Att stimulera djupinlärning med laborativ undervisning
Fredrik Bergh Thorén, Sahlgrenska Cancercentrum, Göteborgs universitet
Pedagogiskt projektarbete för docentur vid Sahlgrenska akademin
Handledare: Charlotta Movitz
Bakgrund och problemställning
Traditionell undervisning vid medicinsk fakultet framställs ofta som ett pedagogiskt
skräckexempel. I sin iver att effektivt förmedla omfattande information till ett stort antal
studenter använder lärarna närmast uteslutande katedrala föreläsningar. I denna
undervisningsform går kommunikationen i princip en väg, och kunskapen är tänkt att
överföras från föreläsare till studenter.
Till den medicinska utbildningens försvar kan dock anföras att det medicinska ämnet
som sådant är svårt att angripa utan tämligen omfattande baskunskaper. Det är
exempelvis svårt att reflektera kring immunsystemets strategier för att bekämpa en
virusinfektion om man inte har basala kunskaper om vad som skiljer bakterier och virus
och om hur immunsystemet är uppbyggt och fungerar. Min upplevelse av medicinsk
utbildning är att ett annat problem är ämnesområdets enorma bredd. Inom en enskild
kurs når man ofta inte längre än till överföringen av stora informationsmängder innan
kursen är slut och nästa område skall angripas. På det sättet är risken överhängande att
utbildningarna blir en serie av kurser på grundnivå där studenternas kunskaper förblir
oreflekterad faktakunskap, dvs endast når en förhållandevis låg taxonomisk nivå.
Laborationer är ofta den naturvetenskapliga och prekliniska medicinska utbildningens
försök att komplettera de katedrala föreläsningarna med erfarenhetslärande (episodiskt
minne). En lång rad olika mål har knutits till laborativ undervisning, såsom ökad
förståelse för kopplingen mellan teori och metod; ökad förståelse för vetenskapligt
arbete; förbättrade tekniska färdigheter och ökad förtrogenhet med apparatur; förbättrad
förmåga till problemlösning; ökad förmåga att tolka och presentera resultat; bidra till
utvecklandet av en vetenskaplig attityd; ökad förmåga att arbeta i grupp mm1,2.
Ramsden listar dock ett flertal studier som visar att laboratorie-baserad undervisning
ofta är dyr, tidskrävande och dålig och inte alls når dessa mål3. I många fall inbegriper
laborationer rutinmässiga mekaniska uppgifter – exempelvis visade en studie i England
att under första årets kemiutbildning utförde den genomsnittlige studenten 50 stycken
byrett-titreringar – en metod där man långsamt låter lösning A droppa ner i lösning B
och noterar vilken volym av A som behövs för att något specifikt skall ske.
Sammantaget lär alla dessa rutinmässiga uppgifter ta en ansenlig mängd dyrbar tid i
anspråk som borde kunna användas mer effektivt för att främja inlärning4.
Ett vanligt fel vid laborationer är också att laborationshandledningen lätt blir en så
detaljerad manual att den påminner om ett matrecept. Proceduren kan då ofta följas steg
för steg utan att studenterna egentligen förstår vad de gör, vad som sker och varför. Ett
annat bekymmer är att studenterna framförallt försöker att få fram ”rätt” resultat så fort
som möjligt.5
För några år sedan blev jag med kort varsel ombedd att skapa en ny laboration inom
ramen för en 7,5p-kurs om immunsystemet och infektioner vid apotekarutbildningen.
Syftet med laborationen var att introducera studenter för moderna laborativa tekniker
och illustrera immunologiska processer. En laboration utformades hastigt med ett
traditionellt upplägg, men vi i lärarlaget konstaterade efteråt att det här var en möjlighet
att skapa en ny laboration som i högre utsträckning stimulerade djupinlärning. Således
inleddes ett omfattande arbete med att förändra laborationen
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1
Ramsden, P. Learning to teach in higher education. (2003), p 155.
Baillie C. and Hazel E. Teaching materials laboratory classes. (2006) Higher Education Academy UK,
Centre for Materials Education. http://www.materials.ac.uk/guides/labclasses.asp
3
Ramsden, P. Learning to teach in higher education. (2003), p 155.
4
Bennet S.W., Seery, M.K., Sövegjarto-Wigbers, D. Practical work in higher level chemistry education,
Innovative methods of teaching and learning chemistry in higher education. (2009), p 87.
5
Ibid.
2
Syfte:
Att genom studentenkäter, reflektion/diskussion inom lärarlaget samt litteraturstudier
identifiera strategier för att förbättra en befintlig laboration så att den blir ett effektivt
lärmoment som stimulerar djupinlärning.
Frågor som vi har ställt oss under detta arbete har inkluderat: Hur skall man utforma den
här laborationen så att den blir ett effektivt lärmoment som stimulerar djupinlärning
inom ramen för denna kurs? Hur undviker man kokboksfällan?
Resultat
Laborationen första året
När laborationen gavs första gången erhöll studenterna en laborationshandledning med
ett tämligen utförligt laborationsprotokoll (bilaga 1). Studenterna fick separera fram
immunceller från blodgivarblod, tvätta dem, räkna dem och sätta dem i kultur med
tumörceller. Fyra timmar efter laborationstillfället analyserade laborationshandledarna
resultaten med flödescytometri. Vid laborationstillfälle 2 fick studenterna tillbaka
gruppernas resultat, en demonstration av den använda tekniken urfördes och
laborationsresultaten diskuterades.
Efter laborationen delades en enkät ut och studenter tillfrågades om vad de tyckte om
laborationen och vad som skulle kunna förbättras till nästa gång.
Studenternas synpunkter
Samtliga studenter fick en enkät i slutet av laborationen som de förväntades fylla i innan
de lämnade lokalen. Enkäten omfattade 5 stycken frågor; tre frågor som berörde
specifika avsnitt i laborationen, och 2 stycken av generell karaktär som diskuteras här
(”Vad tyckte du om NK-cellslaborationen?” och ”Vad skulle kunna förbättras?”).
Denna första av dessa två frågor kunde besvaras med ”Mycket bra”, ”bra”, ”dålig”,
”mycket dålig”. Laborationen fick generellt ett ganska bra mottagande. Studenternas
omdömen fördelade sig enligt nedan:
Mycket bra: 26
Bra: 50
Ok: 2 (även om detta svarsalternativ inte fanns med i enkäten)
Dålig: 1
Mycket dålig: 0
Förbättringsförslagen i fråga två rörde framförallt det faktum att föreläsningar om det
aktuella ämnet inte föregick laborationen utan hade schemalagts efter laborationen, samt
att studenterna ville utföra alla moment inom laborationen på egen hand.
Reflektioner/diskussioner inom lärarlaget
Efter laborationen diskuterade vi i lärarlaget hur laborationen hade gått, vilka moment
som var mer eller mindre lyckade, och hur laborationen kunde förbättras till nästa gång.
Vi var tämligen överens om att demonstrationen av flödescytometri inte hade blivit
speciellt lyckad. Den tycktes snarare förbrylla studenterna än få dem att inse hur
tekniken fungerade. Vidare tyckte vi att cellseparationen från blod förbrukade mycket
tid, kostade mycket i material, och gav mycket varierande resultat, vilket påverkade
många laborationsgruppers fortsatta arbete. Sammantaget var vi överens om att
laborationen hade potential, men behövde omarbetas rejält för att bli det effektiva
lärmoment som vi eftersträvade.
Förändringar inför andra året
Inför det andra kurstillfället gjorde vi stora förändringar. Istället för att låta studenterna
utföra den mekaniska cellseparationen, erhöll studenterna expanderade NK-celler som
odlats fram under tre veckor. Varje grupp erhöll färgade tumörceller, ett rör med den
terapeutiska antikroppen Mabthera som används kliniskt vid kronisk lymfatisk leukemi,
och ett rör med Fc-block som blockerar Mabtheras immunstimulerande effekt.
Laborationsuppgiften var kort beskriven: ”Utforma ett experiment som gör det möjligt
att utvärdera NK-cellers cytotoxicitet samt Mabtheras funktion med avseende på CDC,
ADCC samt direkt cytotoxisk effekt”.
Efter 4 h färgade och fixerade laborationshandledarna studenternas prover för att
möjliggöra analys vid laborationstillfälle 2. Vid detta tillfälle fick studenterna själva
köra sina prover i två flödescytometrar som placerades i laborationssalen.
Diskussion kring förändringsarbetet
Det kan finnas flera olika syften med laborativ undervisning: Den kan åskådliggöra
teori från föreläsningar i praktiken, introducera studenterna till moderna tekniker, ibland
t.o.m. sk ”hands-on”-erfarenhet, få studenterna att djupare reflektera kring studieämnet,
och visa studenterna hur man arbetar med experimentell forskning mm6,7.
Det stod fullständigt klart att vår första upplaga av laborationen uppfyllde vissa av dessa
syften men kapitalt misslyckades med andra. Vi hade gått i fällan och producerat en
urförlig laborationsmanual som med stadig hand förde studenterna från punkt A till
punkt B – utan att studenterna egentligen behövde begripa någonting. Uttryckt i SOLOtaxonomiska termer så krävde laborationen endast kunskap på den lägsta unistrukturella nivån (fig 1, samt not 8). Paradoxalt nog var studenterna ganska nöjda ändå,
dels för att de är vana vid den här typen av serverad information, dels kanske för att en
andel av dem är såpass begåvade att de ändå begrep vad det handlade om. Den senare
gruppen av studenter är djupinlärande och kunde kanske, undervisningsmetoden till
trots, analysera och integrera laborationserfarenheterna med sin sedan tidigare
inhämtade kunskapsmassa. Pettersen refererar i sin bok till Biggs två olika studenttyper,
den djupinlärande ”Susan” och den ytinlärande ”Robert” 9. Våra ”Susan”-studenter
lyckades möjligen se bortom ”kokboksreceptet” och förstod hur man med denna typ av
försöksuppställningar skulle kunna besvara andra intressanta frågor, dvs deras
kunskapsnivå har nått de två högsta nivåerna i SOLO-taxonomin, den relationella nivån
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
6
Fler exempel i Ramsden, P. Learning to teach in higher education (2003) s154 f
Seery, M. Teaching in the laboratory: 1 – Pedagogy (2010),
http://michaelseery.com/home/index.php/2010/09/teaching-in-the-laboratory-1-pedagogy/
"
!Pettersen, RC. Kvalitetslärande i högre utbildning (2005) s290ff!
9
A.a. s39!
7
och den utvidgat abstrakta nivån (fig 1, not 7). De ytinlärande ”Robert”-studenterna å
andra sidan var eventuellt nöjda med att genomföra en laboration om immunsystemet
och cancer genom att enkelt glida med och följa de erhållna instruktionerna.
!"#$%&'(&&#$!%$&!'()*'+,*)-./$0)+!-!123245+67)7&-)8!90/)!:$55$0*7);!<=8 Kvalitetslärande i högre utbildning (2005) s290.
Vår avsikt var dock att laborationen skulle stimulera till en ökad förståelse för ämnet, att
få studenterna att få ökad kunskap om hur man utforskar ett ämne, hur man utformar ett
experiment för att besvara en frågeställning mm. Den detaljerade och styrande
laborationshandledningen förhindrade dock detta. Domin beskriver olika sorters
ansatser i laborativ undervisning; ”expository”, ”inquiry”, ”discovery”, ”problembased”. Dessa skiljer sig med avseende på mål, ansats och procedur. Den traditionella
naturvetenskapliga laborationen av kokbokstyp är den förklarande varianten
(expository). Den har en start, ett bestämt mål, en deduktiv ansats och en detaljerad
given beskrivning. En sådan laboration följer en räls och studenterna förväntas hoppa på
tåget och nå förväntad destination. Den undersökande varianten (Inquiry) å andra sidan
har inte ett fördefinierat mål, och studenterna utformar laborationen efter eget huvud.10
Baillie och Hazel har en annan men liknande uppdelning av laborativa uppgifter med
varierande grad av oberoende (tabell 1)11.
)"*+&,*&
-./%-/01/&
>!
@!
G!
2,.-%,3-%"/,43"*"3/3&
#$&7)*50+5-7)!
A7)507BB$0+C!D.)-)E!
150('5(0$0+C!
%70*')-)E*(,,E-%5!
5+6&
?-.$5!
?-.$5!
?-.$5!
5,3/%",6&
?-.$5!
?-.$5!
?-.$5;!H$B5!
$BB$0!C$B.-*!
5/3-1&
?-.$)!
?-.$)!
F,,$5;!
H$B5!$BB$0!
C$B.-*!
7/8$63,3&
?-.$5!
F,,$5!
F,,$5!
9,./66&:(&&2B-'+!5I,$0!+.!B+J70+570-$(,,E-%5$0!&$C!*5-E+)C$!E0+C!+.!7J$07$)C$8!K7C-%-$0+C!%0/)!)75!@@.
Föga förvånande har den traditionella laborativa undervisningen, i likhet med den
traditionella katedrala föreläsningen, utsatts för mycket kritik. Den må vara effektiv (i
någon mening) för stora studentgrupper, men den stimulerar inte till reflektion eller
djupinlärning. Vår ambition är att ytterligare utveckla laborationen och ge den en mer
undersökande karaktär. Laborationen kommer även fortsättningsvis att behandla
immuncellers förmåga att eliminera tumörceller. Vi kommer dock att inkludera
nyutvecklade läkemedel som kan påverka interaktionerna mellan immunceller och
tumörceller. Laborationens ramar kommer att definieras vid en introducerande
föreläsning (vilka celler kommer vi att arbeta med, vilka substanser kan ni använda för
att påverka cellerna), men studenterna får sedan själva bestämma vilka frågor de vill
söka att besvara genom experiment och skriva ner hur de avser att gå tillväga för att
göra det. Genom detta förfarande ökar vi förhoppningsvis studenternas engagemang och
de ”tvingas” att förbereda sig inför laborationen. Studier har visat att den tid som
studenterna ägnas åt förarbete inför en laboration och efterarbetet i hög grad styr hur
mycket studenter lär sig.12 Under laborationen är min tanke att vi lärare skall fungera
som bollplank och Vygotskij-inspirerade guider; vi skall inte säga exakt hur de skall gå
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
10
Domin, DS. A Review of Laboratory Instruction Styles, J. Chem. Educ., 1999, 76 (4), s 543
Baillie, C & Hazel, E. Teaching materials laboratory classes. 2003 The UK Centre for Materials
Education (http://www.materials.ac.uk/guides/9-lab-classes.pdf)
12
Bennet S.W., Seery, M.K., Sövegjarto-Wigbers, D. Practical work in higher level chemistry education,
Innovative methods of teaching and learning chemistry in higher education. (2009), s 93.
11
tillväga, men lotsa dem och hjälpa dem att utföra mer avancerade problemlösningar än
de kanske hade klarat av på egen hand.13
Till skillnad från den första upplagan av laborationen är vår avsikt att studenterna även
fortsättningsvis själva skall få analysera sina prover med avancerad metodik. Vi tror att
detta gör mötet med flödescytometritekniken mer meningsfull än vid en demonstration.
Studenterna kommer sedan få författa en skriftlig rapport där de skall diskutera sitt
experimentella upplägg, de erhållna resultaten och hur de stämmer överens/skiljer sig
från den teori som kursböcker och föreläsningar har förmedlat. I rapporten skall
studenterna också beröra frågor såsom: Hade något i genomförandet kunnat förbättras?;
vad är den svaga länken?; hur trovärdiga är resultaten?
Avslutande kommentarer
Till skillnad från traditionell föreläsning har aldrig laborativ undervisning berörts inom
de pedagogiska kurser som jag har läst, och jag har inte heller reflekterat kring
laborationsundervisningens brister. Litteratursökningen inom detta arbete fick mig
verkligen att få upp ögonen för traditionell laboratorieundervisnings tillkortakommanden. En traditionell laboration behöver förstås inte vara meningslös utifrån ett
inlärningsperspektiv; en viss förtrogenhet om hur det går till i en laborationssal kan nog
de flesta få med sig, men frågan är hur relevant det är för den stora andelen apotekare
som inte kommer att ägna sig åt laborativt arbete efter examen. Jag tror inte att det är ett
vågat påstående att säga att den laboratorieundervisning är en pedagogisk resurs som
kan användas mycket bättre. Våra mål får inte vara för högt ställda utifrån de givna
resurserna, men inom laborativ undervisning bör fokus ligga på mål på en hög
taxonomisk nivå, dvs nå bortom det praktiska utförandet eller användningen av specifik
apparatur.14 En stor utmaning för oss är att genomföra en radikal förändring av
laboratorieundervisningen när man ansvarar för en mycket begränsad del av
utbildningen. Andra institutioner, och t o m andra fakulteter, har redan format
studenternas uppfattningar om universitetsutbildning och laborativ undervisning när de
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
13
Pettersen, RC. Kvalitetslärande i högre utbildning (2005) s107 ff
Referens i Davies, C. Learning and teaching in laboratories, 2008. Higher Education Academy
Engineering Subject Centre
14
kommer till vår kurs. Att inom ramen för en laboration introducera en ny didaktisk
metod (som dessutom är ganska krävande för studenterna) och samtidigt säkerställa att
studenterna tillgodogör sig tillräckligt med ämneskunskap är en utmaning.
Förhoppningen är dock vi skall skapa en laboration som blir ett effektivt
inlärningsmoment inom apotekarutbildningen.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
!"#$#%&%'()"(*)+,-.&-.(/01(,23$.0-44-.(3-#(+/354-3-%,(.-65-+,&"-(
)+,&"-.)#-(7890-44-.(
:%4-#%&%'(
Syftet med denna laboration är att ni skall förstå de avdödningsfunktioner som är av betydelse
för att skydda oss mot mikroorganismer och mot egna avvikande celler. Fagocyterande vita
blodkroppar och NK-celler är exempel på två olika celltyper som är utrustade med
avdödningsfunktioner, men även lösliga proteiner (exempelvis de som ingår i
komplementsystemet) kan döda andra celler. De fagocyterande cellerna behandlas inte under
laborationen och för en genomgång av deras avdödningsfunktion hänvisas till en föreläsning
som hålls under kursen. Omkring 10 % av de mononukleära cellerna i blodet är NK-celler. De
identifierades på 1970-talet som stora granulerade lymfocyter och fick namnet ”Natural Killer
cells” av forskare vid Karolinska institutet. Karakteristiskt för dessa celler är att de kan döda
tumörceller och virusinfekterade celler utan att först instrueras av antigenpresenterade celler.
Till sin hjälp har NK-celler ett stort antal olika aktiverande och inhiberande receptorer på
cellytan. Viktiga inhiberande receptorer är de sk KIR (”Killer Immunoglobulin-like
Receptors”) medan de viktigaste aktiverande receptorerna är NCRs (”Natural cytotoxicity
receptors” – tex NKp30 och NKp46) och NKG2D. KIR känner igen MHC I-komplexet som
uttrycks av alla normala kärnförsedda celler i kroppen. NKG2D känner igen proteiner som
uppregleras på stressade celler (tex strukturen MICA) medan NCRs bl.a. känner igen virala
proteiner.
När NK-cellen stöter ihop med en målcell kommer de olika strukturerna på målcellen binda in
till de olika NK-cellsreceptorerna. Vad NK-cellen slutligen gör (avdödning eller ej) bestäms av
balansen mellan aktiverande och inhiberande signaler som skickas in i NK-cellen (figur 1).
!
!
!
!
"#$%&!'(!3104'.5%-(04%"6.7%0"&&08-,,-%0)$60%')9-%"%0"&&0
+:+")0"10;<=8-,,-%0"(&'(.-(05&&%>89-%0?@A020'0,'&-(0
5&)&%B89('(.0C+1)0.-%0-(+")&05DD*$10&',,0)1"."0
'(*'#'&$%')9"0)'.(",-%0'0;<=8-,,-(E0",&-%("&'1&05&&%>89-%0
)&%-))D%$&-'(-%0C)7)$60?2A3E0-,,-%0,'."(+-%04:%0;AF0'0
)&$%05&)&%B89('(.0C+1)0.-(-%-%"%0)&"%9"0"9&'1-%"(+-0
)'.(",-%0'0;<=8-,,-(EG0H(09$6#'("&'$(0"10,'&-&0?@A02=
5&&%>890$8*05&&","&0)&%-))D%$&-'(5&%>890:9"%0%')9-(04:%0
"1+:+('(.0>&&-%,'."%-G0I&'65,-%"(+-08>&$9'(-%/0)7)$60
2!=J/02!=KJ0$8*02!=KL/04:%)&B%9-%0+-0"9&'1-%"(+-0
)'.(",1B."%("0'0;<=8-,,-(G0I7,-+-)05DD1')"%0
)&'65,-%"+-0;<=8-,,-%0:9"+0#-(B.-(*-&0"&&0+:+"0
&56:%8-,,-%0B(06$&)1"%"(+-0$)&'65,-%"+-0;<=8-,,-%G0
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
Syftet med den första delen av laborationen är att demonstrera hur NK-cellers cytotoxicitet
fungerar samt hur cytotoxiciteten kan mätas med moderna laboratorietekniker. Laborationen
avser dessutom att introducera centrala immunologiska tekniker såsom densitetsgradientsseparation, cellräkning och flödescytometri. I laborationen kommer mononukleära celler att
isoleras från blodgivarblod. De mononukleära cellerna kommer att inkuberas med
tumörcellslinjen Daudi i närvaro eller frånvaro av den NK-cellsaktiverande cytokinen IL-2.
Daudi saknar MHC I och kan därmed dödas av NK-celler – framförallt om NK-cellerna först
stimulerats med IL-2. Efter ett antal timmars inkubering kommer andelen avdödade
tumörceller att bestämmas med hjälp av flödescytometri.
Syftet med den andra delen av laborationen är att demonstrera komplementsystemets
bakteriedödande funktion. Komplementsystemet består av ett antal plasmaproteiner som från
en inaktiv form (zymogener), vid aktivering överförs till aktiva komponenter. Aktiveringen
sker på ett karakteristiskt sätt med en successiv förstärkning, sk kaskadeffekt. Aktiveringen kan
ske enligt två olika vägar som brukar kallas den klassiska respektive den alternativa vägen.
Den klassiska vägen aktiveras med hjälp av antikroppar (IgG1, IgG3 eller IgM) eller ett
mannosbindande plasmaprotein (MBP). Den alternativa vägen aktiveras direkt av den
främmande partikeln via t.ex endotoxin från G-negativa bakterier, teichonsyra från G-positiva
bakterier eller ytstrukturer på vissa virus och transformerade celler.
I ett appendix som återfinns i slutet av laborationshandledningen finns lite mer om
komplementsystemets biologiska effekter.
;-5).),&/%()"(*4/#0-44-.(6/3(6+)44()%"<%#)6(=$.(7890-4464)*/.),&/%-%(
Vid separation av olika blodkroppar utnyttjar man det faktum att olika celltyper har olika
densitet.
Röda blodkroppar > granulocyter > monocyter/lymfocyter > trombocyter.
Under laborationen används en speciell typ av blodprovsrör, sk BD Vacutainer CPT med citrat.
Citrat fungerar som antikoagulant, dvs förhindrar att blodprover levrar sig. I botten av röret
finns en hög-densitetslösning (1,077g/ml) av FICOLL-HYPAQUE. Ovanför Ficoll-lösningen
ligger en barriär av polyestergel som förhindrar att blodet blandar sig med Ficoll-lösningen.
När provet centrifugeras i hög hastighet kommer de röda blodkropparna och granulocyterna
(som har högre densitet än 1,077g/ml) att tryckas igenom barriären och lägga sig i botten på
röret. De övriga blodkropparna (monocyter, lymfocyter och trombocyter) har lägre densitet och
återfinns därför i ett vitaktigt lager ovanför gelbarriären
efter centrifugering (se figur 2).
!
!
!
!
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
"#$%&!)!
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
De mononukleära cellerna kan sedan sugas upp med en pipett tillsammans med trombocyterna,
varefter trombocyterna tvättas bort med hjälp av en centrifugering vid lägre hastighet.
>)2#&90-44-.(
Daudi-celler är en human B-lymfoblastoid cellinje som isolerats från ett Burkitt-lymfom.
Cellerna uttrycker inte MHC I på ytan och kan dödas av cytokin-stimulerade NK-celler (i äldre
litteratur även kallade LAK-celler, ”lymphokine-activated killer cells”). I den här laborationen
är Daudi-cellerna infärgade med den orange membranfärgen PKH-26 som tack vare sin
hydrofobicitet tränger in i cellmembranet. Den orange färgen gör det möjligt att skilja
tumörcellerna från de vanliga lymfocyterna i den flödescytometriska analysen under dag II.
?4$#-60@,/3-,.&(
I en flödescytometer sugs vätska innehållande partiklar/celler upp i en tunn slang. Cellerna
radas upp en efter en och leds in i en laserstråle. Olika celler bryter ljuset på olika sätt, dels
beroende på storlek/volym, dels beroende på hur granulerade de är. Varje cell analyseras och
får ett storleksvärde (Forward Scatter, FSC) och ett granuleringsvärde (Side Scatter, SSC). På
detta sätt kan ett cellprov analyseras och andelen av olika sorters blodceller kan bestämmas
beroende på hur stora och hur granulerade de är.
Utöver cellernas storlek och granulering kan flödescytometri också ge information om
cellernas fenotyp, aktiveringsgrad och huruvida de är levande eller döda. Genom att använda
antikroppar mot cellytestrukturer som är specifika för en viss celltyp (tex NK-celler) kan man
bestämma andelen av exempelvis NK-celler i ett prov. Den NK-cellsspecifika antikroppen
konjugeras med en fluorokrom som exciteras av laserljuset. När fluorokromen återgår till sitt
grundtillstånd skickar den ut ljus av en viss våglängd (emission). Detta ljus kvantifieras av
detektorer, och således kan uttrycket av den specifika NK-cellsstrukturen bestämmas för varje
cell som leds in i flödescytometern. I avancerade flödescytometrar finns flera laserkällor som
sänder ut ljus med olika våglängd – detta möjliggör användande av ett stort antal antikroppar
som är konjugerade till olika fluorokromer samtidigt. Man kan även använda färger som själva
binder in till olika cellulära strukturer, som ex DNA, cellmembran, mitokondrier osv
I den här laborationen använder vi oss av två olika flödescytometrar: en FACSCanto II med tre
lasrar, som mäter FSC, SSC och 8 olika färger, och en Accuri C6 med två lasrar, som mäter
FSC, SSC och fyra färger.
!%)4@6()"(#),)(
Den orange membranfärgen, PKH-26, exciteras av den blåa lasern (488nm) och emitterar ljus
runt 567nm. Flödescytometern kommer att identifiera Daudi-cellerna som celler med hög
signal i den orange detektorn (~567nm), medan blodgivarcellerna – som inte är orangefärgade
– kommer att ge en låg signal. För att bestämma hur stora andel av Daudi-cellerna som har dött
tillsätts en färg som binder till döda celler. Färgen FARVID (excitation 633nm, emission
646nm) binder in till amin-grupper, och dessa finns framförallt inne i cellen. FARVID kan inte
röra sig över intakta membraner och således kommer levande celler endast färgas i låg
utsträckning. FARVID tränger däremot in genom porerna i lyserade tumörceller och färgar
dem intensivt röda. Således kommer döda tumörceller att kunna identifieras som celler som
både är orange (PKH-26) och röda (FARVID), medan levande Daudiceller endast är orange
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
(PKH-26). Blodgivarcellerna kommer att detekteras som icke-orange, några av dem har
eventuellt dött under inkuberingen och kommer således att färgas in med FARVID (se figur 3).
(
(
(
(
0
!
"#$%&!*!
0
A),-.&)4(=$.(7890-4464)*/.),&/%-%(
1 provrör med 8ml helblod(buffy coat) spädd med buff NaCl
1 BD vacutainer CPT-rör
1 15-ml-rör
Flaska med buffrad natriumklorid
Slaskburk
Cellräkningskopp
Komplett medium med 10% serum
IL-2 (400 U/ml)
PKH-26-färgade Daudiceller (400 000/ml)
96-hålsplatta
Pipetter
A),-.&)4(=$.(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%(
Rör med normalt humant serum (NHS)
Rör med värmebehandlat NHS
Rör med bakteriesuspension 1 2x105/ml
Rör med bakteriesuspension 2 2x105/ml
Agarplattor (lb-medium) 12 st
Racklor (4st)
Pipetter
Vidallrör med kork
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
B,=$.)%#-C(7890-4464)*/.),&/%-%C(#)'(D((
M
M
Överför blodet från provröret till ett BD Vacutainer CPT-rör
Ställ i centrifugen och centrifugera i 20 min, 1500 g i rumstemperatur.
Starta komplementlaborationen i den här pausen. Se nedan.
M
M
M
M
M
M
Hämta CPT-röret och notera hur de olika blodcellerna har separerats, se figur 1.
Resuspendera det vitaktiga cellagret i den överliggande plasman och överför plasma
och celler till ett 15 ml-rör. Fyll upp med buffrad natriumklorid-lösning. Centrifugera
10 min, 300g, rumstemperatur.
Efter centrifugeringen, häll av supernatanten i slaskburken och resuspendera sedan
cellerna i 1 ml komplett medium. Överför 20!l av cellsupensionen till
cellräkningskoppen och sätt sedan till exakt 10 ml buffrad NaCl till koppen. Sätt på
locket och räkna cellerna i cellräknaren. Värdet som cellräknaren ger är uttryckt i antal
tusen celler per ml i ditt prov. Späd cellerna till 2milj/ml genom att sätta till lämplig
mängd komplett medium.
Märk upp tre brunnar på 96-hålsplattan:
1. Daudi-kontroll
2. Daudi + PBMC
3. Daudi + PBMC + IL-2
Till plattan pytsats enligt följande:
0
Daudi-kontroll
Daudi + PBMC
Daudi + PBMC +
IL-2
Komplett medium
150 !l
50!l
0
Daudi
50!l
50!l
50!l
PBMC
0
100!l
100!l
IL-2
0
0
50!l
Anteckna slutkoncentrationerna av celler och IL-2.
Ställ plattan på vagnen för transport till 37˚C-inkubator
Efter 4h kommer labhandledarna sätta till FarVID och analysera cytotoxiciteten med
flödescytometri.
(
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
B,=$.)%#-C(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%C(#)'(D((
M
Till fyra Vidallrör pytsas enligt följande:
Rör 1
3 droppar
NHS
Bakteriesusp. 1
Bakteriesusp. 2
M
M
M
(
Rör 3
3 droppar
Rör 4
3 droppar
3 droppar
NHS-56
M
M
Rör 2
3 droppar
3 droppar
3 droppar
3 droppar
Inkubera rören (med propp) i 37oC i ca 30 min
Gör en spädningsserie 10-1, 10-2 och 10-3 från varje rör i fysiologiskt koksalt.
Förslagsvis 100µl bakteriesuspension till 900 µl koksalt.
Glöm inte att blanda ordentligt innan spädning och beakta steriltekniken.
Sprid 100 µl från varje spädning på LB-plattor (sammanlagt 12 st) som skall märkas
med gruppnummer och provnummer. Rackla ut dropparna.
Inkubera plattorna över natt i 37oC termostat.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
>)'(EC(7890-4464)*/.),&/%-%(F1)4")('.255-%(6/3(6-#)%(*@,-.(,&44(4)*6)4-%G(
M
M
M
Demonstration av fenotypisk analys av lymfocyter i föreläsningssalen.
Utdelning av laborationsresultat.
En uppsättning prov från laborationen analyseras på Accuri C6 i föreläsningssalen.
>)'(EC(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%(F1)4")('.255-%(6/3(6-#)%(*@,-.(,&44(=$.-4<6%&%'66)4-%G(
M
M
M
M
Avläsning av resultatet i labsalen.
Räkna med hjälp av de plattor som har 20-200 kolonier ut hur många bakterier det
fanns i respektive rör.
Gör en Gram-färgning av bakterie 1 och 2. (se labkompendiet för en beskrivning av
färgning och mikroskopering).
Försök förklara resultatet.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./01-%)'$(020
APPENDIX
KOMPLEMENTSYSTEMETS BIOLOGISKA EFFEKTER
Komplementsystemet utgör genom den baktericida effekten en viktig del i det humorala
försvaret mot mikroorganismer, och systemet kan döda invaderande mikrober också i den preimmuna fasen. Komplementsystemet deltar också i regleringen av inflammationsprocessen
(kan både förstärka och begränsa reaktionen) och många klyvings-/degradationsprodukter från
komplementsystemet har biologisk aktivitet.
Produkt:
C2a
Biologisk effekt:
Ökar kärlpermeabiliteten
och kontraherar glatt muskulatur
C3a, C4a, C5a
Anafylatoxiner. Binder till receptorer på
granulocyter, makrofager, mastceller och
trombocyter, och frisätter därmed
vasoaktiva aminer och lysosomala
enzymer.
C3a
Kemotaktisk för eosinofila granulocyter
C5a
Kemotaktisk för granulocyter och
monocyter
C3b, iC3b, C4b
Opsoniner
C6-9
“Membrane attack complex” (MAC)
förorsakar membranskada som kan leda
till lys av en cell som binder komplexet.
C3e
Rekryterar granulocyter från benmärgen.
SJUKDOMAR ASSOCIERADE MED FEL ELLER BRIST PÅ EN
KOMPLEMENTFAKTOR
Defekt/brist:
C1q
Symptom/sjukdom:
Vaskulit, nefrit, SLE eller liknande syndrom,
hypogammaglobulinemi samt kroniska
bakteriella infektioner.
C1r
Recidiverande infektioner, njursjukdomar,
SLE eller liknande syndrom, reumatiska
sjukdomar.
C4, C2
SLE, infektionskänslighet
C3, C5, faktor H
Recidiverande infektioner med pyogena infektioner.
C6, C7, C8
Recidiverande infektioner med Neisseria.0
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
!"#$#%&%'()"(*)+,-.&-.(/01(,23$.0-44-.(3-#(+/354-3-%,(.-65-+,&"-(
)+,&"-.)#-(7890-44-.(/01(.&,2:&3)*(
;%4-#%&%'(
Avsikten med denna laboration är att den skall öka er förståelse för de avdödningsfunktioner
som är av betydelse för att skydda oss mot mikroorganismer och mot egna avvikande celler.
Fagocyterande vita blodkroppar och NK-celler är exempel på två olika celltyper som är
utrustade med avdödningsfunktioner, men även lösliga proteiner (exempelvis de som ingår i
komplementsystemet) kan döda andra celler. De fagocyterande cellerna behandlas inte under
laborationen och för en genomgång av deras avdödningsfunktion hänvisas till en föreläsning
som hålls under kursen.
Omkring 5-20 % av de mononukleära cellerna i blodet är NK-celler. De identifierades på 1970talet som stora granulerade lymfocyter och fick namnet ”Natural Killer cells”då dessa celler
kan döda tumörceller och virusinfekterade celler utan att först instrueras av antigenpresenterande celler. Till sin hjälp har NK-celler ett stort antal olika aktiverande och
inhiberande receptorer på cellytan. De inhibitoriska KIR-receptorerna känner igen MHC Ikomplexet som uttrycks av normala celler i kroppen, medan vissa aktiverande receptorer
känner igen proteiner som uppregleras på stressade och virusinfekterade celler. En annan
aktiverande receptor på NK-celler är CD16 – en Fc-receptor. CD16 binder till Fc-delen på IgGantikroppar. En cell med antikroppar bundna på sin yta kommer således att trigga en
aktiverande signal i NK-cellen och kan därför dödas av NK-celler via antikroppsberoende
avdödning (ADCC; antibody-dependent cell cytotoxicity).
När NK-cellen stöter ihop med en målcell kommer olika strukturer på målcellen binda in till de
olika NK-cellsreceptorerna. Vad NK-cellen slutligen gör (avdödning eller ej) bestäms av
balansen mellan aktiverande och
inhiberande signaler som skickas in i
NK-cellen (figur 1).
!
!
!
!
"#$%&!'(!4506'.7%-(06%"8.9%0"&&0:-,,-%0)$80%');-%"%0"&&0
+<+")0"50=>?:-,,-%0"(&'(.-(07&&%@:;-%0ABC0D0'0,'&-(0
7&)&%E:;('(.0F+5)0.-%0-(+")&07GG*$50&',,0)5"."0
'(*'#'&$%');"0)'.(",-%0'0=>?:-,,-(H0",&-%("&'5&07&&%@:;-%0
)&%-))G%$&-'(-%0F)9)$80ADC4H0-,,-%0,'."(+-%06<%0=CI0'0
)&$%07&)&%E:;('(.0F+5)0.-(-%-%"%0)&"%;"0";&'5-%"(+-0
)'.(",-%0'0=>?:-,,-(HJ0K(0;$8#'("&'$(0"50,'&-&0ABC0D?
7&&%@:;0$:*07&&","&0)&%-))G%$&-'(7&%@:;0<;"%0%');-(06<%0
"5+<+('(.0@&&-%,'."%-JJ0
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
Kronisk lymfatisk leukemi. Sjukdomen kronisk lymfatisk leukemi är en hematologisk
malignitet som karaktäriseras av en långsam men okontrollerad expansion av omogna
lymfocyter av B-cellskaraktär (B-KLL).
KLL drabbar ofta äldre män och många hinner med dagens behandlingar avlida av andra
orsaker än sin leukemi.
Flödescytometri. Flödescytometri är idag det absolut mest använda och kraftfulla verktyget
för immunologisk forskning. Principen bygger på att man binder en fluorescent (exciterbar)
fluorokrom till cellen, oftast kopplad till en antikropp, som sedan kan analyseras med en
flödescytometer.
I korthet så behandlas celler med en fluorokromkonjugerad antikropp eller färg, cellerna sugs
upp i flödescytometern och passerar sedan en eller flera lasrar. När infärgade celler passerar
lasern exciteras fluorokrom och det ljus som sedan emitteras från infärgade celler kan
detekteras.
På så sätt kan infärgade celler särskiljas från ofärgade. Genom att kombinera olika färger och
olika specifika antikroppar kan noggranna analyser av immunförsvarets komponenter göras.
Flödescytometern ger även grova mått på en cells storlek samt dess granulering.
Ovan syns en typisk fenotypning gjord med en flödescytometer. Denna typ av figurer kallas
dot-plots. I dot-plotten representerar varje prick en cell.
I dot-plotten längst till vänster är ”storlek” (Forward scatter; FSC) på x-axeln, och
granuleringsgrad (Side scatter; SSC) på y-axeln. Den inringade gruppen (populationen) i
mitten är lymfocyter och bara dessa celler visas sedan i dot-plotten i mitten, där CD3 finns på
x-axeln och CD56 på y-axeln. NK-celler som saknar CD3 kommer att hamna långt till vänster.
Däremot uttrycker de CD56 på sin yta och kommer därför hamna längst upp till vänster i den
blåa populationen. T-celler uttrycker alltid CD3 (T-cellsreceptorn) och kommer därför att
finnas till höger i plotten (grön population). I den högra dot-plotten visas sedan CD8 mot CD4.
Som nämnts på föreläsningarna fördelar sig de gröna T-cellerna i två olika populationer – en
population uttrycker CD8 (längst upp till vänster), den andra uttrycker CD4 (längst ner till
höger). I princip ingen cell uttrycker både CD4 och CD8.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
I den här laborationen använder vi oss av en Accuri C6 flödescytometer som är utrustad med
två lasrar och mäter FSC, SSC och fyra färger.
<=>,-(
Syftet med den första delen av laborationen är att låta er själva att utforma ett experiment som
kan utvärdera NK-cellers och/eller en terapeutisk antikropps (Mabthera®, rituximab) förmåga
att avdöda leukemiska celler samt att ge en inblick i hur cytotoxicitet kan mätas med moderna
laboratorietekniker.
Syftet med den andra delen av laborationen är att demonstrera komplementsystemets
bakteriedödande funktion. Komplementsystemet består av ett antal plasmaproteiner som från
en inaktiv form (zymogener), vid aktivering överförs till aktiva komponenter. Aktiveringen
sker på ett karakteristiskt sätt med en successiv förstärkning, sk kaskadeffekt. Aktiveringen kan
ske enligt två olika vägar som brukar kallas den klassiska respektive den alternativa vägen.
Den klassiska vägen aktiveras med hjälp av antikroppar (IgG1, IgG3 eller IgM) eller ett
mannosbindande plasmaprotein (MBP). Den alternativa vägen aktiveras direkt av den
främmande partikeln via t.ex endotoxin från G-negativa bakterier, teichonsyra från G-positiva
bakterier eller ytstrukturer på vissa virus och transformerade celler.
I ett appendix som återfinns i slutet av laborationshandledningen finns lite mer om
komplementsystemets biologiska effekter.
?$.2,6@,,%&%').("&#(7894)*/.),&/%-%(
Ni kommer att få tillgång till en tumörcellinje som kallas 221. Denna cellinje är en EBVtransfekterad cellinje av B-cellskaraktär. I denna laboration kommer vi att använda 221 som ett
substitut för KLL-celler (kronisk lymfocytisk leukemi). 221-cellerna uttrycker inte MHC I på
cellytan och kan alltså inte binda in till NK-cellernas KIR. Således kommer 221-celler inte
skapa en inhibitorisk signal i NK-celler utan kan dödas av NK-celler. 221-linjen kommer att
vara märkt med en fluorescent färg som heter PKH26. Den orange färgen gör det möjligt att
skilja 221-cellerna från NK-cellerna i den flödescytometriska analysen under dag II.
Genom att tillsätta en fluorescent färg med benämningen FarVid (görs av handledare 4h efter
laborationen) kommer även andelen döda celler att kunna analyseras med flödescytometer.
Ni har även tillgång till expanderade NK celler. Detta innebär att NK-celler har odlats och
”förökats” i cellodlingsflaskor under 3 veckor. Detta har gjorts för att få många aktiverade NKceller till laborationen. Alla grupper har således NK-celler från samma donator.
Rituximab (Mabthera®) är en monoklonal antikropp som används vid behandling av KLL.
Följande text är tagen från FASS och beskriver i korthet dess funktion vid behandling av KLL.
”Farmakodynamik
Rituximab binder specifikt till det transmembrana antigenet, CD20, ett icke glykosylerat fosfoprotein,
lokaliserat på pre-B och mogna B-lymfocyter. Antigenet uttrycks på > 95 % av alla B-cells nonHodgkinlymfom.
CD20 återfinns både på normala och maligna B-celler, men inte på hematopoietiska stamceller, pro-B-
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
celler, normala plasmaceller eller annan normal vävnad. Detta antigen internaliseras inte vid
antikroppsbindning och secerneras inte. CD20 cirkulerar inte i plasma som ett fritt antigen och
konkurrerar således inte om antikroppsbindningen.
Fab-domänen hos rituximab binder till CD20 antigenet på B-lymfocyter och Fc-domänen kan inrikta
immunsystemets effektorsteg till att mediera B-cellslys. Möjliga mekanismer för effektormedierad lys av
celler inkluderar komplement-beroende cytotoxicitet (CDC) som ett resultat av C1q-bindningen och
antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) medierad av en eller flera Fc!-receptorer på ytan av
granulocyter, makrofager och NK-celler. Genom bindning till CD20 antigenet på B-lymfocyter har
rituximab även visats inducera celldöd via apoptos.
Antalet perifera B-celler sjönk under normalvärdet efter att den första infusionen med MabThera
fullföljts. Hos patienter behandlade för hematologiska maligniteter började B-cellsnivåerna öka inom 6
månader efter avslutad behandling, för att återvända till normala värden mellan 9-12 månader efter
avslutad behandling. Hos patienter med reumatoid artrit observerades en omedelbar minskning av
antalet B-celler i perifert blod efter två MabThera-infusioner à 1000 mg givna med 14 dagars intervall.
Antalet B-celler i perifert blod började återkomma från vecka 24 och normalisering av B-cellsnivåerna
observerades hos majoriteten av patienterna efter 40 veckor, oavsett om MabThera gavs som
monoterapi eller i kombination med metotrexat.”
Fc-Block är en lösning som blockerar NK-celler och makrofagers Fc-receptorer, dvs de
strukturer som binder in den icke-specifika delen av en antikropp. Genom att använda Fc-block
omöjliggörs antikroppsmedierad cellulär avdödning (s.k. ADCC) av målcellen.
!%)4=6()"(#),)(
Den orange membranfärgen, PKH-26, exciteras av den blåa lasern (488nm) och emitterar ljus
runt 567nm. Flödescytometern kommer att identifiera 221-cellerna som celler med hög signal i
den orange detektorn (~567nm), medan blodgivarcellerna – som inte är orangefärgade –
kommer att ge en låg signal. För att bestämma hur
stora andel av 221-cellerna som har dött tillsätts en
färg som binder till döda celler. Färgen FARVID
tränger däremot in genom porerna i lyserade
tumörceller och färgar dem intensivt röda. Således
kommer döda tumörceller att kunna identifieras som
celler som både är färgade med PKH-26 och FARVID
(längst upp till höger i fig. till höger), medan levande
221-celler endast är PKH-26-positiva (uppe till
vänster). NK-cellerna kommer att detekteras som ickeorange, några av dem har eventuellt dött under
inkuberingen och kommer således att färgas in med
FARVID (nere till höger).
!
!
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
A),-.&)4(,&44(7890-4464)*/.),&/%-%(
1 provrör NK-celler, koncentration står angiven på röret.
1 provrör PKH26 färgade 221-celler, koncentration står angivet på röret
1 provrör Rituximab stamlösning, koncentration står angivet på röret.
1 provrör Fc-block, koncentration står angivet på röret
4 st 10 ml provrör
1 rör Iscoves´ medium kompletterat med 10% humant AB-serum
96 hålsplatta
8 st FACS-rör, 5 ml
Pipetter
A),-.&)4(>$.(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%(
Rör med normalt humant serum (NHS)
Rör med värmebehandlat NHS
Rör med bakteriesuspension 1 2x105/ml
Rör med bakteriesuspension 2 2x105/ml
Agarplattor (lb-medium) 12 st
Racklor (4st)
Pipetter
Vidallrör med kork
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
;%>$.()"#$#%&%'64)*/.),&/%B(#)'(CD(
Tänk noga igenom vilka olika experiment ni behöver göra för att undersöka NK-cellers cytotoxicitet
samt Rituximabs funktion i avseende på CDC, ADCC samt dess direkta apoptotiska effekt.
Beräkna vilka koncentrationer av NK-celler, 221-celler samt Rituximab ni vill använda för att uppnå
önskade ration. Tillsätt varje ”komponent” i en volym om 50!l. Avsluta med att sätta till medium så att
slutvolymen i varej brunn blir 200!l. Varje komponent kommer då att spädas ut 4 gånger (från 50!l till
200!l)
Ex. Pelle och Kerstin vill bl.a. undersöka rituximabs direkta cytotoxiska effekt på 221-celler. De vill
använda 100 tusen 221-celler och en koncentration av rituximab om (1"g/ml). För att kompensera
spädningseffekten av rituximab gör de en lösning som innehåller 4"g/ml. Sedan räknar de ut
koncentrationen som krävs för att 50"l 221-suspension skall innehålla 100 tusen celler.
Till brunn A1 sätter de: 50"l 221-celler, 50"l rituximab (4"g/ml) och 100"l medium (Totalt 200"l)
Till brunn A3 sätter de: 50"l 221-celler och 150"l medium (Totalt 200"l)
Vid dag II undersöker de hur stor andel av 221-cellerna som är döda i de två brunnarna. Skillnaden
utgör rituximabs cytotoxiska effekt.
Några saker att tänka på när ni utformar er laboration:
L
Späd NK-celler, 221-celler samt Rituximab till lämpliga koncentrationer i Iscoves´ medium,
tänk på att den totala volymen i brunnen inte får överstiga 200µl.
L
Sätt ut NK-celler, 221-celler, Rituximab samt Fc-block i lämpliga kombinationer för att
undersöka NK-cellers cytotoxiska effekt samt Rituximabs effekt. Tänk på att ta med kontroller
(som brunn A3 i exemplet ovan) så att ni har något att jämföra med.
L
En lämplig mängd 221-celler (målceller) är 100.000 celler/brunn. Anpassa mängden NK-celler
därefter.
L
Lämpliga förhållanden mellan NK celler och 221-celler är från 1:1 till 10:1
L
Lämpliga slutkoncentrationer av Rituximab är 1ug/ml och 5ug/ml
L
För att ha tid att analysera era experiment bör er uppställning
omfatta maximalt 8-12 brunnar. Kom gärna överens med en
annan grupp för att kunna jämföra olika ration eller
koncentrationer. Se bara till att ni har kontroller till era egna
försök.
L
Sätt alla prover i en rad efter varandra (se fig)
Före laborationsstart
Lämna in en kopia av ert laborationsprotokoll till labhandledarna. Protokollet skall inkludera en skiss
över er försöksuppställning, en beskrivning av genomförandet, samt en kort motivering till era val.
Sätt ert experiment på en 96-hålsplatta. Visa plattan för handledarna.
Efter 4h kommer labbhandledarna sätta till FarVID och fixera proverna.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
E,>$.)%#-B(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%B(#)'(C((
L
Till fyra Vidallrör pytsas enligt följande:
Rör 1
3 droppar
NHS
Bakteriesusp. 1
Bakteriesusp. 2
L
L
L
(
Rör 3
3 droppar
Rör 4
3 droppar
3 droppar
NHS-56
L
L
Rör 2
3 droppar
3 droppar
3 droppar
3 droppar
Inkubera rören (med propp) i 37oC i ca 30 min
Gör en spädningsserie 10-1, 10-2 och 10-3 från varje rör i fysiologiskt koksalt.
Förslagsvis 100µl bakteriesuspension till 900 µl koksalt.
Glöm inte att blanda ordentligt innan spädning och beakta steriltekniken.
Sprid 100 µl från varje spädning på LB-plattor (sammanlagt 12 st) som skall märkas
med gruppnummer och provnummer. Rackla ut dropparna.
Inkubera plattorna över natt i 37oC termostat.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
F)'(GB(7890-4464)*/.),&/%-%((
L
L
L
Resuspendera era prover försiktigt med en pipett
För över era prover till FACS-rör, glöm ej att märka era rör.
Avvakta er grupps tur att analysera proverna på FACSen (Accuri C6)
En labbrapport om en sida från varje grupp skall lämnas in.
Labbrapporten skall behandla följande frågor:
•
•
•
•
•
Vilka experiment gjorde vi?
Hur resonerade vi då vi planerade experimentet? Motivera brunnar ni satte.
Vilka resultat fick vi?
Vilka slutsatser kan vi dra av resultatet?
Finns det något vi kunde ha gjort annorlunda för att få en tydligare bild av NK-cellers
och Rituximabs funktion?
F)'(GB(+/354-3-%,4)*/.),&/%-%((
L
L
L
L
Avläsning av resultatet i labsalen.
Räkna med hjälp av de plattor som har 20-200 kolonier ut hur många bakterier det
fanns i respektive rör.
Gör en Gram-färgning av bakterie 1 och 2. (se labkompendiet för en beskrivning av
färgning och mikroskopering).
Försök förklara resultatet.
!"#$%"&'$()*"(+,-+('(./012310
APPENDIX
KOMPLEMENTSYSTEMETS BIOLOGISKA EFFEKTER
Komplementsystemet utgör genom den baktericida effekten en viktig del i det humorala
försvaret mot mikroorganismer, och systemet kan döda invaderande mikrober också i den preimmuna fasen. Komplementsystemet deltar också i regleringen av inflammationsprocessen
(kan både förstärka och begränsa reaktionen) och många klyvings-/degradationsprodukter från
komplementsystemet har biologisk aktivitet.
Produkt:
C2a
Biologisk effekt:
Ökar kärlpermeabiliteten
och kontraherar glatt muskulatur
C3a, C4a, C5a
Anafylatoxiner. Binder till receptorer på
granulocyter, makrofager, mastceller och
trombocyter, och frisätter därmed
vasoaktiva aminer och lysosomala
enzymer.
C3a
Kemotaktisk för eosinofila granulocyter
C5a
Kemotaktisk för granulocyter och
monocyter
C3b, iC3b, C4b
Opsoniner
C6-9
“Membrane attack complex” (MAC)
förorsakar membranskada som kan leda
till lys av en cell som binder komplexet.
C3e
Rekryterar granulocyter från benmärgen.
SJUKDOMAR ASSOCIERADE MED FEL ELLER BRIST PÅ EN
KOMPLEMENTFAKTOR
Defekt/brist:
C1q
Symptom/sjukdom:
Vaskulit, nefrit, SLE eller liknande syndrom,
hypogammaglobulinemi samt kroniska
bakteriella infektioner.
C1r
Recidiverande infektioner, njursjukdomar,
SLE eller liknande syndrom, reumatiska
sjukdomar.
C4, C2
SLE, infektionskänslighet
C3, C5, faktor H
Recidiverande infektioner med pyogena infektioner.
C6, C7, C8
Recidiverande infektioner med Neisseria.0
