Edvard Rask
Utbyte av sällsynta koder i DNA kan ge bättre proteinproduktion
Arkeaer är ett släkte av organismer som delvis är besläktade med bakterierna och delvis med
de högre eukaryota organismerna. Inom detta släkte finns majoriteten av de organismer som
kan leva under extrema temperaturer, de s.k. hypertermofila organismerna. Detta arbete har
inriktats på att förbättra produktionen av ett värmetåligt enzym från den hypertermofila
arkean Archaeoglobus fulgidus. Enzymet som kallas för cylodextrin glukanotransferas
(CGTas) har förmågan att modifiera amylos (en av beståndsdelarna i kolhydraten stärkelse)
på ett antal olika sätt. Bland annat har enzymet förmågan att glykosylera, dvs. sätta på
sockergrupper på, många olikartade molekyler. Liknande varianter av detta enzym finns även
hos andra mikroorganismer. Fördelen med CGTaset från A. fulgidus (AfCGTas) är att det är
aktivt och stabilt även vid 90 °C. Vid denna höga temperatur kan reaktionshastigheten ökas
samtidigt som andelen biprodukter minskar. Man studerar nu AfCGTaset för att försöka
förbättra det ytterligare med avseende på bl.a. reaktionsspecificitet. Många av de
analysmetoder som behövs för att studera AfCGTaset kräver stora kvantiteter av enzym för att
fungera. I detta arbete vill vi därför få större mängder av enzymet genom att modifiera dess
gen till att bättre passa in i den Escherichia coli stam som vi använder för att producera
enzymet i. Man använder E. coli eftersom man med denna bakterie kan kontrollera
produktionen av CGTas på ett bra sätt. Men trots detta lyckas man inte få en hög produktion
av enzymet.
Arvsmassan (dvs. DNA:t) består av koder som, via mellansteget av en mRNA molekyl, kodar
för aminosyrorna i det färdiga enzymet. Den dåliga produktionen tros bero på att koderna i
DNA:t inte används i samma utsträckning i E. coli jämfört med i A. fulgidus. Jag har därför,
med hjälp av mutationer, ändrat specifika koder i början av DNA:t till koder som fortfarande
kodar för samma aminosyror, fast som gör detta i en högre takt. Resultaten ger viss antydan
på att produktionen av enzymet kan ha ökat efter mutationerna. Det ser däremot ut som att de
ändrade baserna samtidigt ändrar strukturen av mRNA:t (dvs. den molekyl som för
information mellan DNA:t och det färdiga proteinet) och gör det mer ostabilt. Detta gör i sin
tur att mRNA:t snabbare faller sönder och det kan därför inte användas lika länge för att
producera vårt enzym.
Handledare: Eva Nordberg-Karlsson, Catherine J. Paul
Examensarbete, 30 hp i Biokemi, 2009
Avdelningen för Bioteknik, LTH, Lunds universitet
Edvard Rask
Exchanging rare codons in the 5’-end of the Archaeoglobus fulgidus
cyclodextrin glucanotransferase gene affects protein expression in
Escherichia coli
Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) is used for catalytic production of cyclodextrins
and various glycosylated products. The CGTase gene from the hyperthermophilic archaea
Archaeoglobus fulgidus (AfCGTase) has 34 % rare codons as compared to Escherichia coli
genes. As an attempt to increase expression in E. coli, AfCGTase was analyzed after changing
rare codons in the beginning of the gene into preferred E. coli codons. Site directed
mutagenesis with three primer pairs was used to exchange a maximum of seven codons in
constructs where either each single primer, the two primers nearest the 5’-end or all three
primers had been used for mutagenesis. These constructs were expressed in BL21(DE3) and
three derivative strains carrying genes for rare codon tRNA:s and/or deletions in the RNaseE
gene (leading to increased RNA-stability). SDS-PAGE and a starch hydrolyzing enzyme
activity assay showed that expression levels were lowered for the mutants in BL21(DE3) and
the tRNA compensating strain. As suggested by activity analysis, expression levels might
have been increased in mutated compared to wild-type CGTases in the strains containing the
RNaseE deletion. The results indicate that secondary structural changes might destabilize the
mutant mRNA:s, leading to decreased expression levels, if RNaseE is active. The higher
expression levels seen for the mutants in the RNaseE deletion strains further underscores the
importance of mRNA secondary structure and stability in recombinant expression.
Further results indicate inclusion body formation upon the high expression aided by the
compensating tRNA:s. Also mistranslational events in the form of N-terminal truncations
were observed. This might have been possible if secondary structural changes exposed the
Shine-Dalgarno-like sequence present eight base pairs upstream to an AUG-codon within the
coding region of mRNA.
Supervisors: Eva Nordberg-Karlsson, Catherine J. Paul
Master Thesis project, 30 credits in Biochemistry, 2009
Department of Biotechnology, LTH, Lund University
