Lösningsförslag 9KEA21 2010-12-18:
1.
Gås ej igenom men har ni frågor kring denna uppgift kan ni kontakta Magdalena
([email protected], 285686).
a) Laddade sidokedjor hos enzymet protoniseras/deprotoniseras beroende på om pH sänks eller
höjs. Detta kommer att påverka strukturen (interaktioner bryts eller bildas). När strukturen
påverkas så påverkas funktionen. Kymotrypsins mekanism är beroende av deprotoniserad Asp
och His. His pKa 6. Vid måttlig pH-sänkning protoniseras His och kommer inte att kunna
fungera som protonrelä. En måttlig pH-höjning har större möjlighet att ”tolereras” av enzymet.
(Asp och His ändras inte).
b) Gelfiltrering = separation efter storlek vilket SDS-PAGE också gör. Därför ingen ytterligare
information med den tekniken. Mw och pI kan erhållas från 2D vilket ger mer information.
c) Proteinets pI. Proteiner oftast stabila runt pH 7. Så idealt med pH 7 på bufferten vid
kromatografin. Proteiner med pI under 7 är –laddade vid pH 7 alltså binder de in till en
anjonbytare. Vid pH 7 kan du använda dig av en Tris-buffert. (Man vill oftast binda in det
protein man söker eftersom chansen att få det rent ökar genom att man kan använda
gradienteluering. Om det sökta proteinet inte binder kommer ju eventuellt andra proteiner med
lika laddning att sameluera.) Bättre separation, fast hög jonstyrka så eluerar alla proteiner med
liknande pI samtidigt. Gradienteluering gradvis ökande jonstyrka. Inbindning generellt vid låg
jonstyrka och eluering vid hög. Protein med lägst pI eluerar först.
2.
Gås igenom som uppgift 3
a) vmax = 1.2 µmol/min och KM = 7.1 µM
b) X är en kompetitiv inhibitor eftersom linjerna skär varandra på y-axeln, d v s vmax ändras inte i
inhibitorns närvaro. Inhibitionskonstanten beräknas genom att man ser på skillnaden i lutning
på linjerna i närvaro respektive frånvaro av inhibitor. Skillnaden i lutning är 1+([I]/K I).
Beräknas; Lutning i närvaro av inhibitor = Lutning i frånvaro av inhibitor ∙ (1+([I]/KI)).
I uppgiften saknas dock uppgift om inhibitorns koncentration vilket omöjliggör beräkning av
ett siffervärde.
c) Ger ett mått på enzymets effektivitet. Anger hur mycket substrat som omvandlas till produkt
per enzymenhet och per tidsenhet.
3.
Gås igenom som uppgift 5
a) DNA dubbelsträngat – RNA enkelsträngat
DNA innehåller C,G,A,T – RNA innehåller C,G,A,U
Sockret i DNA är deoxyribos – sockret i RNA är ribos
b) Effektiv tätpackning i kärnan (upplindning på positivt laddade histoner)
Stabilitet – står emot basisk hydrolys
c) Båda DNA-kedjorna ska fungera som mall för DNA-syntesen, så den ena exponeras alltså 3’
till 5’ och den andra 5’ till 3’. DNA-polymeraser rör sig från mallens 3’-ände till 5’-änden och
syntetiserar ny kedja 5’ till 3’. För att detta ska fungera måste den ena mallkedjan göra en loop
och den nya kedjan måste syntetiseras diskontinuerligt. Enzymet som kopplar samman
Okazakifragmenten heter DNA-ligas.
d) Kemiska mutagener kan vara ämnen som liknar de vanliga kvävebaserna och inkorporeras i
deras ställe eller ämnen som modifierar befintliga baser eller ämnen som binder till
(interkalerar med) DNA och uppfattas som en kvävebas.
e) DNA-polymeraser har s k exonukleasaktivitet, d v s kan korrigera sina misstag. Ett startställe
för transkription består av en specifik sekvens 35 baser ifrån startstället (-35-regionen) och en
specifik sekvens 10 baser ifrån startstället (Pribnow-boxen).
f) Rätt aminosyra på rätt tRNA – aminoacyltRNA-syntetasreaktionen. Inbindning av tRNA med
aminosyra till F-sitet tillsammans med elongeringsfaktorn EF-Tu. Om korrekt = hydrolys av
GTP och flytt till A-sitet. Den sekvens som visas i A-sitet ska stämma överens med tRNAts
antikodon.
4.
Gås ej igenom men har ni frågor kring denna uppgift kan ni kontakta Helena
([email protected], 285605).
a) I prokaryoter börjar translationen redan innan transkriptionen är färdig och i eukaryoter
processas det primära transkriptet genom att intronerna klipps bort (’splicing’) innan
translationen påbörjas.
b) AUG och GUG
c) En tyst mutation är en förändring på DNA-nivå som ej kommer till uttryck på proteinnivån.
Eftersom den genetiska koden är degenererad, d v s en aminosyra har flera koder så kan ju en
kod muteras till en annan som ändå kodar för samma aminosyra.
d) Substitution: en bas byts ut mot en annan
Deletion: en bas tas bort
Insertion: en extra bas sätts in
e)
5.
cDNA-bibliotek och genomiska bibliotek. Ett genomiskt bibliotek innehåller hela genomet
medan ett cDNA-bibliotek innehåller de gener som uttrycks för en speciell vävnad, t.ex i ett
cDNA-bibliotek från bukspottskörteln finns de gener som just uttrycks i bukspottskörteln.
Gås igenom som uppgift 6
a)
PCR bygger på att man använder ett värmetåligt polymeras och att man tillsätter primer (korta
DNA-bitar) som binder specifikt till delen av DNA:t som man vill kopiera. Genom att variera
oftast tre olika temperaturer får man en exponentiell amplifiering av DNA-fragmenten. Se
även figur sid 140-141 i Stryer. Förutom nämnda komponenter behövs även dNTP och buffert.
b) I brunn 1 har du ett band som motsvarar ~300 baspar (104aa=312 baspar) vilket är det lyckade
försöket.
c) I en agarosgel sker separation med avseende både på storlek och konformation. DNA:t är
negativt laddat och vandrar mot pluspolen. Minsta fragmenten går snabbast. Infärgning sker
genom att tillsätta det DNA-bindande ämnet etidiumbromid som vid belysning med UV-ljus
fluorescerar.
d) Expressionsplasmid och DNA-fragment klyvs med samma restriktionsenzymer och blandas i
närvaro av DNA-ligas. Blandningen transformeras in i E. coli-celler som har möjlighet att ta
upp plasmiden. De E. coli-celler som har antibiotikaresistens har tagit upp plasmid.
e) Se figur 899 i Stryer. Styrning av produktion sker med IPTG som fungerar som en syntetisk
inducer.
