesta
offren är barn under fem år (Holt et al. 2002). Även gravida kvinnor är i en högre riskzon för
malariadödlighet (Lindsay et al. 2000). Ekonomiska faktorer spelar även stor roll i det höga
dödsantalet. Många omkommer av sjukdomen på grund av att de inte har tillgång till lämplig
sjukvård (Gardner et al. 2002).
Det är huvudsakligen fyra arter i släktet Plasmodium som smittar människor. Dessa innefattar
P. falciparum, P. malariae, P. ovale, samt P. vivax. En femte art, P. knowlesii, har, enligt
rapporter från sydöstra Asien, också påvisats orsaka sjukdom hos människor, men inte i lika
stor utsträckning. Denna kännetecknas annars av sin förmåga att smitta apor, däribland släktet
Macaca (Lee et al. 2011). Av de människosmittande parasiterna är det P.falciparum och
P.vivax som orsakar flest infektioner (Wangmaung et al. 2014) och P. falciparum är den
dödligaste varianten (Rasti et al. 2004). Den främste vektorn av P. falciparum är myggan som
tillhör släktet Anopheles gambiae (Holt et al. 2002). I östra delar av Asien så sprids P. Vivax
huvudsakligen av myggarten Anopheles sinensis (Ree 2005, Sinka et al. 2011) medan
myggarten A. Darlingi är den huvudsakliga vektorn i neotropiska regionen (Syd- och
Centralamerika) (Marinotti et al. 2013) där den sprider både P. vivax och P. falciparum
(daSilva-Nunes et al. 2012). Trots att även A. darlingi påstås vara särskilt mottaglig för P.
falciparum (Girod et al. 2008) så sprids inte denna parasit med samma intensitet i
neotropikerna som den gör i andra världsdelar (Sinka et al. 2010).
1
Vektorkontroll är en nödvändig metod att bekämpa malaria. Det innebär att man försöker
eliminera patogenernas vektorer, i detta fall Anopheles-myggan. Innan det neurotoxiska
bekämpningsmedlet DDT förbjöds runtom i världen så användes det under andra världskriget
för att bekämpa malaria hos soldater. Det förbjöds på grund av sin potentiella toxiska effekt
mot människor (World Health Organization, National Pesticide Information Center 1999,
Davies 2007). Senare infördes användningen av pyretroider som verkade på liknande sätt men
hade låg toxicitet hos vertebrater (Schleier III & Peterson 2011). Därför används pyretroider
än idag i vektorkontroll, till exempel genom att impregnera myggnät (Kanza et al. 2013).
På 1950 och 1960- talet lanserade världshälsoorganisationen en kampanj för att bekämpa
malaria där läkemedel utnyttjades i kombination med vektorkontroll. Sjukdomen bekämpades
framgångsrikt i Europa och andra delar av världen. I USA hade ett liknande program införts
några år tidigare och gett liknande resultat. I dessa kampanjer använde man sig av chloroquin,
ett läkemedel mot malaria som än idag används. (Centers for Disease Control and
Prevention, Holt et al. 2002).
Ett problem som på sistone uppstått är malariaparasitens resistens mot ett flertal av dagens
läkemedel. Chloroquin är ett av de vanligaste läkemedlen på marknaden och man har
observerat att P. falciparum, den dödligaste parasiten, har utvecklat resistens mot det (Trape
et al. 1998). Studier har även visat resistens hos P. falciparum mot det effektivare läkemedlet
artemisinin (Dondorp et al. 2009). Detta, i kombination med att vektorn även utvecklat
resistens mot bekämpningsmedel (Yadouleton et al. 2010), har lett till en ökad dödlighet, då
både behandling av insjuknade, samt vektorkontroll har försvårats.
Det huvudsakliga problemet tycks vara hur komplicerad parasitens resistensmekanism är. Det
än oklart exakt hur den uppstår och det studeras i stor utsträckning. En viktig aspekt är hur
genetiken ger upphov till resistensen. Det tros vara många gener som ligger bakom. Vad som
ofta har noterats är att det finns en koppling mellan två gener, PfCRT och PfMDR1, och
resistensen mot läkemedel som chloroquin. Studierna undersöker hur mutationer i dessa gener
påverkar resistensen (Gresty et al. 2014). Med avseende på detta är syftet med följande artikel
att undersöka hur stor roll PfMDR1 möjligen kan ha i P. falciparums förmåga att utveckla
denna läkemedelsresistens genom att försöka besvara frågeställningen: Har mutation av
malariaparaisten P. falciparums gen PfMDR1 en avgörande roll i hur resistent den är mot
antimalariska läkemedel som artemisinin och chloroquin?
2
Patogenes
Parasitens generella livscykel
Plasmodiumparasiten genomgår många stadier under sin livscykel. Den befinner sig i
sporozoit form när människan infekteras (Mota et al.2001). Sporoziten utvecklas i myggans
spottkörtlar från gametocyter (reproduktiva malariaceller som myggan tagit upp från en
smittad värd). När myggan dricker blod så injicieras saliv i värden vilket förhindrar
koagulering av blodet (Singh & Mann 2013). Sporozoiten tar sig in i blodomloppet genom att
följa med saliven. Väl inne i kroppen söker sig sporozoiten till levern och infiltrerar värdens
hepatocyter (leverceller) (Figur 1A) (Mota et al. 2001).
Figur 1. Schematisk illustration av malariaparasitens livscykel. Omritad efter Kim (2013).
I hepatocyterna bildar sporozoiten en struktur som kallas schizont där den förökar sig. Det ger
upphov till dotterceller som kallas merozoiter. Drygt en vecka in i förökningsperioden så
bryts hepatocyten isär av det höga antalet merozoiter som sedan frigörs. De söker sig därpå
till erytrocyter (röda blodkroppar) där de återigen förökar sig asexuellt och det är vid detta
3
stadium som offret insjuknar (Figur 1B) (Marti et al. 2004).
Beroende på vilken typ av parasit det är kan tiden att fullborda livscykeln i erytrocyten
variera. För P. falciparum tar det cirka 48 timmar (Orjih 2014). Erytrocyten lyseras när
tillräckligt många merozoiter har bildats, vilket sedan frigör dem. De nya merozoiterna söker
sig återigen till en ny och frisk blodkropp där processen påbörjas åter (Gaur et al. 2003). I
levern kan sporozoiter av typen P. vivax och P.ovale även gå in i ett vilostadium där de kallas
hypnozoiter. Dessa kan återaktiveras flera veckor (Imwong et al. 2007) efter den primära
infektionen vilket då leder till återfall av insjuknandet (Mekonen et al. 2014). Vissa
merozoiter utvecklas till gametocyter, könscellerna som absorberas när en ny vektor dricker
blod. Gametocyterna förekommer i hanlig och honlig form och när dessa förökar sig sexuellt
så bildas en zygot som, via meios, bildar en ookinet som i sin tur utvecklas till en oocyst
(Figur 1C) (Kumar et al. 2014). Dessa omvandlingar sker i myggans buk och slutligen bildas
sporozoiten som eventuellt kommer infektera en ny värd (Bobenchik et al. 2013, Centers for
Disease Control and Prevention).
Vidhäftningsmekanismer
Infiltration av hepatocyter
För att ta sig in i hepatocyterna utnyttjar sig parasiten av ligander på ytan för att binda till
receptorer på hepatocyten och detta möjliggör vidhäftning. Studier har visat att en
anmärkningsvärd molekyl i denna process är parasitens ytprotein ”circumsporozoit protein”
(CSP). Denna binder till receptorn ”heparan sulfat proteoglykan” på hepatocyten och är en
vital molekyl i processen (Coppi et al. 2005, Ménard et al. 1997).
Infiltration av erytrocyter
Mekanismen bakom erytrocyt-infiltrationen är också ligand- och receptorinteraktion men det
är än oklart just vilka molekyler på merozoitens ytlager som känner igen blodkroppen (Gaur
et al. 2003). P. vivax kan bara infiltrera reticulocyter (ofullständigt utvecklade blodkroppar).
Utöver detta så är P. vivax även begränsad till att bara angripa blodkroppar som innehar
särskilda glykoprotein på cellytan. Dessa glykoprotein kallas Duffy-antigener och agerar som
receptorer för P. vivax att känna igen och binda till (Russell et al. 2011). En stor del av
befolkningen i västra Afrika, samt de som härstammar därifrån saknar dessa antigen på sina
blodkroppar och är därmed resistenta mot P. vivax infektion (Culleton et al. 2008).
Till skillnad från P. vivax har P. falciparum olika metoder att infiltrera erytrocyter och är
därför effektiv på att ta sig in i alla sorters erytrocyter. Parasiten binder till sialoglykoprotein
(En sammansättning av glykoprotein och sialinsyra) på erytrocytens membran som kallas
glykoforiner. Huvudsakligen binder den till typen Glykoforin A men den kan även binda till
andra varianter, till exempel Glykoforin B (Gaur et al. 2003).
När merozoiten har infiltrerat erytrocyten har parasiten nått trofozoit-stadiet. Här bildar den
en ring-struktur och modifierar blodkroppen till en form genom vilken molekyler kan
transporteras ut och in. Den livnär sig på blodkroppens beståndsdelar genom att endocytera
stora mängder cytosol. I processen konsumeras blodkroppens hemoglobin som sedan bryts
ned till aminosyror och en hemgrupp. (Hosseini & Feng 2012, Saliba et al. 2002, Sharrock et
al. 2008) Dessa lagras i parasitens digestiva vakuol, ett utrymme med sur miljö. (Saliba et al.
2002). Hemgruppen består av en porfyrinring, ett flertal cykliska organföreningar som
tillsammans binder en metalljon i centrat, exempelvis järn. Hos människan är den viktig i
biokemiska processer då den binder till syre och koldioxid som blodkroppen transporterar
(Hardison 2012). Hemgruppen är potentiellt toxisk för malariaparasiten och därför måste
4
parasiten oskadliggöra den. Detta sker genom att den kristalliseras till den icke toxiska
formen hemozoin som även kallas malariapigment. Peptiderna som lagrats används som
näringskälla (Saliba et al. 2003, Dasari et al.2011).
Endotelcellvidhäftning
Till skillnad från andra människoinfekterande Plasmodium-parasiter har P. falciparum den
unika förmågan att fästa sig till endotelcellerna (det tunna cellager som utgör den inre
gränsen) i värdens blodkärl. Processen kallas ”cytoadherens” och organ som drabbas av detta
kan vara hjärtat, hjärnan, lungor och moderkakan (Piper et al. 1999, Maubert et al.2000,
Storm & Craig 2014). Cytoadherens möjliggörs genom att parasiten omvandlar erytrocyternas
yta till en form som består av utväxter och det är dessa utväxter som är beröringspunkter vid
fästandet. Under det tidiga utvecklingsstadiet innehar även gametocyterna denna förmåga.
Parasiten drar nytta av vidhäftning då den skyddas från att förstöras av kroppens
immunsystem (Yipp et al. 2000, Morahan et al. 2011).
Mekanism
Den generella mekanismen bakom endotelcell-vidhäftningen är lik erytrocyt- och
hepatocytvidhäftning, det vill säga ligander binder till endotelcellernas receptorer (Yipp et al.
2000). Ett särskilt proteinutskott på erytrocytens yta som studeras är ”P. falciparum
erythrocyte membrane protein 1” (PfEMP1). Proteinet, som kodas av genfamiljen var,
möjliggör bindning till alla de olika receptorerna på endotelcellerna och skyddar parasiten
från att rensas bort av mjälten (Piper et al. 1999, Maubert et al.2000, Storm & Craig 2014,
Miller et al. 2013). Det är än oklart exakt vilka molekyler som är inblandade i vidhäftningen
men det visats att PfEMP1 bland annat binder till värdreceptorerna ICAM-1, CD36 och
thrombospondin på endotelcellerna (Yipp et al. 2000, Morahan et al. 2011). Dess uttryck
uppregeleras när erytrocyten befinner sig i områden där andra parasiter har vidhäftat sig (Idro
et al. 2010). Det indikerar att endotelvidhäftning sannolikt sker i större utsträckning i
områden där det redan finns vidhäftade parasiter. Utöver detta så kan infiltrerade erytrocyter
även klumpa ihop till en stor massa av endotelvidhäftande parasitinfekterade erytrocyter.
Effekten på värden av denna bindning är försämrad perfusion (tillförsel av blod in i organ)
och hypoxi (syrebrist) (Idro et al. 2010).
Symtom
Två sorter av malaria
Sjukdomen delas upp i två kategorier. Den första benämns icke-komplicerad malaria där
märkbara symtom innefattar feber, köldkänslor, huvud- och kroppsvärk, illamående,
svettningar och kräkningar. Icke-komplicerad malaria orsakas av P. falciparum, P. malariae,
P. ovale, och P. vivax. Den andra kategorin är komplicerad, ”allvarlig” malaria vilket är det
stadium som uppnås då fel börjar uppstå i vitala organ (Centers for Disease Control and
Prevention). Det orsakas av P. falciparum och framkallar huvudsakligen neurologiska skador
i form av cerebral malaria, acidos (försurning av blodet), andnöd, samt anemi (blodbrist)
(Miller et al. 2013). Vanligt hos barn är anemi och cerebral malaria (Schellenberg et al.
1999). Utöver dessa symtom uppstår även följande: hemoglobinuria (tillstånd där hemoglobin
finns i blodet), ovanlig blodkoakulering, hypoglykemi (lågt blodsocker), hyperparasitemi
(Parasitfrekvens över 5 % i blodkroppar), akuta besvär med njurar och lågt blodtryck (Centers
for Disease Control and Prevention). Symtomen sker under stadiet då merozoiterna asexuellt
förökar sig i den intra-erytrocytiska cykeln (Figur 1B) (Miller et al. 2013).
5
Komplicerad malaria: Cerebral
Cerebral malaria, som anses vara P. falciparum’s allvarligaste form av neurologisk påverkan,
är dödlig om inte patienten behandlas. Det cerebrala blodflödet ökar hos de som drabbats och
orsaken tros vara att kroppen ökar behovet av metabolism, samt näring och syre (Trampunz et
al. 2003). Barn drabbas av cerebral malaria barn i större utsträckning än vuxna och är
dessutom mer benägna att få långvariga hjärnskador. Drabbade barn lider vanligtvis av anfall
och det har observerats att permanenta nervskador sker i samband med att dessa anfall är
varaktiga (Idro et al. 2010). Det är vanligt att medvetandet hos de som drabbas kan försvagas
till den grad att de hamnar i koma och detta tros orsakas av endotelcell-vidhäftning. Däremot,
med hjälp av specifika antimalariska medel så går detta att reversera (Idro et al. 2010).
Dondorp et al. (2005) utförde en studie i Sydostasien där man fann att intravenös tillförsel
(sprutad direkt in i blodet genom blodådran) av läkemedlet artesunat (beskrivs i avsnitt
”Läkemedel”) fungerar som en effektiv behandling mot komplicerad malaria.
Komplicerad malaria: Anemi
Anemi är ett vanligt symtom hos barn och gravida kvinnor. Vid P. falciparum-infektion
arbetar kroppen för att göra sig av med parasitinnehållande erytrocyter. Problemet ligger i att
kroppen även eliminerar så mycket som 90% av de erytrocyter som inte infekterats och att
denna förlust inte kompenseras på grund av fel i benmärgen. Därför har antimalariska
läkemedel ingen signifikant påverkan i behandlingen av anemi (Ekvall 2003). Det är inte helt
klart exakt varför en överdriven eliminering sker men Ekvall (2003) påstår även att en
bidragande faktor kan vara att erytrocyt-membranet förändrats. Vid en malariainfektion
producerar kroppen cytokiner och det tros att dessa är inblandade i den elimineringen. Detta
orsakar att makrofager frigör kväve- och syreradikaler som både angriper infekterade och
icke-infekterade erytrocyter. Radikalerna utsätter erytrocyterna för oxidativ stress vilket sliter
på deras membran och därmed leder till en ökad rensning av dessa blodkroppar.
Komplicerad malaria: Acidos
Acidos är ytterligare ett dödligt symtom. Hos barn är acidos-förknippad dödlighet
huvudsakligen kopplat till fel i metaboliska processer. Vuxna kan även få besvär med
blodcirkulationen och njurar (Day et al. 2000).
Behandling med hjälp av läkemedel
Innan läkemedel utvecklades använde man extrakt från växter för att behandla malaria
(Aguiar et al. 2012, Centers for Disease Control and Prevention). Idag har det utvecklats en
rad olika typer av läkemedel som verkar på olika sätt och placeras in i olika kategorier utifrån
detta (Tabell 1).
Läkemedel
Quinolinderivat
Quinolinderivat verkar genom att angripa parasiten efter att den infiltrerat erytrocyten.
Dessutom kan primaquin, ett quinolinderivat, även angripa den när den är i gametocyt form
eller befinner sig inuti hepatocyter. Den generella mekanismen för quinolinbaserade
läkemedel är att de ansamlas i den digestiva vakuolen och interfererar med nedbrytning av
hemgruppen (En mer detaljerad beskrivning ges i avsnittet om chloroquinresistens)
(Travassos & Laufer 2014). Primaquin, används även mot hepatocyt-invaderande parasiter. I
detta avseende verkar den genom att eliminera P. ovale och P. vivax hypnozoiter som legat
vilande i hepatocyterna i syfte att förebygga återfall (Travassos & Laufer 2014).
6
Antifolater
Antifolater är en klass av antimalariska läkemedel som verkar genom att påverka bildandet av
folsyra. Interferens med folsyraproduktion leder till att DNA-syntesen påverkas. P.
falciparum har utvecklat resistens mot dessa genom att mutera gener som ger upphov till
läkemedlens målenzym, ”Dihydrofolate reductase” (DHFR) och ”Dihydropteroat syntas”
(DHPS) (Travassos & Laufer 2014).
Antimikrobiella ämnen
Antimikrobiella ämnen är ytterligare läkemedel mot malaria som verkar genom att störa den
prokaryota proteinsyntesen. Det har påvisats att dessa angriper apikoplasten, en organell som
sägs vara ett arv från en endosymbiont. Den är involverad i syntesen av vissa fettsyror som
parasiten inte själv kan syntetisera och behövs för att parasiten ska kunna överleva i
erytrocyt- och hepatocyt-stadierna (Kalanon & McFadden 2010). Eftersom att
antimikrobiella ämnen verkar långsamt används de ofta i samband med en snabbverkande
motpart, till exempel quinin. Man har än inte påvisat någon resistens mot antimikrobiella
ämnen (Travassos & Laufer 2014).
Tabell 1. Klassifikation av antimalariska läkemedel
Quinolinderivat Antifolater
Kategori av
läkemedel
Interfererar
Verkningsmekanism Angriper
parasiten under med
det
bildandet av
erytrocytiska
folsyra
stadiet
Quinin
Sulfonamider
Läkemedel som
Chloroquin,
Pyrimetamin
ingår
Primaquin,
Proguanil
Mefloquin,
Dapson
Halofantrin
Lumefantrin
Antimikrobiella
ämnen
Påverkar
prokaryotproteinsyntes
Artemisininderivat
Tetracyklin
Docycyklin
Clindamycin
Artemeter
Arteeter
Dihydroartemisinin
Artesunat
Bryter ner
peroxidbryggor
inom den digestiva
vakuolen
Artemisinin
Det var under 90- talet som parasitens resistens mot chloroquin började utbreda sig i stor
utsträckning. Detta orsakade ett behov av något mer effektivt och det var då artemisinin
började användas som alternativ. Fördelen med detta läkemedel var dess kraftfulla verkan,
samt förmågan att verka på många former av malaria (Ashley et al. 2014). Den behandling
som än idag används kallas Artemisininkombinationsterapi (AKT) och anses vara den mest
effektiva behandlingen (Patra & Srivastava 2014). Det innebär att artemesinin eller någon av
dess derivat används tillsammans med ett annat antimalariskt läkemedel. Exempelvis
använder man artesunat, ett artemisininderivat, som används tillsammans med
quonolinderivatet mefloquin (Ashley et al. 2014). Travassos & Laufer (2014) hävdar att
artemisininderivat bör intas i kombination med andra läkemedel. Syftet är att undvika att
parasiten utvecklar resistens och detta är särskilt viktigt då artemisinin är det sista effektiva
läkemedlet mot P. falciparum.
Verkningsmekanismen hos artemisininbaserade läkemedel är att binda till järn och bryta ner
peroxidbryggor inom den digestiva vakuolen. Detta ger upphov till skadliga fria radikaler
7
som påverkar parasitens proteiner (Eckstein-Ludwig et al. 2003). Artemisinin verkar mot
samtliga medlemmar av Plasmodium-släktet genom att angripa parasiten under stadiet då den
befinner sig i blodet. Det verkar snabbt och används därför tillsammans med ett läkemedel
som verkar långsammare. Effekten av denna behandling är att artemisinin snabbt slår ut
majoriteten av parasiterna medan motparten slår ut resten av överlevarna.
Kombinationsterapin innebär även att artemisinin inte måste tas i lika hög dos. Dess snabba
verkansperiod innebär att parasiterna inte exponeras för artemisinin tillräckligt länge för att
resistens ska kunna uppnå. Däremot, på grund av artemisinins korta verkansperiod måste det
möjligtvis tas oftare, vilket skulle kunna vara en bidragande faktor till att parasiten blir
resistent. (Travassos & Laufer 2014). Studier som genomförts i Kambodja har påvisat att P.
falciparum även kan vara mindre mottaglig än vanligt för artemisinin. Beviset för detta är att
kroppen tar längre tid på sig att rensa bort parasiten efter behandling och detta är kopplat till
mutationer i K13 genen (Ariey et al. 2013). Genen kodar för ett protein som kallas Kelch K13
och man har funnit att det är mutationer i proteinets propellerdomän som är kopplade till
artemisininresistensen (Ariey et al. 2013). Trots detta är den exakta mekanismen bakom
denna resistens än oklar (Travassos & Laufer 2014).
Resistens
Resistens mot nästan alla läkemedel har observerats hos P. falciparum enligt Lukens et al.
(2013) men resistens är inte enbart gynnsamt för parasiten. Lukens et al. (2013) hävdar att
populationens fitness påverkas av chloroquinresistens, då poulationen återigen utvecklar
mottaglighet för drogen i dess frånvaro. En rapport om chloroquinresistens i Malawi bekräftar
detta påstående, då parasiten återigen blev mottaglig för chloroquin, 12 år efter att
användning av drogen upphörde (Laufer et al. 2006)
Chloroquinresistens och genetik
Verkningsmekanismen för chloroquin
Den kemiska strukturen för chloroquin är en svag,
diprotisk bas (Fig 2). Läkemedlet angriper
parasiten genom att ansamlas i den digestiva
vakuolen där den tros binda till hematin, en
hydroxidform av hemgruppen som bildats via
nedbrytning av hemoglobin. Detta förhindrar sedan
kristalliseringen till hemozoin. Resultatet blir att
hemgruppen istället påverkar parasitens
enzymatiska processer och skadar parasitens
membraner (Hayward et al. 2006, Fidock et al.
2000).
Figur 2. Kemiska strukturen för chloroquin,
ett vanligt förekommande läkemedel mot
malaria.
PfCRT
Många är överens om det finns en koppling mellan chloroquinresistens och mutationer i
parasitens gen ”P. falciparum chloroquine resistance transporter” (PfCRT), som sitter på
membranet av den digestiva vakuolen (Johnson et al. 2004). Mekanismen bakom
chloroquinresistensen är inte helt känd men det har upptäckts att resistenta P. falciparum
visar lägre nivåer av chloroquin i den digestiva vakuolen. Fidock et al. (2000) framför fyra
olika anledningar till hur dessa nivåer hålls låga i vakuolen.
1) När parasiten befinner sig i blodkroppen kan den förändra hur effektivt chloroquin tas upp
8
eller strömmas ut genom sitt cytoplasmiska membran.
2) Parasiten ändrar flödet av chloroquin eller väteprotoner genom den digestiva vakuolens
membran.
3) Chloroquin kommer inte enkelt åt hematin i den digestiva vakuolen.
4) Komplexet som bildas mellan chloroquin och hematin i den digestiva vakuolen avgiftas
mer effektivt, med hjälp av enzymet glutation.
PfMDR1 likt mdr1
PfCRT är inte den enda genen som kan ge upphov till resistens. Man har visat att även andra
gener ligger bakom (Valderramos et al. 2010, Setthaudom et al. 2011). En annan gen som det
sker mycket studier på heter Plasmodium falciparum multidrug resistance protein 1
(PfMDR1). Man har visat att det sker ett samspel mellan PfCRT och PfMDR1 när parasiten
utvecklar resistens. PfMDR1 är parasitens homolog till den mänskliga genen MDR1
(Duraisingh & Cowman 2005). Hos människan kodar denna gen för ett protein som heter Pglykoprotein (PGP) och det reglerar vilka molekyler som tar sig genom blodhjärnbarriären.
Exempelvis möjliggör proteinet att glukos kan transporteras in medan toxiska ämnen
inhiberas. Däremot är ett problem med detta att PGP även kan blockera terapeutiska
läkemedel (Michael Williams, muntligen). Studierna är ense om att PfMDR1 har förmågan
att reglera till vilken grad parasiten blir chloroquinresistent (Babiker et al. 2001).
Hos P. falciparum kodar PfMDR1 för ett protein som kallas P-glykoprotein homolog 1
(PGH1). Det sitter på membranet av den digestiva vakuolen hos mogna P. falciparum och
tros ha funktionen att transportera in och ut molekyler, bland annat restprodukter av nedbrutet
globin som parasiten använder till energiförsörjning. Mänskliga tumörceller med MDR1 får
ett överuttryck av PGP och detta leder till att cellen blir resistent mot toxiska ämnen.
Tumörcellerna kan nå olika nivåer av resistens vilket beror på graden av PGP-uttryck
(Cowman et al. 1991). Till skillnad från mänskliga tumörceller har graden av PGH1-uttryck
inte samma betydelse hos P. falciparum. Cowman et al. (1991) hävdar att det sker liknande
uttryck av PGH1 hos både chloroquinresistenta och chloroquinmottagliga parasiter. Ur detta
resonerar de att ett överuttryck av PGH1 hos P. falciparum inte är essentiellt för att parasiten
ska bli resistent (Cowman et al. 1991, Gresty et al. 2014).
Resistensframkallande mutation
Studier har visat att chloroquinresistens ofta är kopplat till att kodon nummer 76 i PfCRT
muterats till K76T där lysin omvandlas till treonin. Man har kommit fram till att innehav av
K76T är nödvändigt men fortfarande inte tillräckligt i resistensutveklingen (Gresty et al.
2014, Lakshamanan et al. 2005, Berry et al. 2004). Gresty et al. (2014) hävdar att mutationer
i PfCRT skulle på ena sidan kunna bidra till resistens mot ett visst läkemedel men öka
mottagligheten för ett annat. Det har visats att parasiten blir mer mottaglig för det quinolinbaserade läkemedlet lumefantrin efter mutationen från kodon 76 till K76T (Sisowath et al.
2009).
I sydöstra Asien är resistensutvecklingen som störst. Mot P. falciparum har chloroquin ingen
signifikant verkan och därför har läkemedlet begränsats till att bekämpa P. malariae, P. ovale
ocrh P. vivax. Detta gör artemisinin, det sista effektiva läkemedlet, ytterst viktig då
befolkningen i dessa områden är starkt beroende av det (Price et al. 2004). Flera studier har
utförts i dessa områden där man fann en koppling mellan multi-drogresistens och amplifiering
av genen PfMDR1 (Pickard et al. 2003, Price et al. 1999, Wilson et al. 1993).
9
En studie genomfördes där man undersökte den huvudsakliga faktorn bakom
mefloquinresistens både in vitro och in vivo (Price et al. 2004). I studien testades även
resistensen mot andra antimalariska medel av vilka några har liknande verkningsmekanism.
Flera isolat av P. falciparum isolerades in vitro och en real-time Polymeras kedjereaktion 1
genomfördes för att amplifiera PfMDR1. Man jämförde sedan parasiter med fler PfMDR1kopior och parasiter med en enstaka kopia och hur läkemedel påverkar respektive parasit.
Isolaten delades in i två kategorier. Kategori 1 bestod av isolat där P. falciparum endast hade
en kopia på PfMDR1-genen medan kategori 2 bestod av isolat där den hade flera kopior på
genen. Price et al. (2004) lyckades sekvensera parasitgenomet ur 187 in-vitro isolat och fann
att antalet PfMDR1-kopior varierade från ett till fem (Figur 3).
3%
1%
21%
En kopia
Två kopior
46%
Tre kopior
Fyra Kopior
Fem kopior
29%
Figur 3. Fördelningen av PfMDR1-kopior från 187 isolat av malariaparasiten P.
falciparum. En in-vitro studie utfördes av Price et al. (2004) där parasiterna
genomsekvenserades och ett samband letades mellan antalet PfMDR1-kopior och
parasitens mottaglighet för läkemedel.
Följande läkemedel tillsattes till varje isolat: mefloquin, artesunat, dihydroartemisinin, quinin,
chloroquin och ytterligare halofantrin. Hos båda typerna analyserades den inhiberande
koncentrationen 50 (IC 50 ) för varje läkemedel.
Resultaten visade en högre IC 50 hos isolaten inom den andra kategorin (Tabell 2), något som
enligt utövarna av experimentet (Price et al. 2004) tyder på att P. falciparum med ett flertal
kopior av PfMDR1är mindre mottagliga för läkemedel. Exempelvis minskade mottagligheten
för mefloquin 40 gånger.
Tabell 2. Sammanställning av medelvärden på inhibitoriska koncentrationen (IC 50 ) som erhölls efter att ha
exponerat malariaparasiten Plasmodium falciparum för olika typer av läkemedel. IC 50 beskriver koncentrationen
av en given substans som krävs för att inhibera biokemiska processer hos 50 % av populationen. Två kategorier
1
Real time PCR är en variant av PCR där man observerar det amplifierade DNAt i ”verklig tid”, alltså under
procedurens gång, till skillnad från att observera det vid procedurens slut. Metoden är ett sätt att bestämma
urpsrungskoncentrationen av en specifik DNA sekvens
10
av preparat undersöktes, en där parasiten endast hade en kopia på pfdmr1 genen och en där parasiten hade fler
kopior. P värdet visar ifall det fanns signifikant skillnad på värden mellan de olika kategorierna. Omritad efter
Price et al. 2004.
Läkemedel
Mefloquin
Artesunat
Dihydroartemisinin
Quinin
Chloroquin
Halofantrin
Medelvärde på IC 50
(ng/mL) Enstaka
PfMDR1-kopia
18, 70
1,360
1,040
292,5
170,0
3,200
Medelvärde på IC 50
(ng/mL) Ökat antal
PfMDR1-kopior
64,30
2,380
1,750
556,8
127,9
13,20
P värde
I.S. = Icke signifikant
<0,001
<0,001
0,02
<0,001
IS
<0,001
de Souza et al. (2014) utförde en studie där de analyserade hur olika typer av
chloroquinanaloger som verkat mot malariainfektion hos möss skulle verka mot den
människoangripande P. falciparum. I analogerna fanns det diaminealkyn och diaminedialkyn
som extra sidokedjor och de visade sig verka mot chloroquinresistenta P.falciparum parasiter.
Ur detta drog de slutsatsen att variation av sidokedjor på den verkande molekylen kan vara av
betydelse för att bekämpa chloroquinresistens.
Det är än oklart exakt hur PfMDR1 påverkar parasitens läkemedelsresistens men det har
observerats att mutationer i kodon 86, 184, 1034, 1042 och 1246 sker i samband med det
(Gresty et al. 2014). Det verkar finnas enighet att en mutation på kodon 86 till N86Y där
asparagin omvandlas till tyrosin har en roll i utvecklingen av chloroquinresistens (Bin Dajem
& Al-Qahtani 2010, Chen et al. 2002).
Trots att P. falciparum har börjat utveckla resistens, så används chloroquinin fortfarande i
stor utsträckning i Afrika, söder om sahara. Detta tros vara på grund av läkemedlets förmåga
att temporärt hämma symtomen, samt att det inte kostar för mycket pengar (Valderramos et
al. 2010).
Resistensspridning i en plasmodium-population
Evolutionära aspekter
En viktig aspekt att ta hänsyn till när resistens ska bekämpas är förståelse av hur den sprids.
Kim (2013) hävdar att laborationsexperiment har visat att resistensinducerande mutationer i
en population sker med en hastighet på 10-8 per replikation. Detta innebär att en population på
1010 parasiter skulle innehålla 100 resistenta individer. Hos en infekterad värd som behandlats
med läkemedel skulle detta antal öka på grund av att dessa individer selekteras. Slutsatsen
som drogs utifrån detta var att ett läkemedel som införs i ett område där parasiten är endemisk
framkallar nya, resistenta parasiter. Problemet med denna teori var att den inte tog hänsyn till
hur komplex malariaparasitens livscykel är och hur läkemedel skulle verka med avseende på
detta. Vad som har visats är att trots det höga antalet merozoiter som replikeras så är det
endast ytterst få av dessa som bildar gametocyter. Därmed är sannolikheten att finna
resistenta individer bland dessa liten (Kim 2013).
Kim (2013) hävdar även att läkemedelsresistens inte enbart garanterar skydd mot att förgöras.
Fullkomlig resistens åstadkoms inte endast av en mutation i en gen. Det är snarare en process
där flera mutationer successivt äger rum. Icke-resistenta parasiter som erhåller en resistent
11
gen via mutation blir förvisso mer resistenta än icke-muterade individer, men under normala
koncentrationer av läkemedel ger även dessa efter. Kim (2013) påstår att ”intermediära”
koncentrationer låter resistenta parasiter frodas medan mottagliga parasiter drabbas av
läkemedlet.
Efter dosering kommer läkemedelskoncentrationen avta med tiden. Detta innebär att höga
koncentrationer, som annars skulle döda parasiten, så småningom kommer nå
den”intermediära nivån”, där resistenta parasiter frodas. Det blir då gynnsamt för resistenta
parasiter om läkemedlet elimineras långsamt. De får mer tid att etablera sig i kroppen medan
de mottagliga parasiterna dör. Kim (2013) föreslår att detta kan förklara varför artemisinin
var ett så pass effektivt läkemedel i över 20 år i Sydostsien, då det elimineras snabbt (Kim
2013, Hastings et al. 2002)
Konkurrens med icke-resistenta individer är ytterligare en utmaning för resistens att utvecklas
i en population i stor utsträckning. Muterade parasiter konkurreras ut av icke-muterade om
värden inte behandlats med något läkemedel.
En slutsats som kan dras från detta är att värden måste ha behandlats med läkemedel för att
resistenta parasiter ska kunna frodas. Hos en icke-behandlad värd löper de stor risk att
utkonkurreras av icke resistenta parasiter (Kim 2013).
Det är viktigt att veta hur snabbt resistensen sprids för att utveckla en effektiv
behandlingsmetod. Kim (2013) framför att detta undersöks med hjälp av evolutionär genetisk
modellering där man försöker förstå de olika faktorerna som påverkar hastigheten med vilken
resistens sprids. Dessa innefattar bland annat geografiska variabler som hur snabbt vektorn
migrerar (vilket ger en förståelse av hur snabbt sjukdomen överförs mellan olika individer)
och även patientens motståndskraft.
Diskussion
Ett flertal studier pekar på att det sker ett samspel mellan PfMDR1 och PfCRT men det är än
svårt att avgöra hur stor betydelse PfMDR1 har i resistensutvecklingen. Den exakta
mekanismen bakom många av parasitens processer är fortfarande okänd vilket onekligen är
ett stort hinder i utvecklandet av effektiva läkemedel som kan övervinna parasitens resistens.
En av svårigheterna med att överkomma problemet är att förstå exakt hur parasitens alla
gener samspelar med varandra för att framkalla resistensen och det kan möjligen dröja flera år
innan ett fastställt svar hittas, en tid under vilken sjukdomen hinner skörda många fler liv.
Däremot är ett viktigt framsteg att man i alla fall känner till hela genomet hos P. falciparum
(Cox 2010).
PfMDR1 är viktig i samband med PfCRT
Studien som genomförts av Price et al. (2004) bekräftar att PfMDR1 har betydelse i
parasitens resistensutveckling. I sin diskussion hävdar de att det finns en koppling mellan
parasitens mottaglighet för artemisinin och ökade antal PfMDR1-kopior. Eckstein-Ludwig et
al. (2003) har visat att artemisinin angriper ett enzym som kallas ”sarco/endoplasmatisk
retikulum Ca2+-ATPas (SERCA) och kodas av genen PfATP6. Hos människor har SERCA
funktionen att transportera calcium i muskelcellen när muskeln slappnar av. I samband med
PfMDR1 studerade även Price et al. (2004) polymorfism hos PfATP6 och hur det påverkade
mottagligheten för artemisinin. Deras resultat visade att polymorfism hos PfATP6 inte
orsakade några IC 50 - förändringar när parasiten exponerades. Ur detta drogs slutsatsen att
12
antalet PfMDR1-kopior är den huvudsakliga regulatorn i hur mottaglig parasiten är för
artemisinin. Berry et al. (2004) hävdar att mutation av kodon 76 i PfCRT är nödvändigt men
räcker inte för att utveckla fullständig resistens. Detta kan indikera att parasiten är starkt
beroende av PfMDR1 för att utveckla resistens.
Laufer et al. (2006) förklarade att chloroquin återigen börjat verka i Malawi tolv år efter att
dess användning upphörde. Detta fenomen skulle kunna vara viktigt i kampen mot
resistensutvecklingen. Det tyder på att resistens inte är varaktigt om förutsättningarna ändras
under tillräckligt lång tid. I detta fall försvann det resistensinducerande läkemedlet och
därmed parasitens behov att bli resistent. Däremot är det opraktiskt att vänta i tolv år att bli av
med resistens och denna metod är bara rimlig i teorin.
Ett lovande fenomen är användning av chloroquinanaloger som de Souza et al. (2014)
rapporterade om. Dessa analoger, med sidokedjor bestående av de organiska föreningarna
diaminealkyn och diaminedialkyn, kan vara viktiga i denna fråga då de visat sig verka på
chloroquinresistenta parasiter.
Som nämnt har det observerats att P. falciparum kan utveckla resistens mot artemisinin. I
västra Kambodja har man observerat en minskad effektivitet av AKT där artesunat
kombinerades med mefloquin. Man noterade att det fanns en koppling mellan ett ökat antal
PfMDR1-kopior och den minskade effektiviteten. Detta indikerar ytterligare att PfMDR1 kan
ha en viktig roll i resistensutvecklingen. Dondorp et al. (2009) antyder att det kan bero på att
man i det området länge använt artemisinin som inte kombinerats med ett annat läkemedel.
Det är möjligt att artemisininresistensen framöver kanske inte helt går att undvika men med
kontrollerat bruk av artemisinin, framförallt i kombinationsterapi, kan den möjligen regleras
till viss del.
Chloroquin användes i stor utsträckning vilket tros var en anledning till varför P. falciparum
utvecklade resistens (Wellems & Plowe 2001). Detta kan även likställas med problemet att
bakterier utvecklat antibiotikaresistens, säkerligen på grund av tillgängligheten. Med tanke på
detta finns det anledning att tro att parasiten med tiden även kommer kunna stå emot
artemisinin lika effektivt. Detta är förvisso en väldigt komplicerad fråga som troligen endast
kan besvaras med hänsyn till en stor mängd olika faktorer.
Som med andra sjukdomar försöker man idag framställa ett vaccin mot malaria. Än så länge
finns det inget effektivt vaccin mot den mänskliga varianten men i nuläget håller man på
utveckla ett som hittills gett lovande resultat. Detta vaccin, RTS,S/AS01E, baseras på protein
som uttrycks under sporozoit-, samt merozoit-stadiet, exempelvis CSP (som medierar
hepatocyt-infiltrationen) (Aguiar et al. 2012). Enligt Bejon et al. (2011) känner man även till
att antikroppar mot antigenen som parasiten har vid merozoitstadiet inhiberar erytrocytinfiltrationen, dock gäller detta in vitro.
Utöver vad som tagits upp i denna artikel finns det extremt många komplicerade fenomen om
malariaparasiten som det sker studier på. Det är mycket som fortfarande är oklart och det
finns säkerligen mycket mer att lära sig om P. falciparum. Däremot, utan de framsteg som
gjorts och den kunskapen som hittills fåtts är det troligt att dödsantalet vore ännu högre än
vad det redan är idag.
13
Tack
Tack till Martin Svenda, Moa Axelsson, Anders Ödeen, Cassandra Kestran och Isac
Söderlund för handledning och återkoppling under skrivandets gång.
Referenser
Aguiar ACC, Rocha EM, da Souza NB de França TC, Krettli AU. 2012. New approaches in
antimalarial drug discovery and development: a review. Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz 107: 831–845.
Ariey F, Witkowski B, Amaratunga C, Beghain J, Langlois A-C, Khim N, Kim S, Duru V,
Bouchier C, Ma L, Lim P, Leang R, Duong S, Sreng S, Suon S, Chuor CM, Bout DM,
Ménard S, Rogers WO, Genton B, Fandeur T, Miotto O, Ringwald P, Bras JL, Berry A,
Barale J-C, Fairhurst RM, Benoit-Vical F, Mercereau-Puijalon O, Ménard D. 2014. A
molecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria. Nature 505:
50–55.
Ashley EA, Dhorda M, Fairhurst RM, Amaratunga C, Lim P, Suon S, Sreng S, Anderson JM,
Mao S, Sam B, Sopha C, Chuor CM, Nguon C, Sovannaroth S, Pukrittayakamee S,
Jittamala P, Chotivanich K, Chutasmit K, Suchatsoonthorn C, Runcharoen R, Hien TT,
Thuy-Nhien NT, Thanh NV, Phu NH, Htut Y, Han K-T, Aye KH, Mokuolu OA,
Olaosebikan RR, Folaranmi OO, Mayxay M, Khanthavong M, Hongvanthong B, Newton
PN, Onyamboko MA, Fanello CI, Tshefu AK, Mishra N, Valecha N, Phyo AP, Nosten F,
Yi P, Tripura R, Borrmann S, Bashraheil M, Peshu J, Faiz MA, Ghose A, Hossain MA,
Samad R, Rahman MR, Hasan MM, Islam A, Miotto O, Amato R, MacInnis B, Stalker J,
Kwiatkowski DP, Bozdech Z, Jeeyapant A, Cheah PY, Sakulthaew T, Chalk J, Intharabut
B, Silamut K, Lee SJ, Vihokhern B, Kunasol C, Imwong M, Tarning J, Taylor WJ, Yeung
S, Woodrow CJ, Flegg JA, Das D, Smith J, Venkatesan M, Plowe CV, Stepniewska K,
Guerin PJ, Dondorp AM, Day NP, White NJ. 2014. Spread of Artemisinin Resistance in
Plasmodium falciparum Malaria. The New England Journal of Medicine 371: 411–423.
Babiker HA, Pringle SJ, Abdel-Muhsin A, Mackinnon M, Hunt P, Walliker D. 2001. HighLevel Chloroquine Resistance in Sudanese Isolates of Plasmodium falciparum Is
Associated with Mutations in the Chloroquine Resistance Transporter Gene pfcrt and the
Multidrug Resistance Gene pfmdr1. The Journal of Infectious Diseases. 183: 1535–1538.
Bejon, P, Cook J., Bergmann-Leitner E, Olotu A, Lusingu J, Mwacharo J, Vekemans J,
Njuguna P, Leach A, Lievens M, Dutta S, von Seidlein L, Savarese B, Villafana T,
Lemnge MM, Cohen J, Marsh K, Corran PH, Angov E, Riley EM, Drakeley CJ. 2011.
Effect of the Pre-erythrocytic Candidate Malaria Vaccine RTS,S/AS01E on Blood Stage
Immunity in Young Children. The Journal of Infectious Diseases. 204: 9–18.
Berry A, Vessière A, Fabre R, Benoit-Vical F, Marchou B, Massip P, Magnaval J-F. 2004.
Pfcrt K76T mutation and its associations in imported Plasmodium falciparum malaria
cases. Infection, Genetics and Evolution. 4: 361-364.
Bin Dajem SM, Al-Qahtani A. 2010. Analysis of gene mutations involved in chloroquine
resistance in Plasmodium falciparum parasites isolated from patients in the southwest of
Saudi Arabia. Annals of Saudi Medicine 30: 187-192.
Bobenchik AM, Witola WH, Augagneur Y, Nic Lochlainn L., Garg A., Pachikara N., Choi
J.-Y., Zhao YO, Usmani-Brown S, Lee A, Adjalley, SH, Samanta S, Fidock DA, Voelker
DR, Fikrig E, Ben Mamoun C. 2013. Plasmodium falciparum phosphoethanolamine
methyltransferase is essential for malaria transmission. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 110: 18262–18267.
Centers for Disease Control and Prevention. Biology WWW-dokument 2012-11-09:
http://www.cdc.gov/malaria/about/biology/index.html. Hämtad 2014-12-02.
14
Centers for Disease Control and Prevention. Malaria Parasites WWW dokument 2012-11-09:
http://www.cdc.gov/malaria/about/biology/parasites.html. Hämtad 2014-11-20.
Centers for Disease Control and Prevention. Elimination of Malaria in the United States
(1947-1951). WWW-dokument 2012-1109: http://www.cdc.gov/malaria/about/history/elimination_us.html. Hämtad 2014-12-02.
Centers for Disease Control and Prevention. Disease. WWW-dokument 2012-1109: http://www.cdc.gov/malaria/about/disease.html. Hämtad 2014-12-02.
Chen N, Russell B, Fowler E, Peters J, Cheng Q. 2002. The Journal of Infectious Diseases
185: 405-406.
Coppi A, Pinzon-Ortiz C, Hutter C, Sinnis P. 2005. The Plasmodium circumsporozoite
protein is proteolytically processed during cell invasion. The Journal of Experimental
Medicine 201: 27–33.
Cowman AF, Karcz S, Galatis D, Culvenor JG. 1991. A P-glycoprotein Homologue of
Plasmodium falciparum Is Localized on the Digestive Vacuole. The Journal of Cell
Biology 113: 1033-1042.
Cox FE. 2010. History of the discovery of the malaria parasites and their vectors. Parasites &
Vectors 3: 5.
Culleton RL, Mita T, Ndounga M, Unger H, Cravo PV, Paganotti GM, Takahashi N, Kaneko
A, Eto H, Tinto H, Karema C, D’Alessandro U, do Rosário V, Kobayakawa T, Ntoumi F,
Carter R, Tanabe K. 2008. Failure to detect Plasmodium vivax in West and Central Africa
by PCR species typing. Malaria Journal 7: 174.
Dasari P, Reiss K, Lingelbach K, Baumeister S, Lucius R, Udomsangpetch R, Bhakdi SC,
Bhakdi S. 2011. Digestive vacuoles of Plasmodium falciparum are selectively
phagocytosed by and impair killing function of polymorphonuclear leukocytes. Blood 118:
4946–4956.
Davies TGE, Field LM, Usherwood PNR, Williamson MS. 2007. DDT, pyrethrins,
pyrethroids and insect sodium channels. IUBMB Life 59: 151–162.
Day N.P., Phu N.H., Mai N.T., Chau T.T., Loc P.P., Chuong L.V., Sinh D.X., Holloway P.,
Hien T.T., White N.J. 2000. The pathophysiologic and prognostic significance of acidosis
in severe adult malaria. Critical Care Medicine. 28: 1833–1840.
de Souza NB, Carmo AM, da Silva AD, França TC, Krettli AU. 2014. Antiplasmodial
activity of chloroquine analogs against chloroquine-resistant parasites, docking studies and
mechanisms of drug action. Malaria Journal 13: 469.
Dondorp AM, Fanello CI, Hendriksen IC, Gomes E, Seni A, Chhaganlal KD, Bojang K,
Olaosebikan R, Anunobi N, Maitland K, Kivaya E, Agbenyega T, Nguah SB, Evans J,
Gesase S, Kahabuka C, Mtove G, Nadjm B, Deen J, Mwanga-Amumpaire J, Nansumba
M, Karema C, Umulisa N, Uwimana A, Mokuolu OA, Adedoyin OT, Johnson WB,
Tshefu, AK, Onyamboko MA, Sakulthaew T, Ngum WP, Silamut K, Stepniewska K,
Woodrow CJ, Bethell D, Wills B, Oneko M, Peto TE, von Seidlein L, Day NP, White NJ.
2010. Artesunate versus quinine in the treatment of severe falciparum malaria in African
children (AQUAMAT): an open-label, randomised trial. The Lancet 376: 1647–1657.
Dondorp AM, Nosten F, Yi P, Das D, Phyo AP, Tarning J, Lwin KM, Ariey F,
Hanpithakpong W, Lee SJ, Ringwald P, Silamut K, Imwong M, Chotivanich K, Lim P,
Herdman T, An SS, Yeung S, Singhasivanon P, Day NPJ, Lindegardh N, Socheat D,
White NJ. 2009. Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Malaria. The New
England Journal of Medicine 361: 455–467.
Eckstein-Ludwig U, Webb RJ, van Goethem IDA. East JM, Lee AG, Kimura M, O’Neill PM,
Bray PG, Ward SA, Krishna S. 2003. Artemisinins target the SERCA of Plasmodium
falciparum. Nature 424: 957–961.
Ekvall H. 2003. Malaria and anemia. Current Opinion in Hematology. 10: 108–114.
15
Fidock DA, Nomura T, Talley AK, Cooper RA, Dzekunov SM, Ferdig MT, Ursos LMB,
Sidhu A bir S, Naude B, Deitsch KW, Su X, Wootton JC, Roepe PD, Wellems TE. 2000.
Mutations in the P. falciparum Digestive Vacuole Transmembrane Protein PfCRT and
Evidence for Their Role in Chloroquine Resistance. Molecular Cell 6: 861–871.
Gaur D, Storry JR, Reid ME, Barnwell JW, Miller LH. 2003. Plasmodium falciparum Is Able
To Invade Erythrocytes through a Trypsin-Resistant Pathway Independent
of Glycophorin B. Infection and Immunity 71: 6742–6746.
Gething PW, Patil AP, Smith DL, Guerra CA, Elyazar IR, Johnston GL, Tatem AJ, Hay SI.
2011. A new world malaria map: Plasmodium falciparum endemicity in 2010. Malaria
Journal 10: 378.
Girod R, Gaborit P, Carinci R, Issaly J, Fouque F. 2008. Anopheles darlingi bionomics and
transmission of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Plasmodium malariae in
Amerindian villages of the Upper-Maroni Amazonian forest, French Guiana. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz 103: 702–710.
Gresty KJ, Gray K-A, Bobogare A, Taleo G, Hii J, Wini L, Cheng Q Waters NC. 2014.
Genetic mutations in pfcrt and pfmdr1 at the time of artemisinin combination therapy
introduction in South Pacific islands of Vanuatu and Solomon Islands. Malaria Journal 13:
406.
Hardison, RC, 2012. Evolution of Hemoglobin and Its Genes. Cold Spring Harbor
Perspectives in Medicine 12: doi:10.1101/cshperspect.a011627
Hastings IM, Watkins WM, White NJ. 2002. The evolution of drug-resistant malaria: the role
of drug elimination half-life. Philosophical Transactions of the Royal Society B:
Biological Sciences 357: 505–519.
Hayward R, Saliba KJ, Kirk K. 2006. The pH of the digestive vacuole of Plasmodium
falciparum is not associated with chloroquine resistance. Journal of Cell Science 119:
1016–1025.
Holt RA, Subramanian GM, Halpern A, Sutton GG, Charlab R, Nusskern DR, Wincker P,
Clark AG, Ribeiro JC, Wides R, Salzberg SL, Loftus B, Yandell M, Majoros WH, Rusch
DB, Lai Z, Kraft CL, Abril JF, Anthouard V, Arensburger P, Atkinson PW, Baden H, de
Berardinis V, Baldwin D, Benes V, Biedler J, Blass C, Bolanos R, Boscus D, Barnstead
M, Cai S, Center A, Chatuverdi K, Christophides GK, Chrystal MA, Clamp M, Cravchik
A, Curwen V, Dana A, Delcher A, Dew I, Evans CA, Flanigan M, GrundschoberFreimoser A, Friedli L, Gu Z, Guan P, Guigo R, Hillenmeyer ME, Hladun SL, Hogan JR,
Hong YS, Hoover J, Jaillon O, Ke Z, Kodira C, Kokoza E, Koutsos A, Letunic I, Levitsky
A, Liang Y, Lin J-J, Lobo NF, Lopez JR, Malek JA, McIntosh TC, Meister S, Miller J,
Mobarry C, Mongin E, Murphy SD, O’Brochta DA, Pfannkoch C, Qi R, Regier MA,
Remington K, Shao H, Sharakhova MV, Sitter CD, Shetty J, Smith TJ, Strong R, Sun J,
Thomasova D, Ton LQ, Topalis P, Tu Z, Unger MF, Walenz B, Wang A, Wang J, Wang
M, Wang X, Woodford KJ, Wortman JR, Wu M, Yao A, Zdobnov EM, Zhang H, Zhao Q,
Zhao S, Zhu SC, Zhimulev I, Coluzzi M, della Torre A, Roth CW, Louis C, Kalush F,
Mural RJ, Myers EW, Adams MD, Smith HO, Broder S, Gardner MJ, Fraser CM, Birney
E, Bork P, Brey PT, Venter JC, Weissenbach J, Kafatos FC, Collins FH, Hoffman SL.
2002. The Genome Sequence of the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. Science 298:
129–149.
Hosseini SM, Feng JJ, 2012. How Malaria Parasites Reduce the Deformability of Infected
Red Blood Cells. Biophysical Journal 103: 1–10.
Idro R, Marsh K, John CC, Newton CRJ. 2010. Cerebral Malaria: Mechanisms of Brain
Injury and Strategies for Improved Neurocognitive Outcome. Pediatric Research 68: 267–
274.
16
Imwong M, Snounou G, Pukrittayakamee S, Tanomsing N, Kim JR, Nandy A, Guthmann JP, Nosten F, Carlton J, Looareesuwan S, Nair S, Sudimack D, Day NPJ, Anderson TJC,
White NJ. 2007. Relapses of Plasmodium vivax Infection Usually Result from Activation
of Heterologous Hypnozoites. The Journal of Infectious Diseases. 195: 927–933.
Johnson DJ, Fidock DA, Mungthin M, Lakshmanan V, Sidhu ABS, Bray PG, Ward SA.
2004. Evidence for a Central Role for PfCRT in Conferring Plasmodium falciparum
Resistance to Diverse Antimalarial Agents. Molecular Cell 15: 867–877.
Kalanon M, McFadden GI. 2010. Malaria, Plasmodium falciparum and its apicoplast.
Biochemical Society Transactions 38: 775-782.
Kanza JPB, El Fahime E, Alaoui S, Essassi EM, Brooke B, Malafu AN, Tezzo, FW. 2013.
Pyrethroid, DDT and malathion resistance in the malaria vector Anopheles gambiae from
the Democratic Republic of Congo. Transactions of the Royal Society of Tropical
Medicine Hygiene 107: 8–14.
Kim Y, Schneider KA. 2013. Evolution of Drug Resistance in Malaria Parasite. Nature
Education WWWdokument: http://www.nature.com/scitable/knowledge/library/evolution-of-drugresistance-in-malaria-parasite-96645809. Hämtad 2015-01-15.
Kumar S, Kumari R, Pandey R. 2014. New insight-guided approaches to detect, cure, prevent
and eliminate malaria. Protoplasma, doi 10.1007/s00709-014-0697-x
Lakshamanan V, Bray PG, Verdier-Pinard D, Johnson DJ, Horrocks P, Muhle RA, Alakpa
GE, Hughes RH, Ward SA, Krogstad DJ, Sidhu ABS, Fidock DA. 2005. A critical role for
PfCRT K76T in Plasmodium falciparum verapamil-reversible chloroquine resistance. The
EMBO Journal 24: 2294–2305.
Laufer MK, Thesing PC, Eddington ND, Masonga R, Dzinjalamala FK, Takala SL, Taylor
TE, Plowe CV. 2006. Return of Chloroquine Antimalarial Efficacy in Malawi. The New
England Journal of Medicine 355: 1959–1966.
Lee K-S, Divis PCS, Zakaria SK, Matusop A, Julin RA, Conway DJ, Cox-Singh J, Singh B.
2011. Plasmodium knowlesi: Reservoir Hosts and Tracking the Emergence in Humans and
Macaques. PLOS Pathogens, doi 10.1371/journal.ppat.1002015.
Lindsay S, Ansell J, Selman C, Cox V, Hamilton K, Walraven G. 2000. Effect of pregnancy
on exposure to malaria mosquitoes. The Lancet 355: 1972.
Lukens AK, Ross LS, Heidebrecht R, Gamo FJ, Lafuente-Monasterio MJ, Booker ML, Hartl
DL, Wiegand RC, Wirth DF. 2014. Harnessing evolutionary fitness in Plasmodium
falciparum for drug discovery and suppressing resistance. Proceedings of the National
Academy of Sciences 111: 799–804.
Maubert B, Fievet N, Tami G, Boudin C, Deloron P. 2000. Cytoadherence of Plasmodium
falciparum-infected erythrocytes in the human placenta. Parasite Immunology 22: 191–
199.
Marti M, Good RT, Rug M, Knuepfer E, Cowman AF. 2004. Targeting Malaria Virulence
and Remodeling Proteins to the Host Erythrocyte. Science 306: 1930–1933.
Mekonnen SK, Aseffa A, Medhin G, Berhe N, Velavan TP. 2014. Re-evaluation of
microscopy confirmed Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax malaria by nested
PCR detection in southern Ethiopia. Malaria Journal 13: 48.
Ménard R, Sultan AA, Cortes C, Altszuler, van Dijk MR, Janse CJ, Nussenzweig V. 1997.
Circumsporozoite protein is required for development of malaria sporozoites in
mosquitoes. Nature 385: 336-40
Miller, LH, Ackerman HC, Su X, Wellems TE. 2013. Malaria biology and disease
pathogenesis: insights for new treatments. Nature Medicine 19: 156–167.
17
Morahan BJ, Strobel C, Hasan U, Czesny B, Mantel P-Y, Marti M, Eksi S, Williamson K.C
2011. Functional Analysis of the Exported Type IV HSP40 Protein PfGECO in
Plasmodium falciparum Gametocytes ▿. Eukaryotic Cell 10: 1492–1503.
Mota MM, Pradel G, Vanderberg JP, Hafalla JCR, Frevert U, Nussenzweig RS, Nussenzweig
V, Rodrı́guez A. 2001. Migration of Plasmodium Sporozoites Through Cells Before
Infection. Science 291: 141–144.
National Pesticide Information Center. 1999. DDT. WWW dokument:
http://npic.orst.edu/factsheets/ddtgen.pdf. Hämtad 2014-12-06
Orjih AU. 2014. Maturation of Plasmodium falciparum in multiply infected erythrocytes and
the potential role in malaria pathogenesis. Parasitology Research 113: 4045–4056.
Patra N, Srivastava AK. 2014. Enhanced Production of Artemisinin by Hairy Root
Cultivation of Artemisia annua in a Modified Stirred Tank Reactor. Applied Biochemistry
and Biotechnology 174: 2209–2222.
Pickard AL, Wongsrichanalai C, Purfield A, Kamwendo D, Emery K, Zalewski C,
Kawamoto F, Miller RS, Meshnick SR. 2003. Resistance to Antimalarials in Southeast
Asia and Genetic Polymorphisms in pfmdr1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47:
2418–2423.
Piper KP, Hayward RE, Cox MJ, Day KP. 1999. Malaria Transmission and Naturally
Acquired Immunity to PfEMP-1. Infection and Immunity 67: 6369–6374.
Price RN, Cassar C, Brockman A, Duraisingh M, van Vugt M, White NJ, Nosten F, Krishna
S. 1999. The pfmdr1 Gene Is Associated with a Multidrug-Resistant Phenotype in
Plasmodium falciparumfrom the Western Border of Thailand. Antimicrobial Agents
Chemotherapy 43: 2943–2949.
Price RN, Uhlemann A-C, Brockman A, McGready R, Ashley E, Phaipun L, Patel R, Laing
K, Looareesuwan S, White NJ, Nosten F, Krishna S. 2004. Mefloquine resistance in
Plasmodium falciparum and increased pfmdr1 gene copy number. The Lancet 364: 438–
447.
Rasti N, Wahlgren M, Chen Q. 2004. Molecular aspects of malaria pathogenesis. FEMS
Immunology & Medical Microbiology 41: 9–26.
Russell B, Suwanarusk R, Borlon C, Costa FTM, Chu CS, Rijken MJ, Sriprawat K, Warter
L, Koh EGL, Malleret B, Colin Y, Bertrand O, Adams JH, D’Alessandro U, Snounou G,
Nosten F, Rénia L. 2011. A reliable ex vivo invasion assay of human reticulocytes by
Plasmodium vivax. Blood, doi 10.1182/blood-2011-04-348748.
Saliba KJ, Allen RJW, Zissis S, Bray PG, Ward SA, Kirk K. 2003. Acidification of the
Malaria Parasite’s Digestive Vacuole by a H+-ATPase and a H+-pyrophosphatase. The
Journal of Biological Chemistry 278: 5605–5612.
Sasi P, Burns SP, Waruiru C, English M, Hobson CL, King CG, Mosobo M, Beech JS, Iles
RA, Boucher BJ, Cohen RD. 2007. Metabolic Acidosis and Other Determinants of
Hemoglobin-Oxygen Dissociation in Severe Childhood Plasmodium falciparum Malaria.
The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 77: 256–260.
Schellenberg D, Menendez C, Kahigwa E, Font F, Galindo C, Acosta C, Schellenberg JA,
Aponte JJ, Kimario J, Urassa H, Mshinda H, Tanner M, Alonso P. 1999. African children
with malaria in an area of intense Plasmodium falciparum transmission: features on
admission to the hospital and risk factors for death. The American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene 61: 431–438.
Setthaudom C, Tan-ariya P, Sitthichot N, Khositnithikul R, Suwandittakul N, Leelayoova S,
Mungthin M. 2011. Role of Plasmodium falciparum Chloroquine Resistance Transporter
and Multidrug Resistance 1 Genes on In Vitro Chloroquine Resistance in Isolates of
Plasmodium falciparum from Thailand. The American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene 85: 606–611.
18
Singh S, Mann B. 2013. Insect bite reactions. Indian Journal of Dermatology, Venereology,
and Leprology 79: 151.
Sinka ME, Bangs MJ, Manguin S, Rubio-Palis Y, Chareonviriyaphap T, Coetzee M, Mbogo
CM, Hemingway J, Patil AP, Temperley WH, Gething PW, Kabaria CW, Burkot TR,
Harbach RE, Hay SI. 2012. A global map of dominant malaria vectors. Parasites &
Vectors 5: 69.
Sinka ME, Rubio-Palis Y, Manguin S, Patil AP, Temperley WH, Gething PW, Boeckel TV,
Kabaria CW, Harbach RE, Hay SI. 2010. The dominant Anopheles vectors of human
malaria in the Americas: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites
& Vectors 3: 72.
Sisowath C, Peresen I, Veiga MI, Mårtensson A, Premji Z, Björkman A, Fidock DA, Gil JP.
2009. In Vivo Selection of Plasmodium falciparum Parasites Carrying the ChloroquineSusceptible pfcrt K76 Allele after Treatment with Artemether-Lumefantrine in Africa. The
Journal of Infectious Diseases 199: 750-757.
Storm J, Craig AG. 2014. Pathogenesis of cerebral malaria—inflammation and
cytoadherence. Frontiers in Cellular Infection Microbiology, doi
10.3389/fcimb.2014.00100.
Trampuz A, Jereb M, Muzlovic I, Prabhu RM. 2003. Clinical review: Severe malaria. Critical
Care 7: 315–323.
Travassos M, Laufer MK. Antimalarial drugs: An overview. WWW dokument 2014-07-31:
http://www.uptodate.com/contents/antimalarial-drugs-an-overview. Hämtad 2014-12-01
Valderramos SG, Valderramos J-C, Musset L, Purcell LA, Mercereau-Puijalon O, Legrand E,
Fidock DA. 2010. Identification of a Mutant PfCRT-Mediated Chloroquine Tolerance
Phenotype in Plasmodium falciparum. PLOS Pathogens, doi
10.1371/journal.ppat.1000887.
Wangmaung N, Chomean S, Promptmas C, Mas-oodi S, Tanyong D, Ittarat W. 2014. Silver
quartz crystal microbalance for differential diagnosis of Plasmodium falciparum and
Plasmodium vivax in single and mixed infection. Biosensors & Bioelectronics 62: 295–
301.
Wellems TE, Plowe CV. 2001. Chloroquine-Resistant Malaria. The Journal of Infectious
Diseases 184: 770-776.
World Health Organization (WHO). 2014. Malaria. WWW-dokument:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/en/. Hämtad 2014-11-20.
World Health Organization (WHO). 2013. World Malaria Report 2013. WWW-dokument:
http://www.who.int/malaria/publications/world_malaria_report_2013/report/en/. Hämtad
2014-11-20.
Yadouleton AW, Padonou G, Asidi A, Moiroux N, Bio-Banganna S, Corbel V, N’guessan R,
Gbenou D, Yacoubou I, Gazard K, Akogbeto MC. 2010. Insecticide resistance status in
Anopheles gambiae in southern Benin. Malaria Journal 9: 83.
Yipp BG, Anand S, Schollaardt T, Patel KD, Looareesuwan S, Ho M. 2000. Synergism of
multiple adhesion molecules in mediating cytoadherence of Plasmodium falciparum–
infected erythrocytes to microvascular endothelial cells under flow. Blood 96: 2292–2298.
19
Malariaparasitens resistens mot läkemedel: etisk bilaga
William Ondusye
Självständigt arbete i biologi 2014
Huvudsakliga etiska problematiken
Malaria har länge varit ett problem och ännu värre är att parasiten nu utvecklat resistens mot
vanliga läkemedel som chloroquin. Jag anser att den huvudsakliga etiska frågan handlar om
problemet med att fattigt folk drabbas hårdast av malaria.
Människans ansvar
Det sker mycket studier kring chloroquin, ett läkemedel som den dödligaste varianten av
malaria (P. falciparum) utvecklat resistens mot. Artemisinin används som det sista effektiva
läkemedlet mot denna parasit och det stora problemet ligger i att många inte har råd till det.
Detta är ett bra exempel på hur rika människor har rätten till lämplig vård medan de fattiga
människorna dör. Å andra sidan är det förståerligt att ett läkemedel som kostar mer att
framställa kommer bli dyrare för konsumenten, framförallt i en vinstorienterad värld.
Globalt
Ur ett globalt perspektiv kan man även ifrågasätta vilket ansvar västvärlden har i det hela.
Stora insatser gjordes på 50-talet för att utrota sjukdomen från västerländska länder och
resultatet blev framgångsrikt. Nuförtiden är problemet som störst i afrika och det är sällan
som västvärlden förknippas med termen ’malaria’. Av ren medmänsklighet anser jag att
västvärlden har ett ansvar att bidra till att lösa problemet. Ingen väljer att födas under svåra
omständigheter men alla kan bidra till att lätta på dem. Sedan är vissa länder även viktiga för
export av mat och råvaror vilket kan vara en anledning att se till deras välmående.
Forskning
Man har hittat kopplingar mellan olika gener och resistens mot dessa läkemedel men det
återstår fortfarande mycket att förstå kring den exakta resistensmekanismen, då den visat sig
vara ytterst komplicerad. Jag anser att myndigheter bör ta ansvaret att lägga ner pengar på
forskning kring parasitens genetik, då svaren på oklarheterna möjligen finns just där. Det kan
ta ett tag innan ett konkret svar fastställts men om det är möjligt att lätta på situationen för
framtida generationer anser jag att det är en klar nödvändighet.
Forskningsetik
Frågan jag har valt att undersöka (huruvida en specifik gen har påverkan i malariaparasitens
resistensutveckling) är väldigt komplicerad och måste troligen besvaras med hänsyn till flera
olika aspekter. Därför har jag använt mig av väldigt många källor för att göra en rimlig
bedömning av olika processer. Databaser som använts är Web of Science och Pubmed som
ofta hänvisar till välkända tidsskrifter såsom Nature, Science och, särskilt relevant för detta
ämne, Malaria Journal. Översiktsartiklar har jag använt för att ge en inblick i hur processer
som till exempel livscykeln funkar och detta har de tidsskrifter som nämnts ovan publicerat
väldigt bra översiktsartiklar på. Många av översiktsartiklarna hänvisar ofta till kända namn
inom ämnet vilket bidrar till trovärdigheten. Utöver detta har jag även använt mig av
orginalartiklar för att granska data direkt från studier.
20