Tentamen i Genteknik, TFKE38 2009-10-16
1) Vid molekylärbiologiskt arbete används en del termer och tekniker. Förklara kortfattat
nedanstående termer eller tekniker och användningsområde.
Restriktionskarta
Transformering
Lysering
His-tag
Plaques
(10p)
S: Restriktionskarta: relativa positionen på restriktionsites används för att lättare
kunna klona DNA bitar utan att behöva ha vetskap om DNA sekvensen,
transformering: sätt att föra in DNA i bakterier används vid kloning, Lysering:
sprängning av cellvägg används för tex rening av plasmider, His-tag: sekvens av
aminosyror som fuseras med klonad gen för att underlätta rening med metall
bindande kolonn, Plaques. Virus på en agarplatta blir i form av plaques
2) Vid kloning brukar man använda ett antal olika typer av vektorer.
a) I många fall brukar man använda olika typer av plasmider. Vad kännetecknar
dessa.
(4p)
S: Cirkulärt DNA med antibiotikaresistens, Skilja på ”förvaringsplasmider” och
expressionsplasmider, för den senare kan man uttrycka genen.
b) Virusbaserade vektorer används ofta inom molekylärbiologin. Kan du ange två
olika typer av virusbaserade vektorer? Vilka fördelar och nackdelar finns det att
använda virusbaserade vektorer?
(6p)
S: M13och lambda fag, Fördelar med fagbaserade vektor är att man kan erhålla ssDNA och väldigt lätt införa DNA i en värdcell, nackdel begränsad storlek på
genomet som ska införas och avsaknad antibiotikaresistens som selektionsmarkör.
3) Tre olika metoder för DNA arbete är PCR, agarosgelelektrofores och DNA
sekvensning.
a) Valet av DNA polymeras är viktigt amplifiering med PCR, varför?, vad bör man
tänka på?
(2p)
S: Man bör tänka på proofreading och processitivitet för olika DNA polymeraser.
b) Detektion av DNA band vid agarosgelelektrofores sker oftast med etidiumbromid
(eller SyBrsafe). Hur detekteras DNA band med Etidiumbromid? Varför syns
lättare DNA (=band som vandrat längst på gelen) svagare än tyngre DNA band?
(2p)
S: Agarosgelen nendsänks i etidiumbromidlösning för att sedan belysas med UVljus. Ju kortare DNA band desto färre etidiumbromidmolekyler som kan
interkalera med DNA:t därav svagare band.
c) DNA sekvensning är en flitigt använd teknik för att bekräfta t.ex punktmutationer
med lägesspecifik mutagenes. I de flesta fall används en teknik som kallas
Sangers dideoxy-metod, där en blandning deoxy- och dideoxynukleotider tillsätts
till sekvensreaktionerna. Beskriv kortfattad hur denna metod fungerar.
(2p)
S: Fyra provrör med dNTP blandning samt en av dideoxyvarianterna blandas med
primer DNA templat och DNa polymeras. Fragmenten separeras på en
polyakrylamidgel med urea och separation sker med avseende på storlek
c) Efter DNA sekvensning erhölls nedanstående resultat (Figur 1). Då man var
intresserad att få bra sekvens i 5’änden valde man att göra om försöket med
ändrade förhållande mellan dNTP och ddNTP. Hur ska man ändra detta
förhållande för att få bra sekvens i 5’ änden . Motivera ditt svar.
(4p)
S: för att förbättra sekvensen i 5´-änden kan man ändra förhållandet mellan didexy
och deoxy nukleotid så att man har mer didexy för att få tidigare stopp och
tydligare sekvens i denna region.
5´cntgGtanGGcCaTTaCGGCCGGGgatcaAAAAGATCGGCTACAACCcnnnnnnanncGCGTTTGTTCCcA
TTTCCGGCTGGCATGGAGATAATATGCTGGAGCCATCTTCTAAGATGCCCTgGTTCAAAGGATGGTCTGTG
GAGCGTAAGGAAGGCAAAGCCGACGGCAAATGCCTTATCGAAGCCCTCGATGCTATCCTGCCACCCACTAG
ACCGACCGATAAGGCCCTTCGTCTTCCCCTTCAGGACGTGTACAAGATTGGTGGTATTGGAACAGTACCTG
TCGGTCGTGTCGAGACTGGTGTGTTGAAACCCGGTATGGTTGTTACCTTTGCACCTGTTGGACTGACCACT
GAAGTTAAATCCGTCGAAATGCATCACGAAGCCCTTCAAGAAGCTGTGCCTGGTGACAATGTTGGTTTCAA
-3’
Figur 1. DNA sekvensresultat (små bokstäver av de fyra nukleotiderna (a,c,g,t) anger
osäkerhet i sekvensen, bokstaven n anger att nukleotiden inte kunde bestämmas.
4) För att förändra i t.ex. klonade gener är lägesspecifik mutagenes en användbar metod.
a) Beskriv detaljerat någon metod för hur man med lägesspecifik mutagenes
förändrar en gen. Vad bör man tänka på vid design av primers, val av DNA
polymeras, vektor och värdcell?
(6p)
S: se labkompendiet i lägesspecifik mutagenes
b) Andra typer av mutagenes är random mutagenes och ”sticky-feet” directed
mutagenes. Vad har dessa två typer av mutagenes för användningsområde?
(4p)
S: Random mutagenes används för att skapa ett bibliotek av varianter för att t.ex
studera olika proteinvarianters egenskaper, sticky feet directed mutagenes används
som ett alternativt kloningssätt utan att använda sig av restriktionssites.
5) I ditt forskningsprojekt har du fått till uppgift att klona proteiner från den intressanta
arten saharisk ökenmyra (Cataglyphis fortis). Då ingen DNA sekvens tidigare finns från
denna art bestämmer du dig för att göra ett cDNA bibliotek och utifrån detta klona
intressanta proteiner från ökenmyran. (OBS! Totalt 20 p för denna uppgift)
a) Vad är skillnaden mellan ett genomiskt bibliotek och ett cDNA bibliotek?
(2p)
S: Ett genomiskt bibliotek innehåller hela genomet, CDNA bibliotek endast de gener
som uttrycks i den specifika vävnaden och innehåller inte introner.
b) Beskriv kortfattat hur du gör ett cDNA bibliotek
(2p)
S: Gene cloning boken sid 134, fig 8.7 . Viktigt att ta med i beskrivning Poly-A svans
, omvänt transkriptase
c) Efter mycken möda har du lyckats göra ett cDNA bibliotek från ökenmyran. Ett
protein som du väljer att klona är det glykolytiska enzymet GAPDH
(glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas). Med hjälp av den evolutionärt
närbesläktade arten bananfluga (Drosophila melanogaster) designar du primers
för att hitta GAPDH genen hos ökenmyra. Beskriv hur du designar primers för att
hitta genen av GAPDH (ledning homologijämförelse av GAPDH genen för
människa och bananfluga, Figur 2, genetiska koden, Figur 4).
(6p)
S: Designa primer efter en konserverad region i DNA:t använda denna primer
tillsammans med en vektorprimer för att amplifiera N-terminal resp C-terminal av
proteinett från biblioteket. Sekvensa dessa amplifiera fragment för att kunna
knstruera primer som passar till start och stopp av genen.
ATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGG
::: ::::
::::: : ::::::::::: :: :: :: ::: ::::
: :
ATGTCGAAG------ATCGGAATTAACGGATTTGGCCGCATCGGCCGCTTGGTGCTCCGC
GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATA---TTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTGAC
:: :: : :
::: : :
: :: ::: :::: :: :::::::: ::
GCCGCCATCGA------TAAGGGCGCCTCCGTGGTGGCCGTCAACGATCCCTTCATCGAT
CTCAACTACATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACC
::::::::::::::::: :::: ::: :: :: :: :: ::
::: : ::::::
GTCAACTACATGGTTTACCTGTTTAAATTCGACTCGACTCACGGTCGTTTCAAGGGCACC
GTCAAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAG
::
::::::: :::
:: :: : :: :: :
:::::: : :::
:::
GTTGCGGCTGAGGGCGGATTCCTGGTGGTGAACGGCCAGAAGATCACCGTGTTCAGCGAG
CGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACT
:: :: :: :::: ::::: :::: : :::::: :: ::::: :: :::::::::::
CGCGACCCGGCCAACATCAACTGGGCCAGTGCTGGAGCCGAGTATGTGGTGGAGTCCACC
GGCGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGCAGGGGGGAGCCAAAAGGGTC
:: :: ::::::::::: :: :::::
: :: ::: :::: :: ::::: : ::::
GGAGTGTTCACCACCATTGACAAGGCGTCCACCCACTTGAAGGGCGGCGCCAAGAAGGTC
ATCATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCATGAGAAG
:::::::: ::::: :: :: ::::: :::::::::::
:: :: :::: ::
ATCATCTCGGCCCCATCCGCCGATGCGCCCATGTTCGTGTGCGGCGTTAACCTGGACGCC
TATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACCC
::
: : : : ::: : :: ::: ::::: ::::::::::::::: : :: :::
TACAGCCCCGACATGAAGGTGGTCTCCAACGCCTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCTCCC
CTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCAT
::::::::::::::: :::::::::: : ::::: :: :: :: :::::::: :: ::
CTGGCCAAGGTCATCAATGACAACTTCGAGATCGTCGAGGGTCTGATGACCACCGTGCAC
GCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGC
:::: :::::::::::::::::: :: :: :: ::::: :: ::::::::::: :::::
GCCACCACTGCCACCCAGAAGACCGTCGACGGTCCCTCTGGCAAACTGTGGCGCGATGGA
CGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAG
:: :: ::
::::::::::::::: ::: : :: :: :: ::::::::::::::::::
CGTGGCGCCGCCCAGAACATCATCCCGGCCGCCACCGGAGCCGCCAAGGCTGTGGGCAAG
GTCATCCCTGAGCTAGACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAAC
:::::::: : :: :::: ::::: :: :::::::: ::::: :: ::::: ::::
GTCATCCCCGCCCTGAACGGCAAGCTGACCGGCATGGCTTTCCGCGTGCCCACGCCCAAT
GTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAG
:: :: :: ::::: :: ::: ::: : : ::
:::: ::::: :: ::::::
GTCTCCGTTGTGGATCTTACCGTCCGCTTGGGCAAGGGAGCCACCTATGACGAAATCAAG
AAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAAGGCATCCTGGGCTACACTGAGCAC
::: :: :::: :: :::: ::::: :: :: :::::::::::::: :: :
GCTAAGGTCGAGGAGGCCTCCAAGGGACCCCTGAAGGGAATCCTGGGCTACACCGATGAG
CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCT
::::::::::: : :::::: :::::::::::: :: ::
:: :::::
::::
GAGGTGGTCTCCACCGACTTCTTCAGCGACACCCATTCGTCTGTGTTCGACGCCAAGGCT
GGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGC
:::::: : :: ::::: : :: :::::::: :: :: ::::: :::::::: :: ::
GGCATTTCGCTGAACGATAAGTTCGTCAAGCTAATCTCGTGGTACGACAACGAGTTCGGT
TACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3’ Human
::: :::: : :: : ::::: ::
: :::
:::::: :::
TACTCCAACCGCGTCATCGACCTGATCAAGTATATGCAGAGCAAGGACTAA-3’ Drosophila
Figur2. Homologijämförelse människa och bananfluga av GPDH genen
d) Vid kloning för att göra ett DNA bibliotek (genomiskt eller cDNA) är valet av
vektor väldigt viktigt. Vad bör man tänka på i valet av vektor då man gör ett
genomiskt bibliotek eller cDNA bibliotek?
(2p)
S: För DNA bibliotek används ofta den virusbaserade vektorn lamda då man kan
klona in relativt stora fragment och att man har effektiv införsel (transfektion) i en
värdcell
e) Du väljer att använda Taq polymeras för att hitta genen från ditt cDNA bibliotek
för att du vill använda dig av TA-kloning av din PCR produkt. Vad menas med
TA kloning? Och varför är Taq polymeras speciellt lämpligt för detta ändamål?
(2p)
S: Med TA kloning menas att man ett T-överhäng på vektorn och PCR produkt har
ett A-överhäng detta är särskilt lämpligt med Taq polymeras då den ger Aöverhäng i 3´-änden.
f) Efter att du klonat in PCR fragmenten transformerar du TA plasmiden. Hur går
transformeringen till och vilka två typer av transformering finns det?
(2p)
S: kemisk transformering och elektroporering
g) För att bekräfta att du lyckats med din kloning bestämmer du dig för att sekvensa
4 stycken plasmider plockade från agarplattan efter transformationen. Till din
stora glädje ser du att GAPDH genen finns inklonad i alla 4 klonerna. Men
närmare titt på aminosyrasekvensen för de olika klonerna visar att de skiljer sig åt
(Figur 3) Vad tror du detta beror på och hur ska du fortsättningen göra för att
undvika detta? Vilken är den korrekta aminosyrasekvensen?
(4p)
S: Felet beror antagligen på Taq polymeraset och genom att jämföra de fyra
sekvenser får man en konsensussekvens som är den riktiga sekvensen, dvs den
översta sekvensen. Ett sätt att undvika detta är att sekvensa dirket på PCR produkt
innan kloningen elleer att byta ut Taq polymeraset till ett DNA polymeras med
bättre proofreading.
MSKIGINGFGRIGRLVLRGGFLVVNGQKITVFSERDPANINWASAGAEYIVESTGVFTTIDKASTHLK
MSKIGINGFGRIGRLVLRGGFLVVNGQKITVFSERDPANINWASAGAEYIVESTGVFTTIDKASTHLK
MSKIGINGFGRIGRLVLRGGFLVVNGQKITVFSERDPANINWASAGAEYIVESTGVFTTIDKASTHLK
MSKIGINGFGRIGRLVLRGGFLVVNGQKITVFRERDPANINWASAGAEYIVESTGVFTTIDKASTHLK
******************************** ***********************************
GGAKKVIISAPSADAPMFVCGVNLDAYKPDMKVVSNASCTTNCLAPLAKV
GGAKKVIISAPSADAPMFVCGVNLDAYKPDMKVVSNASCTTNCLAPLAKV
GGAKKVIISAPSADAPMLVCGVNLDAYKPDMKVVSNASCTTNCLAPLAKV
GGAKKVIISAPSADAPMFVCGVNLDAYKPDMKVVSNASCTTNCLAPLAKV
*****************:********************************
INDNFEIVEGLMTTVHATTATQKTVDGPSGKLWRDGRGAAQNIIPASTGA
INDNFEIVEGLMTTVHATTATQKTVDGPSGKLCRDGRGAAQNIIPASTGA
INDNFEIVEGLMTTVHATTATQKTVDGPSGKLWRDGRGAAQNIIPASTGA
INDNFEIVEGLMTTVHATTATQKTVDGPSGKLWRDGRGAAQNIIPASTGA
******************************** *****************
AKAVGKVIPALNGKLTGMAFRVPTPNVSVVDLTVRLGKGASYDEIKAKVQ
AKAVGKVIPALNGKLTGMAFRVPTPNVSVVDLTVRLGKGASYDEIKAKVQ
AKAVGKVIPALNGKLTGMAFRVPTPNVSVVDLTVRLGKGASYDEIKAKVQ
AKAVGKVIPALNGKLTGMAFRVPTPNVSVVDLTVRLGKGASYDEIKAKVQ
**************************************************
EAANGPLKGILGYTDEEVVSTDFLSDTHSSVFDAKAGISLNDKFVKLISW
EAANGPLKGILGYTDEEVVSTDFLSDTHSSVFDAKAGISLNDKFVKLISW
EAANGPLKGILGYTDEEVVSTDFLSDTHSSVFDAKAGISLNDKFVKLISW
EAANGPLKGILGYTDDEVVSTDFLSDTHSSVFDAKAGISLNDKFVKLISW
***************:**********************************
YDNEFGYSNRVIDLIKYMQSKD
YDNEFGYSNRVIDLIKYMQSKD
YDNEFGYSNRVIDLIKYMQSKD
YDNEFGYSNRVIDLIKYMQSKD
**********************
Klon1_GAPDH
Klon2_GAPDH
Klon3_GAPDH
Klon4_GAPDH
Figur 3. Sekvensjämförelse av GAPDH från 4 stycken kloner.Avvikelse i sekvensen
markerad i fet stil.
Figur 4. Genetiska Koden
