SWEDAC DOC 03:6
Datum 2006-03-20
ISSN 1400-6138
Riktlinjer för ackreditering av metoder
för analys av humant genomiskt DNA
resp humant RNA
(Utgåva 1)
- Tillämpningsområde: Laboratoriemedicin
SWEDAC DOC 03:6
Datum 2006-03-20
Utgåva 1
Riktlinjer för ackreditering av metoder för analys av
humant genomiskt DNA respektive humant RNA
Syftet med att bestämma variation hos en enstaka nukleotid (SNP) i en känd gensekvens kan
vara för att identifiera en känd genetisk variation. Variationen kan användas för att spåra
identitet. Variationer som leder till syntes av ett defekt protein eller till ändrad grad av
proteinsyntes kan användas i t.ex. diagnostik och riskanalys. Molekylärgenetisk analys skall
kunna påvisa såväl normal som variant sekvens.
DNA analys kan också användas för att avläsa nukleotidsekvens i ett visst fragment varefter
denna sekvens jämförs med en dokumenterad referenssekvens. Den kan även kvantifiera
specifikt DNA respektive påvisa antal baspar mellan två specifika sekvenser (fragment
storleksanalys).
Ibland vill man påvisa och/eller kvantifiera grad av uttryck av en viss gen. Man kan då isolera
mRNA från vävnaden i fråga och med hjälp av enzymet reverstranskriptas skapa en DNA
kopia av mRNA (cDNA).
Analysprincip
Genomiskt DNA extraheras ur ett blodprov eller annan vävnad. EDTA och citrat ökar
hållbarheten av DNA i provet. DNA i EDTA helblod är stabilt under flera veckor vid
rumstemperatur. DNA extraheras med en validerad metod och lagras före användning på ett
sådant sätt att materialets integritet inte påverkas. Extraherat DNA är användbart efter
förvaring vid –20oC eller –80oC under flera år.
Speciella krav gäller rening av RNA och konvertering till cDNA. Provhantering före reningen
kan påverka halt och integritet av mRNA. Prov bör därför oftast hanteras på särskilt sätt efter
provtagning. Behandling med DNas enzym för att förebygga interferens från genomiskt DNA
vid analys kan behövas (se nedan). Metoder för provhantering och lagring skall valideras och
dokumenteras.
Analysen kan genomföras på flera olika sätt. Gemensamt för de flesta metoderna är ett steg
varvid det intressanta DNA (mRNA) fragment, definierad av två korta men specifika DNA
sekvenser (primers) mångfaldigas med PCR amplifiering. Kvantitativ analys av mRNA kräver
speciellt designade primers vilka t.ex. spänner över två olika exon så att interferens från
genomiskt DNA förhindras. Genetisk variation i genomiskt DNA kan påvisas direkt genom
sekvensanalys eller genom påvisande av inkorporering av en specifik märkt bas intill en tredje
primer belägen alldeles intill variationen (Single base extension, minisekvensering, massextend principen). Variation kan även påvisas indirekt genom t.ex. hybridisering till en kort
sekvensspecifik DNA sond. Elektrofores kan påvisa fragment storlek efter klyvning med ett
sekvensspecifikt enzym (RFLP) eller efter strängseparation (SSCP). Kromatografiska
metoder (DGE-HPLC) kan påvisa sekvensvariation i mönster av enkelsträngat DNA-fragment.
Kvantifiering kräver tillgång till särskilda instrument och kalibrering.
2(3)
SWEDAC DOC 03:6
Datum 2006-03-20
Utgåva 1
Analysutförande
En tydlig beskrivning av provhantering, extraktionsmetoder, PCR amplifiering och de
efterföljande analyserna, inklusive metodvalidering skall finnas nedtecknade. Av
beskrivningen skall framgå amplifieringsförhållanden inkl. typ av polymeras och övriga
testförhållanden för analysernas genomförande samt godkännande gränser för acceptans av
analysresultat. När det gäller provhantering bör processen för mottagning, lagring och ev.
destruktion beskrivas.
Funktionen av thermocyklingsapparatur skall kontrolleras enligt tillverkarens instruktioner och
dokumenteras på föreskrivet sätt.
Väsentliga aspekter vid bedömning av kvalitet av DNA analyser är:
1.
Tillgång till molekylärbiologiskt och/eller molekylärgenetisk kompetens.
2.
Spårbarhet av providentitet genom hela analysprocessen.
3.
Spårbarhet av metoden. Detta kan dokumenteras genom litteraturreferens, men
dokumenteras bäst genom referens till ett Accession nummer för DNA sekvensen från
Genbank, EMBL, OMIM, dbSNP eller annan publik databas. Vid egen design bör
BLAST analys utföras för att avslöja ev. homologa DNA sekvenser. Primer sekvenser
skall dokumenteras i sin helhet, inkl. sekvensposition i respektive referenssekvens.
4.
Åtgärder för att förhindra kontamination. Ett minimikrav är fysiskt separerade
arbetsplatser för provhantering före och efter PCR amplifiering samt separat, tydligt
märkt utrustning för provhantering. Laboratoriets samtliga åtgärder för att förhindra och
detektera ev. kontamination skall vara dokumenterade.
5.
Användning av interna positiva kontroller av känd genotyp och negativ kontroll (utan
innehåll av DNA) för att dokumentera avsaknad av kontamination. Metoder för SNPs
skall ha dokumenterats lokalt med positiva kontroller med såväl normal/normal,
normal/variant och om möjligt, variant/variant genotyp.
6.
Vid införande av ny metod skall resultat av upprepad analys av ett referensmaterial
stämma överens med resultat från tidigare metod eller annat laboratorium. Alternativt
kan riktighet hos en ny analys dokumenteras med DNA sekvensanalys.
7.
Vid DNA sekvensanalys för bestämning av humansekvensvariation skall entydiga
resultat jämföras med dokumenterat referenssekvens. Entydiga resultat skapas genom
analys av flera separata PCR produkter, genom avläsning av sekvensen i både
riktningar, eller t.ex. genom sekvensering av flera oberoende kloner. Rutinerna bör vara
anpassade efter tillämpningen, utrustningen och tillgänglig mjukvara. De skall vara
validerade och dokumenterade.
8.
Laboratoriet skall använda sig av konsekvent nomenklatur vid svarsrapportering (se
EQUALIS rekommendationer samt Antonarakis SE. Human Mutat. 1998;11(1): 1-3 ).
Med detta framgår bl.a. om patienten bär noll (homozygot normal/normal), ett
(heterozygot normal/variant) eller två (homozygot variant/variant) variant anlag.
9.
Där tillgängligt, skall laboratoriet vara anslutet till ett externtkvalitetskontroll program.
3(3)
