Sammanfattning Föreläsning Genteknik

advertisement
Sammanfattning Föreläsning Genteknik
OBS: Detta är endast sammanfattande punkter från de tre föreläsningarna och måste
naturligtvis kompletteras med läsning i boken. Allt ni behöver finns i boken på de
angivna sidorna nedan. Allt som ingår i dessa tre föreläsningar/kursen tas INTE upp i
sammanfattningen!
1. Molekylärbiologiska metoder (s. 146-154)
2. Kloning (s. 154-163)
3. Expression (s. 957-964)
Föreläsning 1. Molekylärbiologiska metoder:
a. Restriktionsenzymer
b. Hur kan DNA detekteras? Agarosgel, Etidiumbromid, Isotopmärkning av DNA.
c. PCR
d. Sekvensning
a. Restriktionsenzymer (restriktions-endonukleaser)





Känner igen specifika sekvenser av baser i dubbelsträngat DNA (figur s.147, mitten,
samt figur 5.1)
Naturlig roll i bakterie: att klyva främmande DNA, eget DNA skyddat
Används ofta vid kloning av gener då man kan klippa upp vektor samt klippa PCRamplifierad gen.
Sticky end eller blunt end (Figur 5.10)
Enzymet Ligas sammanför klippt DNA genom att bilda en fosfodiesterbindning.
b. Hur kan DNA detekteras?






Agaroselektrofores (sid 148, figur 5.2)
Agarosgel, DNA negativt laddat, vandrar mot katoden.
Separation med avseende på storlek hos fragment.
Minst fragment vandrar längst
Referens: ”stege”, blandning av DNA-fragment med känt antal baser.
Infärgning av DNA med Etidiumbromid (bas-analog) eller radioaktiv inmärkning
tex 32P.
c. PCR (polymerase chain reaction) Figur 5.7 (forstätter på sid 152)

Komponenter som ingår: Primers (2 st), dNTP:s, Värmestabilt DNApolymerase.
 Tre steg /cykel:
b. Separation/denaturering av DNA (95 °C)
c. Hybridisering av Primers (ca 54 °C) Primers interageras med 3’-änden hos
DNA-kedjan
d. DNA-syntes (72 °C). Polymeraset förlänger primer (5’-3’), en ny DNA-kedja
bildas.
Ca 20-25 cykler körs, man får då 2n DNA-strängar.
Primer:



Varje primer komplementär (inte identisk) till sin templat-sträng
Designas 5´ till 3’ (komplementär till 3’-änden hos templat-DNA)
Primer skall (oftast) innehålla tre delar: Komplementär del, restriktions-site, extra
baser för att restriktions-endonukleaset ska kunna binda in till DNA.
e. Sekvensering












Controlled termination of replication, SANGER DIDEOXY METHOD
Bestämmer sekvensen för nucleinsyra baserat på avbrott i
oligonucleotid-syntesen.
Enkelsträngat DNA (som skall sekvensbestämmas) används som templat
till syntes av komplementär sträng.
Ny sträng bildas från 5’ till 3’ (primer = start)
Syntesen avbryts slumpvis i alla möjliga positioner.
Avbrotten i syntesen beror på närvaro av 2´,3´-dideoxyribonucleosidtrifosfat (di-deoxy-analog) (fig. 149, mitt på sidan).
OH-gruppen 3´ saknas, ny fosfodiester-bindning kan inte bildas.
Låg koncentration av dideoxy-analogen gör att avbrotten sker slumpvis,
annars kulle avbrott ske vid första position bara. (fig. 5.4)
Elektrofores, autoradiogram ger ny sekvens.
Man kan även sätta fluorescent markör i di-deoxyanalogen, olika färg för
de olika analogerna (dATP, dTTP, dCTP, dGTP-analogerna)
Kapillär-elektroforres, separation map storlek.
Detektion av fluoroserande di-deoxyanalogen. (fig 5.5)
Föreläsning 2: Kloning
a.
b.
c.
d.
e.
f.
c-DNA, c-DNA-bibliotek
Repetition PCR
Restriktionsenzymer, hur fungerar de? Repetition
Plasmid/vektor.
Ligas
Design av primer
a. c-DNA (s.160-161)
Figur 5.20
Complementary DNA (c-DNA).
Fås från mRNA med Reverse Transcriptase som sytetiserar ny DNA-sträng.
1. mRNA-Ny DNA-sträng.
2. mRNA-strängen förstörs sedan
3. En komplementär DNA-sträng till den första kan sedan bildas.
I första steget utnyttjar man poly(A) sekvenser i 3´änden av mRNA. Poly(T)-primer, syntes av
Ny DNA-sträng.
I andra steget förstörs mRNA-kedjan tex med högt pH (DNA klarar det).
I steg tre förlänger man 3’-änden hos den nya DNA-strängen med poly(G). Detta görs av
enzymet terminal transferase. En ny primer, poly(C) kan nu användas, följt av syntes av
DNA-sträng nr2. Nu har man alltså från mRNA fått två nya komplementära DNA-strängar för
en gen.
d. Vektorer som vanligen används för kloning följt av replication/expression i e-coli
1. Plasmider/vektorer – Bakteriellt DNA
2. Lambda bakterofag (λ-phage) - Virus
Plasmid:
 Dubbelsträngat cirkulärt DNA som finns hos bakterier.
 Kan optimeras för kloning = Vektor
 Vektor har gen som kodar för an tibiotikaresistens.
 Lätta att klona i
 Snabb replikation
 Kan förutom antibiotikaresistens ha gen för klonings-kontroll = Reporter-gene.
Exempel: vektor som har gener för ampicillin och tetracyclinresistens. Man klonar in
”sin” gen i tetracyclingenen och förstör därmed resistensen för tetracyclin
(Insertional inactivation). Bakterier innehålland vektor där man lyckats klona i
tetracyklinresistensen-genen blir då känsliga för tetracyclin men inte för ampicillin.
(Figur 5.12 s. 155)
 Lagringsvektor:
- origin of replication (fig 5.12)
- kopiering av vektor
- Antibiotikaresistens
- Restriktions-sites för klyvning med enzymer.

Uttrycksvektor: (för produktion av stora mängder protein)
-
promotor-region (transkription av stor mängd protein-kodande DNA)
(Lac-operon)
restriktions-sites
Gen/gener för antibiotikaresistens
e. Ligase (enzym för att ligera/reparera avbrott i dsDNA)


Katalyserar bildning av en fosfodiesterbindning där brott i DNA-kedjan finns.
Kräver 3’ OH, 5’ phosphorylgrupp
Föreläsning 3: Expression



Avskrivning av gener, proteiner uttrycks
Transkriptionen måste starta
Proteiner som startar/undertrycker uttryck av proteiner (regulatoriska proteiner)
känner igen och binder till specifika DNA-sekvenser. (fig. 31:1, 31:2, 31:3)

Efter kloning av utvald gen in i vektor transformeras vektorn in i en bakterie. För att
avskrivning av gen skall kunna starta och därmed leda till uttryck av proteiner måste
”signal” ges till bakterie/vektor att avskrivning/uttryck skall starta. Uttrycket styrs av
reglerande mekanismer eftersom bakterien endast uttrycker de proteiner den verkligen
behöver, allt annat kostar energi. Genom att bakterien kan reglera uttrycket sparar den
energi.
Repressor/Inducer undertrycker/startar uttryck av gen.









Lac-operonet: (s. 958 vidare, samtliga figurer, tex 31.7 och 31.10 som visar struktur
och funktion av lac-operonet)
i: regulatorisk gen, repressor/regulator-protein
o: operator site, bindningsställe för repressorn/regulator
z,y,a strukturella gener, β-galaktosidase, permease, transacetylase. Alla dessa gener
uttrycks i lika hög grad eftersom alla dessa behövs för att göra en påverkan i bakterien.
Samma mRNA för alla dessa. (figur 31.10). Repressorn/regulatorn bildas först då
RNA-polymerase kan binda in till första promotor-regionen. Repressorn binder sedan
in till operator site. Om repressorn är bundet till DNA kan inte RNA-polymerase
skriva av de strukturella generna (31:10A). Om repressorn släpper kan polymeraset
vandra längst DNA-kedjan för att bilda mRNA och senare kan proteinerna för z,y,a
bildas. (figur 31.10 B)
För att lac-repressorn skall släppa DNA måste detta enzym binda in en ligand
(inducer) som ger en strukturförändring av enzymets struktur. Interaktionen till DNA
bryts då.
Inducer, tex IPTG (fig s. 962)
β-galaktosidase katalyserar hydrolys av laktos till Galaktos samt Glukos (figur s. 960)
Annat substrat för detta enzym är X-Gal som vid nedbrytning ger en blå produkt (fig s
960, överst). Detta kan utnyttjas i labbet för att se om man lyckats klona in främmande
DNA i Z-genen i Lac-operonet. X-Gal kommer då inte att kunna brytas ner (βgalaktosidase kan inte uttryckas) och vi får ingen blå produkt.
Ordlista:
Templat
Annealing
Amplifiera
ursprunglig DNA sträng
Sammansmältning, tex då primer fäster in till templat
kopiera
Download
Random flashcards
Svenska

105 Cards Anton Piter

Create flashcards