Screening av fetalt RHD
i maternell plasma
Åsa Hellberg
BMA, PhD
Klinisk immunologi och transfusionsmedicin
Labmedicin Skåne
När används blodgruppsgenomisk typning?
• oberoende analys vid oklara serologiska resultat
• alternativ till fenotypning om patienten har fått blod (s.k. transfusionsblandbild)
eller är positiv med direkt agglutinationsteknik (DAT)
• bekräftelse av homozygoti hos:
• givare av testerytrocyter,
• den blivande pappan för att bedöma risken att fostret kommer att ärva
antigenet som mamman är immuniserad mot.
• alternativ när blod ej finns tillgängligt
• bestämning av fosterblodgrupp
• foster till immuniserad, gravid kvinna
• foster till RhD neg, gravid kvinna
cellfritt fetalt DNA
cffDNA
Bakgrund
cffDNA
Volume 350, Issue 9076, 16 August 1997
Presence of fetal DNA in maternal plasma and
serum
Dennis Lo et al.
Påvisades DNA från Y-kromosomen
1998 påvisades RHDpos DNA i RhD neg
gravida kvinnor
Tidigare krävdes fostervatten eller CVS för att
kunna undersöka fostrets blodgrupp
Fetalt DNA (cellfritt fetalt DNA, cffDNA)
• huvudsakligen från placenta, trofoblaster
• fragmenterat (<200bp)
• utgör 5-20% av det cellfria DNA
• riklig produktion
• snabb metabolisering
• mätbar koncentration v 5
• ej detekterbart post-partum (1-2 dagar)
Undantag enl. Invernizzi et al Hum Genet 2002;110:587
Bild från wiki common
Provtagning
Plasma versus amnion/CVS
• Lättare provtagning
• Billigare provtagning
• Lättare att upprepa
• Ingen ökad risk för
– missfall
– ökad immunisering av modern
Applikationer
cffDNA
Kan användas för prediktion av:
• Fetal blodgruppsstatus
• Trisomier
• Kön och könsbundna sjukdomar
• Andra ärftliga monogena sjukdomar
•
Thalassemi
• Sjukdomar varvid ökade koncentrationer av fetalt DNA föreligger
•
•
Havandeskapsförgiftning (preeklampsi)
Prematur födelse (Jakobsen, Clausen et al. High levels of fetal DNA are associated with increased risk of
spontaneous preterm delivery Prenat Diagn. 2012 Apr;32)
Svårigheter
cffDNA
• Låg DNA-koncentration
Krävs:
• Realtids-PCR
• NGS (Next Generation Sequencing)
Trisomi-bestämning
Svårigheter
cffDNA
• Begränsad transporttid (>24-48h)
+
+
+
-
prov transporteras i RT
förvaras i RT/kyl
EDTA-rör
minskar fraktionen fetalt DNA
Immunisering
Kliniskt relevanta antigen:
• RhD
• Rhc
• RhE
• Kel
Risk*
15%
1-3%
1-2%
Uppstår vid:
• förlossning
• invasiv diagnostik
• under graviditet
Inkompatibel
blodtransfusion
85%
* För RhD-immunisering om profylax ej ges
Immunisering
Risker vid immunisering
• fetal anemi
• fetal hjärtsvikt
• fetal hyperbilirubinemi
• intrauterin fosterdöd
Risker vid immunisering
• anemi
• hjärtsvikt
• hyperbilirubinemi
• intrauterin fosterdöd
Hur många drabbas?
• 15% är RhD-negativa
• 60 % av dessa bär ett RhD-positivt barn
• 1-2% blir immuniserade
• 1/3 immuniserade under pågående graviditet
• 150-170 graviditeter/år
Immunisering
Risker vid immunisering
• anemi
• hjärtsvikt
• hyperbilirubinemi
• intrauterin fosterdöd
Hur många drabbas?
• 15% är RhD-negativa
• 60 % av dessa bär ett RhD-positivt barn
• 1-2% blir immuniserade
• 1/3 immuniserade under pågående graviditet
• 150-170 graviditeter/år
Hur många blir allvarligt påverkade?
• 50-60 behöver blod som foster och/eller nyfödd
• ett fåtal foster dör
RhD-profylax
RhD-profylax
• 1968 USA
• 1969 Sverige, efter förlossning och vid invasiva ingrepp
• i många länder ges det även v29-30 till alla RhD-neg kvinnor
• tillverkas av human plasma
• anti-D av IgG typ
Analys av fosterblodgrupp
cffDNA
2001 RHD & SRY, IBGRL, Bristol
2003 RHD, Sanquin, Amsterdam
2004 RHD , NRLGBT, Lund
RHD
RHc
RHC
RHE
K1
HPA1a
Sanquin
Bristol
Lund
v9
v9
v9
v 12(v18)
v 16
v16
v16
v16
v20
v20
v16
v16
Analysen används
för kvinnor som är
Immuniserade
RHD-screening
• 2009-2012 projekt, Stockholm
Test v 8 (7) nu 10 (8)
Profylax v 29 & postnatalt
• 2010 Danmark
5 olika center
Test v 25
Profylax v 29 & postnatalt
• 2011 (0701) Nederländerna
Nationellt center
Test v 27
Profylax v 30 & postnatalt
• 2013 projekt Bristol/UK
Nationellt center
Test v 12
Profylax v 29 & postnatalt
• 2014 Finland
Nationellt center
Test v 24
Profylax v 30 & postnatalt
• 2016 (0901) Norge
4 olika center (Oslo, Trondheim)
Test v 24
Profylax v 28 & postnatalt
RHD-screening
• 2009-2012 projekt, Stockholm
Test v 8 (7)
Profylax v 29 & postnatalt
5 olika center
• Riktad profylax till endast de kvinnor som bär
på vRHD-positiva
Test
25
• 2010 Danmark
foster.
Profylax v 29 & postnatalt
• I länder där profylax tidigare gavs till alla RhDNationellt
negativacenter
kvinnor
Test
v
27
undviks
nu profylax att ges till 40%.
• Juli 2011
Nederländerna
Profylax v 30 & postnatalt
• 2013 projekt Bristol/UK
Nationellt center
Test v 12
Profylax v 29 & postnatalt
• 2014 Finland
Nationellt center
Test v 24
Profylax v 30 & postnatalt
• 2016 Norge
olika
Test v XX
Profylax v XX & postnatalt
RHD-screening
150101 Skåne och Blekinge
Test v 10 (8)
Profylax v 29 & postnatalt
Analys inom 5 dagar
RHD-screening
150101 Skåne och Blekinge
170101 Halland
Test v 10 (8)
Profylax v 29 & postnatalt
Analys inom 5 dagar
RHD-screening
150101
• DNA-extraktion, Klinisk Virologi, Lund
MagNA Pure LC DNA isolator Roche
• Realtids-PCR med RHD-kit
Real time PCR ABI Prism SDS 7000
RHD-screening
160601
• EDTA-rör in, realtidsplatta ut
• Fil med plattlayout
• Realtids-PCR med RHD-kit (Devyser)
• Fil med plattlayout
Analys tolkas:
Svar läggs in:
2 personer (BMA)
2 personer (BMA)
Analys godkänns: 1 person (läkare)
Real time PCR ABI Prism SDS 7000
RHCE/RHD
Pseudogen Ψ
Orsak till 66%
RhD neg
fenotyp i Afrika
Orsak till 15%
RhD neg
fenotyp i Afrika
Singleton et al., Blood 2000
RHCE/RHD
96,4% likhet
Pseudogen Ψ
Orsak till 66%
RhD neg
fenotyp i Afrika
Orsak till 15%
RhD neg
fenotyp i Afrika
Singleton et al., Blood 2000
Real-time PCR
RHD
GAPDH
Real-time PCR
GAPDH
