Lab farmakogenetik –
Genotypning av antal UGT2B17 kopior
Bakgrund farmakogenetik
Genetiska variationer, polymorfier, förekommer i flera av våra gener och kan påverka
fenotypen, t ex transkriptionsaktiviteten, protein expression, enzymaktivitet etc. Den allra
vanligaste formen av genetisk polymorfi är ”single nucleotide polymorphsim” (SNP), dvs
en DNA-bas i genen är utbytt. Om en SNP byter ut en aminosyra kan proteinets funktion
ändras, enzym aktiviteten och/eller protein uttrycket ändras. Vissa gener kan man ha
olika antal kopior av (copy number variation), vilket också kan påverka enzym aktivitet.
Genetiska variationer i läkemedels metaboliserande enzymer kan påverka hur individer
reagerar på olika läkemedel (farmakogenetik). Genotypning av patienter är numera rutin
på kliniska farmakologiska laboratorier. Flera läkemedel metaboliseras av cytochrome P
450 enzymer (CYP). Det finns flera olika CYP familjer, de viktigaste inom
farmakogenetiken är CYP2D6, CYP2C9 och CYP2C19. Det är framförallt nedbrytning
av psykofarmaka som påverkas av dessa polymorfier, men även andra läkemedel.
Genotypning av dessa enzymer sker främst retrospektivt i utredningssyfte.
Genotypning av tiopurinmetyltransferas (TPMT) görs innan behandling med azatioprin
för att justera dos. HLAB5701 genotypning görs innan HIV-behandling med abakavir då
5-8 procent av befolkningen har en genotyp som ger svåra biverkningar av preparatet,
och bör således erbjudas alternativ behandling.
UGT2B17
Genetiska variationer kan även ha betydelse vid farmakologisk testning av otillåtna
preparat. Men än så länge finns det väldigt lite kliniskt studerat om hur genetiken
påverkar metabolismen och utsöndringen av olika droger. Vår forskargrupp upptäckte att
de individer som saknar genen UGT2B17 (och således saknar UGT2B17 enzymet)
utsöndrar väldigt lite testosteron i urinen jämfört med dem som har en eller två UGT2B17
alleler (UGT2B17 är det enzymet som i huvudsak gör testosteronet vattenlösligt). Det
visade sig att när vi testosteron dopade frivilliga försökspersoner så kom de som saknade
UGT2B17 genen inte upp till de av world against doping agency (WADA) uppsatta
gränsvärdena. I framtiden kan genetisk testning även bli aktuellt vid tester av otillåtna
medel för att öka känsligheten.
Analysprincip – genotypning av antal genkopior
Genomisk DNA extraheras från helblod. Det färdig preppade DNAt används sedan i en
genotypningsreaktion:
Genotypningen utförs med en realtids PCR där produktbildningen genererar
flouroscerande signal. I PCR reaktion ingår genspecifika primers (en sense och en
antisense) samt en prober. Proberna är märkt med en fluorescerande reporterfärg i ena
ändan. När DNA syntesen av nya DNA kedjor (elongeringen) sker, degraderar Taq-
polymeraset den bundna proben varvid flouroscens signal avges. Den flouroscerande
signalen kan detekteras och följas i en PCR-kurva i real time PCR instrument.
.
Den erhållna fluorescensignalen är proportionell mot mängden DNA templat. Dvs de
med två UGT2B17 gener får högre signal än de med en UGT2B17 genkopia. De som helt
saknar genen avger ingen signal. Olikheter i PCR-signalen kan förutom antal gener även
påverkas av mängd och kvalitet av DNA templatet i reaktionen. Även om man mäter
DNA konc och tillsätter exakt samma mängd DNA kan signalen variera då genomiskt
DNA även kan innehålla inhibitoriska ämnen. För att korrigera för dessa olikheter
använder man alltid vid kvantitativ PCR en kontrollgen som man normaliserar mot.
Dessa är ofta sk ”housekeeping” gener, dvs gener som alla uttrycker och som inte ska
variera mellan individer. Vid denna analys använder vi albumin som kontrollgen, och kör
således en reaktion med albumin specifika primer och probe. Vid kvantifieringen
normalisera signalerna från UGT2B17 reaktionen med albumin signalen. Denna
uträkning kan göras på olika sätt, men vanligast är att man använder sk delta delta Ctformeln.
Utförande
1.Stick dig själv eller låt en kompis sticka dig i fingret. Med pipett sug upp 10-50 ul blod i ett
eppendorf rör märkt med ditt namn. Fyll upp röret med PBS för att en slutvolym på 200 ul.
Preppa DNA enligt protokoll QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook;
2. Pipet 20 μl QIAGEN Protease (or proteinase K) into the tube.
It is important to ensure proper mixing after adding the enzyme.
Blood or Body Fluidpin Protocol
3. Add 200 μl Buffer AL to the sample. Mix by pulse-vortexing for 15 s.
In order to ensure efficient lysis, it is essential that the sample and Buffer AL are
mixed thoroughly to yield a homogeneous solution.
4. Incubate at 56°C for 10 min.
DNA yield reaches a maximum after lysis for 10 min at 56°C. Longer incubation
times have no effect on yield or quality of the purified DNA.
5. Briefly centrifuge the 1.5 ml microcentrifuge tube to remove drops from the inside
of the lid.
6. Add 200 μl ethanol (96–100%) to the sample, and mix again by pulse-vortexing
for 15 s. After mixing, briefly centrifuge the 1.5 ml microcentrifuge tube to remove
drops from the inside of the lid.
7. Carefully apply the mixture from step 6 to the QIAamp Mini spin column (in a 2 ml
collection tube) without wetting the rim. Close the cap, and centrifuge at 6000 x g
(8000 rpm) for 1 min. Place the QIAamp Mini spin column in a clean 2 ml collection
tube (provided), and discard the tube containing the filtrate.*
Close each spin column in order to avoid aerosol formation during centrifugation.
Centrifugation is performed at 6000 x g (8000 rpm) in order to reduce noise.
Centrifugation at full speed will not affect the yield or purity of the DNA. If the
lysate has not completely passed through the column after centrifugation,
centrifuge again at higher speed until the QIAamp Mini spin column is empty.
8. Carefully open the QIAamp Mini spin column and add 500 μl Buffer AW1 without
wetting the rim. Close the cap and centrifuge at 6000 x g (8000 rpm) for 1 min.
Place the QIAamp Mini spin column in a clean 2 ml collection tube (provided), and
discard the collection tube containing the filtrate.
Blood or Body Fluid
9. Carefully open the QIAamp Mini spin column and add 500 μl Buffer AW2
without wetting the rim. Close the cap and centrifuge at full speed (20,000 x g;
14,000 rpm) for 3 min.
10. Recommended: Place the QIAamp Mini spin column in a new 2 ml collection tube
(not provided) and discard the old collection tube with the filtrate. Centrifuge at full
speed for 1 min.
This step helps to eliminate the chance of possible Buffer AW2 carryover.
11. Place the QIAamp Mini spin column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube (not
provided), and discard the collection tube containing the filtrate. Carefully open
the QIAamp Mini spin column and add 100 μl Buffer AE or distilled water.
Incubate at room temperature (15–25°C) for 1 min, and then centrifuge at
6000 x g (8000 rpm) for 1 min.
A 200 μl sample of whole human blood (approximately 5 x 106 leukocytes/ml)
typically yields 6 μg of DNA in 200 μl water (30 ng/μl) with an A260/A280 ratio of
1.7–1.9.
12. Mät DNA konc på spectrofotometern. Späd med vatten till 10 ng/ul.
13. I en förberedd taqman platta innehållande reaktionsmix för UGT2B17 och albumin
enligt nedan tillsätts 2 ul (20 ng DNA).
Platta 1 (1-12)
1
1
1
9
2
2
2
10
3
3
3
11
4
4
4
12
5
5
5
6
6
6
Ins/del
7
7
7
Ins/ins
8
8
8
NTC
UGT2B17 specifik reaktion
reaktion
Platta 2 (13-24)
13
13
13
21
14
14
14
22
15
15
15
23
16
16
16
24
17
17
17
18
18
18
Ins/del
19
19
19
Ins/ins
20
20
20
NTC
UGT2B17 specifik reaktion
9
10
11
12
9
10
11
12
1
2
3
4
5
Ins/del Ins/del 6
Ins/ins Ins/ins 7
NTC
NTC
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
21
22
23
24
21
22
23
24
Ins/del
Ins/ins
NTC
Ins/del
Ins/ins
NTC
13
14
15
16
17
18
19
20
13
14
15
16
17
18
19
20
13
14
15
16
17
18
19
20
9
10
11
12
9
10
11
12
9
10
11
12
Ins/del Ins/del Ins/del
Ins/ins Ins/ins Ins/ins
NTC
NTC
NTC
Albumin specifik
21
22
23
24
21
22
23
24
21
22
23
24
Ins/del Ins/del Ins/del
Ins/ins Ins/ins Ins/ins
NTC
NTC
NTC
Albumin specifik reaktion
Plattan innehåller 18 ul reaktionsmix/brunn.
Plattan körs på realtids PCR över natt.
Dag 2.
Genomgång av körningen och uträkning av antal UGT2B17 genkopior.
Antal genkopior räknas ut med delta delta Ct-metoden manuellt och jämförs med
resultatet från mjukvarans uträkningar.
