Molekylär Cellbiologi
TENTAMEN I STRUKTURBIOLOGI
FREDAGEN DEN 4 FEBRUARI 2000
EFTERNAMN:……………………………....
FÖRNAMN:………………………………....
PERSONNUMMER:………………………..….
POÄNGSUMMA:
RESULTAT :
Glöm inte att skriva namn och personnummer på ev. lösa blad!
Tentamen innehåller 20 frågor som var och en ger 2 poäng. Till
flervalsfrågor finns ett korrekt svarsalternativ, om ej annat anges.
För G krävs 24 poäng och för VG krävs 32 poäng.
Omtentamen äger rum 26/2-00.
LYCKA TILL!
-2-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
1/ Följande påståenden om proteinstruktur är antingen Sanna eller Falska; markera med
S eller F för varje påstående.
( ) proteiner är i allmänhet hydrofoba på insidan och hydrofila på utsidan
( ) proteiner veckar sig spontant till sin nativa konformation
( ) globulära proteiner är lösta packade med många håligheter inuti
( ) prolin och glycin finns aldrig i helixar
2/ Vad är hypokromicitet?
a) ökad absorbans t ex i DNA/RNA när baserna stackas
b) minskad absorbans, t ex i DNA/RNA när baserna stackas
c) förändring till högre våglängd pga intermolekulära interaktioner
d) förändring till lägre våglängd pga intermolekulära interaktioner
e) minskad cirkulär dikroism pga sekundärstruktur formation
3/ Cirkulär dikroism kan användas för att analysera sekundärstruktur hos proteiner.
Vilken grupp av atomer i proteinet är det som ger den CD signal som är känslig för
sekundärstruktur? Ungefär vid vilken våglängd är den signalen tydligast?
f)
aromatiska sidokedjor (Trp, Tyr, Phe, His) vid 290-260 nm
g) aromatiska sidokedjor (Trp, Tyr, Phe, His) vid 260-180 nm
h) peptid gruppen vid 290-260 nm
i)
peptid gruppen vid 260-180 nm
j)
“helices” och “sheets” på 260-180 nm
4/ Vilka preparationsmetoder används normalt för TEM (transmissionselektronmikroskop) studier av biologiska makromolekyler? Vilken eller vilka av dessa
är av särskilt intresse för högupplösande studier?
-3-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
5/ Beskriv kortfattat varför två-dimensionella kristaller är "ideala" objekt för
högupplösande elektronmikroskopi.
6/ Man har inte kunnat hitta någon speciell kod för proteiners igenkänning av DNA, i
den meningen att varje DNA-nukleotid alltid skulle ha en viss aminoyra som den nästan
alltid binder till. Det finns dock ett ofta återkommande exempel på en sådan speciell
relation. Vilken nukleotid och vilken aminosyra gäller det? Vilken typ av bindning är
det fråga om och vilken del av nukleotiden är inblandad?
7/ Vad är skillnaden mellan s k ”direct readout” och ”indirect readout” när ett DNA
bindande protein läser av en DNA sekvens?
8/ Var hittar man oftast det aktiva centret i ”α/β barrel” stukturer?
-4-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
9/ Vilka skillnader skulle du vänta dig att hitta i det aktiva centret hos två enzymer, där
det ena är specifikt för aspartat och det andra för fenylalanin.
10/Markera i den schematiska (sidokedjorna visas som "R") pentapeptiden nedan
a) mellan vilka atomer det skulle finnas vätebindningar om peptiden har en α-helix
konformation
b) torsionsvinklarna Ď• , ψ , och ω vid respektive bindning i någon av de mittre
residuerna
H
N
H
O
R
H
C
C
N
C
N
R
H
H
H
O
R
H
C
C
N
C
C
N
O
R
H
H
O
H
C
C
O
R
11/ När kan man använda homologimodellering, och hur går det till i huvuddrag?
C
-5-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
12/ Varför kan inte en proteinkristall ha spegelsymmetri?
13/ Beskriv vilka steg som ingår i 3D-strukturbestämning av ett protein med
röntgenkristallografi. Utgå ifrån att proteinet finns tillgängligt i lösning.
14/ Vad är principen för “hanging drop” metoden vid proteinkristallisation?
-6-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
15/ Vidstående diagram visar
tre
idealiserade
cirkulärdikroism spektra. Identifiera
vilken typ av sekundärstruktur
de representerar:
A=
100000
80000
A
60000
40000
B
20000
B=
0
C=
180
190
200
210
220
230
240
-20000
C
-40000
-60000
16/ Obtaining sequence specific resonance assignments is an essential part of a
structural investigation of a molecule using Nuclear Magnetic Resonance. What does
this mean and give three examples of how this can be used to obtain information about a
macromolecule.
17/ Structures determined using NMR spectroscopy are generally represented by a
group or ensemble of structures. Why is this and how is this different than structures
determined by X-ray diffraction.
250
nm
-7-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
18/ The resonance frequency for a nucleus obeys the equation ν = -γ Beff/2π where ν is
the frequency, γ is the gyromagnetic ratio and Beff is the "effective" magnetic field at the
nucleus. The dependence of Beff on the chemical environment is one property that makes
NMR a very useful tool for chemists. The following two spectra are recorded of the
protein ubiquitin. One spectrum was recorded under conditions in which the protein
was in its native conformation and the other under conditions in which it had a
unfolded, "random" conformation. Which is which? Explain.
A
B
19/ Protein anatomy. Identify EACH of the following items in the cartoon picture of
pyruvate kinase below (draw a line around the item in the picture and connect the line
with the corresponding name in the list):
Antiparallel β sheet
Parallel β sheet
α helix
Domain
Loop/turn
20/ In 5 years time
-8-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
you find yourself as the head of a rational structure-based drug design group at the
pharmaceutical company $öderGen. For almost a decade, the largest source of income
for $öderGen has been a the drug MalaBort that has
proven effective in the treatment of malaria. Malaria is
one of the most serious and complex health problems
facing humanity in the 20th century. Approximately 300
million of the world's people are infected by the disease
and over 2 million people die from it every year. The
drug MalaBort inactivates a 15 kDa enzyme necessary
for the survival of Plasmodium falciparum, the
protozoan organism spread by the mosquito that causes
malaria.
P. falciparum infected red
Your colleagues have struggled for 2 years but still have
cells
not successfully cloned the protein and have only managed to purify 30 mg of the
enzyme. A total of 10 mg was used for amino acid sequence determination. Using this
sequence, a search of a protein sequence database identified >100 sequences with >
30% homology. However, the 3D structure has been determined for only one of these
homologous sequences.
Alarming numbers of MalaBort-resistant strains of P. falciparum are emerging and the
MalaBort patent is about to expire. $öderGen is expecting severe financial difficulties
if a new drug cannot be found in the next 6-12 months. Using your background in
structural biochemistry, what is your plan to find a new drug and save the
company? Which structural techniques would you favor, which not - Why?
-9-
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
RÄTTA SVAR
1. S S F F (0.5 poäng för varje rätt)
2. B
3. D
4. 1 .NEGATIVE STAINING eller NEGATIV KONTRAST
2. METALLSKUGGNING
3. FRYSFRAKTUR OCH FRYSETSNING eller REPLIKAMETODER (INGET
AVDRAG OM DENNA METOD INTE FINNS MED I SVARET, RELEVANT
HUVUDSAKLIGEN FÖR MEMBRAN)
4. FROZEN HYDRATED SPECIMENS eller AMORPHOUS ICE
5. INBÄDDNING I LÅGMOLEKYLÄRT, ICKE-FLYKTIGT MEDIUM (SOCKER
SÅSOM GLUKOS ETC)
DE TVÅ SISTNÄMNDA ÄR RELEVANTA FÖR HÖGUPPLÖSANDE STUDIER
5. TUNT PREPARAT
2. FÖRENKLAR MEDELVÄRDESBILDNING ÖVER ETT STORT ANTAL
MOLEKYLER
6. Arg- Gua, vätebindning, guaninbasen
7. direct readout: igenkänning av basernas kemiska natur; indirect readout:
ingekänning av DNAs form
8. vid den C-terminala delen av β-strängarna
9. aspartat: positivt laddade sidokedjor, eventuellt amider från peptidkedjan;
fenylalanin: hydrofoba, aromatiska sidokedjor
10. vätebindning från residue i till i+4:
11. Man har aa-sekvens och vill ha 3D struktur. Känner 3D struktur hos homologt
(besläktat) protein. Aa-sekvensidentitet > 30% (ca). Aligna sekvenserna. Börja
bygga en modell genom att använda koordinater från bevarade delar. Lägg till
loopar och sidokedjor. Försök bedöma modellens kvalité.
12. Vi har bara L-aminosyror (α-kolet är chiralt) i naturliga proteiner och de skulle vid
en spegling övergå i D-aminosyror
13. Kristallisera. Samla in röntgendiffraktionsdata. (Gör tungatomderivatkristaller och
samla in diffraktionsdata för dessa). Beräkna en elektrontäthetskarta och bygg en
modell som passar i denna. Förfina modellen. Bedöm kvalitén.
14. Ha en proteninlösning med låg koncentration av kristallisationsmedlet (t ex
ammoniumsulfat) hängande som en droppe i locket till ett kärl med koncentrerad
lösning av kristallisationsmedlet. Protein koncentrationen ökar då långsamt i
droppen till följd av avdunstning av de lättflyktiga ämnena i lösningsmedlet.
15. A=α, B=β, C=annat (“random coil”)
16. Identifiera alla toppar i spektret och ange vilken atom (proton) de kommer ifrån.
Vid strukturbestämning: NOE, J-koppling. Vid olika typer av titrationer för att att
- 10 -
Namn:………………………………...
Personnummer:………………………
något händer och även vilka aminosyror som är inblandade: Bindning av ligand till
protein, analys av pKa värden, folding-unfolding studier, m m, m m
17. Man kan inte mäta alla proton-proton avstånd och alla torsionsvinklar vilket gör att
det finns flera konformationer som lika väl passar med experimentdata. Vid
röntgenkristallografi har man mer mätdata och kan oftast hitta en mer unik lösning,
som då låter sig representeras av en modell.
18. A: unfolded; B: folded, fler skarpa toppar ty det finns fler unika omgivningar i ett
veckat protein
19. Proteinanatomi:
20. Plan: tag fram en substans som är aktiv mot ett protein från den resistenta formen av
P. falciparum. Förök snabba upp detta genom att använda strukturinformation om
det viktiga enzymet. Om det finns någon skillnad i aa-sekvens mellan detta protein i
den resistenta och den urspungliga formen så ger det en indikation om var vi skulle
kunna försöka angripa proteinet. 20 mg är i minsta laget för röntgenkristallografi,
EM tar vanligen lång tid. Det skulle kunna vara värt ett försök med NMR. Gör en
homolgimodell till att börja med.Gör också CD mätningar för att kontrollera
åtminstone sekundärstrukturinnehållet i modellen. Använd modellen för att se var
den ursprungliga drogen binder. Se efter om man kan modifiera drogen så att
bindningen förändras, eventuellt får vi då en substans som kan vara aktiv mot den
resitenta stammen.
